Özlem fiAH‹N
Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi Nöroloji Anabilim Dal› ‹ZM‹R Tlf: 0232 412 40 50/4051 e-posta: dr.ociftcioglu@gmail.com Gelifl Tarihi: 01/01/2010 (Received) Kabul Tarihi: 15/02/2010 (Accepted) ‹letiflim (Correspondance)
1 Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi
Nöroloji Anabilim Dal› ‹ZM‹R
2 Dokuz Eylül Üniversitesi Sa¤l›k Bilimleri Enstitüsü
Sinirbilimleri Anabilim Dal› ‹ZM‹R
3 Dokuz Eylül Üniversitesi Sa¤l›k Bilimleri Enstitüsü
Laboratuvar Hayvanlar› Anabilim Dal› ‹ZM‹R
4 Özlem fiAH‹N1 Ufuk VURGUN2 Osman YILMAZ3 Ataç SÖNMEZ4 Ayfer DAYI4 Görsev YENER1 fiermin GENÇ2 *2009 y›l›
“En iyi araflt›rma” ödülünü kazanm›flt›r.
THERAPEUTIC EFFECT OF ERYTHROPOIETIN IN
AN EXPERIMENTAL IN VIVO ALZHEIMER’S
DISEASE ANIMAL MODEL MODERATED BY
D-GALACTOSE INJECTION AT
OVARIECTOMIZED RATS
D-GALAKTOZ ENJEKS‹YONU ‹LE ‹N V‹VO
OLARAK OLUfiTURULAN DENEYSEL
ALZHE‹MER HAYVAN MODEL‹NDE
ER‹TROPOET‹N‹N TERAPÖT‹K ETK‹S‹*
Ö
ZGirifl: Eritropoietin (Epo), stroke ve parkinsonizm gibi akut ve kronik bir çok santral sinir
sis-temi hastal›¤›n›n hayvan modellerinde koruyucu etkinli¤i gösterilmifl bir moleküldür. In vitro nöral kültürde amiloid beta toksisitesinde koruyucu etki gösteren Epo’nun, bu çal›flmada in vivo Alz-heimer hastal›¤› hayvan modelinde koruyucu etkisi olup olmad›¤› incelenmifltir.
Gereç ve Yöntem: Çal›flmaya al›nan 21 difli rat, kontrol(sham) (n=7), overektomize ve 2 ml
%0.9 izotonik + 20 mg/gün D-galaktoz uygulanan (n=7); overektomize, D-galaktoz uygulamas›na ek olarak 40 mg/kg dozunda haftada 3 kez ‹P Epo enjeksiyonu yap›lan(n=7) olmak üzere 3 gru-ba ayr›lm›flt›r. Epo’nun hastal›k modeli üzerine etkisi, hipokampus ve serebral kortekste asetilkolin esteraz aktivitesi ve Cell death ELISA plus yöntemi apoptozis analizi kullan›larak araflt›r›lm›flt›r.
Bulgular: Asetilkolin esteraz düzeyi, Epo grubunda kontrol grubuna yak›n ve düflük olarak
saptanmakla beraber istatiksel olarak anlaml› bulunmam›flt›r. Ayr›ca apoptozis düzeyi aç›s›ndan her 3 grup aras›nda istatistiksel aç›dan farkl›l›k bulunmam›flt›r.
Sonuç: Epo’nun bu hayvan modelinde nöroprotektif etkisi gösterilemedi. Ancak overektomi
ve D-galaktoz grubunun da incelenen parametreleri kontrolden farkl› de¤ildi. Bu nedenle baflka bir AH hayvan modelinde Epo’nun nöroprotektif etkisi incelenmelidir.
Anahtar Sözcükler: Alzheimer hastal›¤›; Hastal›k hayvan modeli; D-galaktoz; Eritropoietin;
Nöroproteksiyon; Apoptozis.
A
BSTRACTIntroduction: Erythropoietin (Epo) is a molecule which has shown to have neuroprotective
effects on animal models of chronic and acute central nervous system disorders like stroke and parkinsonism. Epo shows neuroprotective effect on amiloid beta toxicity in vitro neuronal cell culture. In this study we searched neuroprotective effect of Epo on in vivo animal model of Alzheimer’s disease.
Materials and Method: In this study female rats divided into 3 grups like control (sham),
ovarectomized and injected 2 ml salin+ 20 mg/day D-galactose, and third grup is injected intraperitoneal 40 mg/kg Epo 3 days per week addition to d-galactose injection. The effects of erythropoietin on the animal model is researched at the hipocampus and cerebral cortex by acetylcholine esterase activity, and apoptosis detection with Cell death ELISA plus kit.
Results: Acetylcholin esterase levels were low in grup Epo is similar to control grup but there
is no statistical difference. And there was no statistical difference in 3 grups results about the apoptosis.
Discussion: Epo was not neuroprotective on this animal model of AD. But we did not find
any difference at any parameter between control and overectomy+D-galactose group. For this reason, neuroprotective effect of Epo should researched other animal model of AD.
Key Words: Alzheimer’s Disease; Disease model animal; D-galactose, Erythropoietin;
Neuroprotection; Apoptosis.
G
‹R‹fiA
lzheimer Hastal›¤› (AH), ileri yafltaki demanslar›n en s›kformudur. Kognitif fonksiyonlarda ilerleyici bozulma ile karakterizedir. Klinik pratikte, AH’n›n kesin kriterlerine ra¤-men tan›s› sekonder nedenlerin ve di¤er demansif hastal›klar›n d›fllanmas› ile konur. Beyin dokusunda çok say›da nöritik plaklar›n ve nörofibriler yumaklar›n bulunmas› ile karakterize progresif ve nörodejeneratif bir hastal›kt›r. Tan›da alt›n stan-dart klinik AH tan›s› alm›fl kiflide ölüm sonras› yap›lacak otopside beyinde tipik nöropatolojik de¤iflikliklerin gözlen-mesidir. Toplumdaki genel ölüm nedenleri s›ralamas›nda dör-düncü s›rada yer almaktad›r. T›ptaki geliflmeler neticesinde ar-tan yaflam süresi ve yafllanan nüfus nedeni ile prevalans› her y›l daha da artmaktad›r. 60-64 yafl aras› prevalans %1 iken, 85 yafl ve üzerinde prevalans› %10-40’lara ulaflmaktad›r. Hasta say›-s›n›n 2047 y›l›nda 8.64 milyona (4.37–15.4 milyon) ulaflmas› beklenmektedir. Bu nedenle AH günümüzde ve gelecekte sa-dece nörodejeneratif bir hastal›k olmaktan da öte ciddi bir sos-yal, ekonomik halk sa¤l›¤› sorunu haline gelmifltir.Son y›llarda deneysel Alzheimer hayvan modelleri üzerine yap›lan çal›flmalar patogenez mekanizmalar›n›n ayd›nlat›lma-s› ve patogeneze yönelik yeni tedavi yöntemleri gelifltirilmesi konusunda önem kazanm›flt›r. Östrojen deprivasyonu ve d-galaktoz enjeksiyonu ile yarat›lan oksidatif stresle difli ratlar-da oluflturulan hayvan modelinde , her iki faktörün sinerjistik bir flekilde AH benzeri histopatolojik görünüm yaratt›¤› ve davran›fl testleri ile benzer bulgular›n elde edildi¤i gösteril-mifltir (1).
Eritropoetin (Epo); sinir sisteminde de varl›¤› gösterilen mekanizmalar› tam olarak saptanamam›fl olmakla beraber nö-roprotektif etkileri gösterilmifl olan hematopoetik bir sitokin-hormondur (2). Son y›llarda beyinde ve nöronal ve glial hücre-lerde kendisinin ve reseptörünün varl›¤› ve çok say›da de¤iflik in vivo ve in vitro nöronal hasar modelinde nöroprotektif et-kinli¤i gösterilmifl olan Eritropoietin (Epo) böyle bir molekül-dür (3-10). Epo’in birçok di¤er nöroprotektif maddeye göre avantaj› uzun y›llard›r anemi endikasyonuyla klinik kullan›m-da olmas› ve kan beyin bariyerini geçebilmesidir. Yeni çal›fl-malarda Epo’in anti-apoptotik, anti-oksidan ve anti-inflama-tuvar etkiler gösterdi¤i bildirilmifltir. Epo’in nöron koruyucu etkilerinin kesin mekanizmas› tam olarak bilinmese de hücre canl›l›¤›n› artt›r›c› yolaklar› uyard›¤›, antiapoptotik proteinle-rin ekspresyonunu artt›rd›¤›, hücre içi kalsiyum metabolizma-s›n› düzenledi¤i, nitrik oksid üretimini azaltt›¤›, glutamat sa-l›n›m›n› bask›lad›¤›, anjiyojenezi ve nörogenezi uyard›¤›, nö-rotrofik faktör sentezini artt›rd›¤›, antiapoptotik, antioksidatif ve anti-inflammatuar etki gösterdi¤i bildirilmifltir (11-15). Ancak bu etkilerinin mekanizmalar› tam olarak
ayd›nlat›lama-m›flt›r . Epo’in beyin dokusunda glutatyon peroksidaz ekspres-yonunu artt›r›c› etkisi ise etanol, hipoksi ve MPTP hasar mo-dellerinde gösterilmifltir. Bu bulgular Epo’in anti-oksidan ve anti-inflamatuvar etkili bu moleküllerin ekspresyonunu eflgü-dümlü olarak uyarabildi¤ini düflündürmektedir.
G
EREÇ VEY
ÖNTEMD
okuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi Hayvan DeneyleriYerel Etik Kurulu’ndan gerekli onay ve izinler al›narak bafllanan çal›flmada 21 adet Sprague Dawley cinsi difli rat kul-lan›lm›flt›r. Ratlar do¤umdan itibaren santral sinir sistemi ge-lifliminin tamamland›¤› 20. haftadan sonra çal›flmaya dahil edilmifltir. Ratlar standart rat yemi ve su ile beslenerek , labo-ratuvar koflullar›nda 12 saat gece 12 saat gündüz fotoperiyodi uygulanm›flt›r. Randomize olarak 3 gruba ayr›lan ratlardan 1. grup olan sham grubuna cerrahi uygulanm›fl ancak ovaryum-lar eksize edilmemifl di¤er 2 gruptaki ratovaryum-lara bilateral overek-tomi yap›lm›flt›r.3 gruba ayr›lan ratlardan overektomi uygulanmayan 1. gruba (sham) efl miktarda izotonik s›v› , 2. ve 3. gruba ise 2 ml %0.9 izotonik + 20 mg D-galaktoz her gün günde bir kez intraperitoneal (ip) olarak 5 hafta boyunca uygulanm›flt›r. 3. gruba D-galaktoz ile birlikte 40 mg/kg dozunda haftada 3 kez ip olarak Eritropoietin enjeksiyonu yap›lm›flt›r (16).
Çal›flma s›ras›nda kontrol ve D-galaktoz grubundan 2 rat, eritropoietin grubundan 1 rat operasyon komplikasyonlar› ve enfeksiyon gibi nedenlerle kaybedilerek çal›flma d›fl›nda b›ra-k›ld›. 5 hafta sonunda 5 adet kontrol, 5 adet overektomize+ d-galaktoz uygulanan, 6 adet overektomize + d-galaktoz+ Epo uygulanan rat deneyi tamamlad›.
Çal›flmada kullan›lan ratlar 5 hafta sonunda 100 mg/kg sodyum tiopental ile sakrifiye edildi. Sakrifiye edilen hayvan-lardan serebral doku örnekleri al›n›rken hipokampus ve sereb-ral kortex ayr› olarak -80 ˚ C’ de dondurularak saklanm›flt›r. Tüm analizler hem hipokampus hem serebral korteks örnek-lerinde ve çift olarak çal›fl›lm›flt›r. Analiz öncesi beyin doku-lar› sonikasyonla parçalanm›flt›r. Protein örneklerinde Asetil kolin esteraz aktivitesi ve apoptoz de¤erlendirilmifltir. Apop-toz için Cell death ELISA plus kiti (Roche, Almanya) kulla-n›lm›flt›r. Kitin talimatlar›na uygun yap›lan analiz gr protein bafl›na absorbans olarak verilmifltir. Asetil Kolin esteraz (Ach E) aktivite ölçümü için Detex X (Arboy Assay, Amerika) kiti kullan›lm›flt›r. Floresan bir yöntem kullanan kit ile kitin tali-matlar›na uygun olarak çal›fl›lm›flt›r. Sonuçlar gr protein ba-fl›na verilmifltir.
‹statistiksel analizlerde SPSS program›n›n 15.0 versiyonu kullan›lm›flt›r. Gruplar aras› anlaml›l›¤›n belirlenmesinde Mann Whitney U testi kullan›lm›flt›r. ‹statistiksel anlaml›l›k için p< 0.05 de¤eri kullan›lm›flt›r.
B
ULGULARA
ch E aktivitesi beyinde gr bafl›na kontrol grubunda 2009.3± 705.0, overektomi + D-galaktoz grubunda 2009.4 ± 177.0, overektomi + Epo grubunda 1976.2 ± 597.0 olarak bu-lunmufltur. Ach E aktivitesi hipokampusta gr bafl›na kontrol grubunda 2765.7 ± 341.9, overektomi + D-galaktoz grubun-da 2801.1 ± 530.9, overektomi + Epo grubungrubun-da 2545.6 ± 211.9 olarak bulunmufltur. Her üç deney grubu Asetil kolin esteraz aktivitesi aç›s›ndan karfl›laflt›r›ld›¤›nda hem serebral kortekste hem hipokampusta tüm gruplar aras›nda istatiksel anlaml›l›kta fark bulunmam›flt›r (fiekil 1A,B).Apoptoz için beyinde gr bafl›na absorbans sonucu, kontrol grubunda 0.137 ± 0.005, overektomi + D-galaktoz grubun-da 0.140 ± 0.004, overektomi + Epo grubungrubun-da 0.141 ±
0.005 olarak bulunmufltur. Hipokampusta gr bafl›na absor-bans kontrol grubunda 0.136 ± 0.006, overektomi + D-ga-laktoz grubunda 0.136 ± 0.009, overektomi + Epo grubunda 0.140 ± 0.008 olarak bulunmufltur. Her üç deney grubu apoptoz aç›s›ndan karfl›laflt›r›ld›¤›nda hem serebral kortekste hem hipokampusta tüm gruplar aras›nda istatiksel anlaml›-l›kta fark bulunmam›flt›r (fiekil 2A,B).
T
ARTIfiMAE
po, pek çok nörolojik hastal›¤›n hayvan modelinde tedaviamac›yla denenmifl ve nöroprotektif etkisi gösterilmifl bir moleküldür (11). AH’n›n patogenezinin bir parças›ndaso-fiekil 1— Serebral kortekste (A) ve Hipokampusta (B) Asetil kolin
este-raz aktivitesi: D-Galaktoz ve overektomi uygulanan grupta Ach E tesinde de¤ifliklik saptanmam›flt›r. Epo uygulanan grubun Ach E aktivi-tesi kontrol grubundan ve D-Galaktoz ve overektomi uygulanan grup-tan farkl› bulunmam›flt›r.
fiekil 2— Serebral kortekste (A) ve Hipokampusta (B) apoptoz:
D-Galak-toz ve overektomi uygulanan grupta apopD-Galak-tozda kontrole göre de¤iflik-lik saptanmam›flt›r. Epo uygulanan grubun apoptoz düzeyi de kontrol grubundan ve D-Galaktoz ve overektomi uygulanan gruptan farkl› bu-lunmam›flt›r.
AchESteraz aktivitesi (μU/ml)
Absorbans
Absorbans
kontrol D-galaktoz D-galaktoz + EPO
kontrol D-galaktoz D-galaktoz + EPO
kontrol D-galaktoz D-galaktoz + EPO kontrol D-galaktoz D-galaktoz
+ EPO
rumlu tutulan amiloid beta nörotoksisitesinde in vitro nöron kültüründe Epo koruyucu etki göstermifltir (17). Bu bulgu-lardan yola ç›karak AH’n›n in vivo hayvan modelinde Epo’nun etkisini incelemeyi amaçlad›k. AH’n›n hayvan mo-delinin seçiminde hastal›¤›n tüm bulgular›n› yans›tabilecek, sporadik AH modeli seçtik. Sporadik AH’n›n in vivo modeli olabilecek üç hayvan modeli sözkonusudur. Bunlar: yüksek kolesterolle besleme, streptozotosin enjeksiyonu, D-galaktoz uygulamas› ile birlikte yada tek bafl›na overektomidir (18). Biz çal›flmam›zda D-galaktoz uygulamas› ile birlikte overek-tomi AH modeli olarak kullan›lm›flt›r. Bu model Hua ve ark taraf›ndan 2006 y›l›nda ilk kez tan›mlanm›flt›r (1). Hua ve ark. Overektomi sonras› 6 hafta D-galaktoz uygulad›klar›n› bildirdiler. Ancak biz çal›flmam›z› araya giren enfeksiyonlar nedeniyle 5 haftada sonland›rmak zorunda kald›k. Bu neden-le overektomi uygulamas› AH’n›n hayvan modelinde ilk seçe-nek olmamal›d›r.
AH hayvan modellerinde hastal›¤›n bir göstergesi olarak kolinerjik nöron kayb› söz konusudur. Kolinerjik nöron kay-b›n› göstermek için AchE ve Kolin asetil transferaz antikorla-r› ile immunohistokimya ve biyokimyasal yöntemlerle AchE aktivitesini de¤erlendirilmektedir (1). Çal›flmam›zda koliner-jik nöron kayb›n› de¤erlendirmek amac›yla biyokimyasal flo-resan bir yöntemle AchE aktivitesini de¤erlendirdik. AH’n›n hayvan modelinde AchE aktivitesinde azalma beklenir (1,18). Çal›flmam›zda ne beyinde ne de hipokampusta AchE sinde azalma saptanamam›flt›r. Bunun nedeni AchE aktivite-sinin de¤erlendirilmesinde beyinden protein eldesinde nöron harici hücrelerinde varl›¤› olabilir. Bu bizim AchE aktivite-sindeki de¤iflikli¤i tespit edememizin bir nedeni olabilir. Bu nedenle immunohistokimya yöntemiyle AchE düzeyinin be-lirlenmesi hücresel de¤ifliklikleri daha iyi ay›rt etmemizi sa¤-layabilir. Ayn› modeli kullanan bir çal›flmada hipokampusta AchE aktivitesinde azalma saptanm›flt›r. Ancak yine bu çal›fl-mada kullan›lan yöntem bizim kulland›¤›m›z yönteme benzer olmakla birlikte ayn› de¤ildir. Bizim kulland›¤›m›z kit flore-san deteksiyon yapar iken, di¤er çal›flmadaki kit kolorimetrik deteksiyon yapmaktad›r (19).
Çal›flmam›zda de¤erlendirdi¤imiz parametre apoptozdur. Nörodejeneratif hastal›klarda nöronal ölümün en bilinen for-mudur. Çal›flmam›zda ne beyin örneklerinde ne de hipokam-pus örneklerinde kontrole göre apoptoz art›fl› gösterilememifl-tir. Bunun nedeni apoptoz de¤erlendirilmesinde beyinden protein eldesinde nöron harici hücrelerinde varl›¤› olabilir. Bu bizim apoptoz de¤iflikli¤i tespit edememizin bir nedeni olabilir. Bu nedenle immunohistokimya yöntemiyle apopto-zun belirlenmesi hücresel de¤ifliklikleri daha iyi ay›rt etme-mizi sa¤layabilir.
Çal›flmam›zda D-galaktoz ve overektomi ile oluflturulan AH hayvan modelinde Epo’nun etkisinin incelenmesi amaç-lanm›flt›. galaktoz + overektomi +Epo uygulanan grup, D-galaktoz ve overektomi uygulanan gruba göre AchE aktivite-sinde ve apoptoz göstergeaktivite-sinde bir fark göstermemifltir. So-nuçlar›m›z Epo’nun bu modelde nöroprotektif olmad›¤›n› göstermektedir. Ancak modelde gözlenen enfeksiyon gibi so-runlar bu sonucun do¤mas›nda etkili olabilir. Bu nedenle Epo’nun baflka bir AH hayvan modelinde etkisini inceleyen çal›flmalar yap›lmas› gereklidir.
K
AYNAKLAR1. Hua X, Lei M, Zhang Y, et al. Long-term D-galactose
injecti-on combined with ovariectomy serves as a new rodent model for Alzheimer’s disease. Life Sci 2007 Apr 24;80(20):1897-905.
2. Dame C. Juui SE. Christensen RD. The biology of
erythropo-ietin in the central nervous system and its neurotrop-hic and neuroprotective potential. Biol Neonate 2001; 79(3-4):228-35.
3. Bernaudin M, Marti HH, Roussel S, et al. A potential role for
erythropo-ietinin focal permanent cerebral ischemia in mice. J CerebBlood Flow and Metab 1999; 19(6):643-51.
4. Brines ML, Ghezzi P, Keenan S, et al. Erythropoietin crosses
the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury. Proc Nutl Acad Sci USA 2000; 97(19):10526-31.
5. Buemi M, Grasso G. Corica F, et al. In vivo evidence that
eryt-hropoietinhas a neuroprotective effect during subarachnoid he-morrhage.Eur J Pharmacol 2000;392(l-2):31-4.
6. Calapai G, Marciano MC. Corica F, et al. Erythropoietin
pro-tects against brain ischemic injury by inhibition of nitric oxi-de fonnation. Eur J Pharmacol 2000; 401(3):349-56.
7. Genc S, Kuralay F, Gene K, et al. Erythropoietin exerts
neu-roprotection in l-methyl-4-phenyl-l, 2.3. 6-tetrahydropyridi-ne-treated C57/BL mice via increasing nitric oxide production. Neurosci Lett 2001; 298(2):139-41.
8. Sadamoto Y, Igase K, Sakanaka M, et al. Erythropoietin
pre-vents place navigation disability and cortical infarction in rats with permanent occlusion of the middle cerebral artery. Bioc-hem Biophys Res Commun 1998; 253(1):26-32.
9. Sakanaka M, Wen TC, Matsuda S, et al. In vivo evidence that
erythropoietin protects neurons f rom ischemic damage. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95(8):4635-40.
10. Siren AL, Fratelli M, Brines M, et al. Erythropoietin prevents
neuronal apopiosis after cerebral ischemia and metabolic stress. Proc Natl Acad Sci USA 2001:98(7):4044-49.
11. Genc S, Koroglu TF, Genc K. Erythropoietin and the nervous
system. Brain Res 2004;1000:19–31.
12. Maiese K, Li F, Chong ZZ. New avenues of exploration for
13. Maiese K, Li F, Chong ZZ. Erythropoietin in the brain: can the promise to protect be fulfilled? Trends Pharmacol Sci 2004;25:577-83.
14. Viviani B, Bartesaghi S, Corsini E, et al. Erythropoietin
pro-tects primary hippocampal neurons increasing the expression of brain-derived neurotrophic factor. J Neurochem 2005;93:412-21.
15. Wang L, Zhang Z, Wang Y, Zhang R, Chopp M. Treatment
of stroke with erythropoietin enhances neurogenesis and angi-ogenesis and improves neurological function in rats. Stroke 2004;35:1732-7.
16. Bianchi R, Buyukakilli B, Brines M, et al. Erythropoietin both
protects from and reverses experimental diabetic neuropathy. P.Proc Natl Acad Sci U S A 2004 Jan 20;101(3):823-8.
17. Chong ZZ, Li F, Maiese K. Erythropoietin requires
NF-kap-paB and its nuclear translocation to prevent early and late apoptotic neuronal injury during beta-amyloid toxicity. Curr Neurovasc Res 2005 Dec;2(5):387-99.
18. Woodruff-Pak DS. Animal models of Alzheimer’s disease:
the-rapeutic implications. J Alzheimers Dis. 2008 Dec;15(4):507-21.
19. Hua X, Lei M, Ding J, Han Q, Hu G, Xiao M. Pathological
and biochemical alterations of astrocytes in ovariectomized rats injected with D-galactose: a potential contribution to Alzhei-mer’s disease processes. Exp Neurol 2008 Apr;210(2):709-18.
