T.C.
SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
ORTA TOROSLAR YÖRESĠNDE GELENEKSEL YÖNTEMLERLE ÜRETĠLEN DERĠ TULUM PEYNĠRLERĠNĠN OLGUNLAġMA PERĠYODU
BOYUNCA MĠKROBĠYAL KOMPOZĠSYONLARININ BELĠRLENMESĠ
Talha DEMĠRCĠ DOKTORA TEZĠ
GIDA MÜHENDĠSLĠĞĠ ANABĠLĠM DALI
HAZĠRAN-2019 KONYA Her Hakkı Saklıdır
TEZ KABUL VE ONAYI
Talha DEMĠRCĠ tarafından hazırlanan “Orta Toroslar Yöresinde Geleneksel Yöntemlerle Üretilen Deri Tulum Peynirlerinin OlgunlaĢma Periyodu Boyunca Mikrobiyal Kompozisyonlarının Belirlenmesi” adlı tez çalıĢması 21/06/2019 tarihinde aĢağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda
Mühendisliği Anabilim Dalı‟nda DOKTORA TEZĠ olarak kabul edilmiĢtir.
Jüri Üyeleri Ġmza
BaĢkan
Unvanı Adı SOYADI ………..
DanıĢman
Unvanı Adı SOYADI ………..
Üye
Unvanı Adı SOYADI ………..
Üye
Unvanı Adı SOYADI ………..
Üye
Unvanı Adı SOYADI ………..
Yukarıdaki sonucu onaylarım.
Prof. Dr. ……. …….. FBE Müdürü
TEZ BĠLDĠRĠMĠ
Bu tezdeki bütün bilgilerin etik davranıĢ ve akademik kurallar çerçevesinde elde edildiğini ve tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalıĢmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm.
DECLARATION PAGE
I hereby declare that all information in this document has been obtained and presented in accordance with academic rules and ethical conduct. I also declare that, as required by these rules and conduct, I have fully cited and referenced all material and results that are not original to this work.
Talha DEMĠRCĠ
iv
ÖZET DOKTORA TEZĠ
Orta Toroslar Yöresinde Geleneksel Yöntemlerle Üretilen Deri Tulum Peynirlerinin OlgunlaĢma Periyodu Boyunca Mikrobiyal Kompozisyonlarının
Belirlenmesi
Talha DEMĠRCĠ
Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı DanıĢman: Prof. Dr. Nihat AKIN
2019, 139 Sayfa Jüri
Prof. Dr. Nihat AKIN Prof. Dr. AyĢe GÜRSOY Prof. Dr. Cemalettin SARIÇOBAN
Dr. Öğr. Üyesi DurmuĢ SERT Dr. Öğr. Üyesi Birsen BULUT SOLAK
Bu tez çalıĢmasında Orta Toroslar bölgesinde geleneksel yollarla üretilen deri Tulum peynirlerinin 180 günlük olgunlaĢma periyodu süresince kimyasal özelliklerinin, bakteriyal kompozisyonlarının değiĢimi izlenmiĢtir. ÇalıĢmanın amacı, Orta Toroslar yöresi peynirlerine has mikroflora ve aroma bileĢenlerini tespit etmek, bunların olgunlaĢma boyunca değiĢimlerini ortaya koyup ileri aĢamalarda bu peynirler için florada tespit edilen bakterilerden starter denemeleri yapılabilmesine temel oluĢturmaktır. Bu amaç doğrultusunda kültüre-bağlı ve kültürden-bağımsız (PCR-DGGE) yöntemlerle bakteriyal flora olgunlaĢma boyunca takip edilmiĢtir. Kültüre-bağlı yöntemle yapılan analizlerde Anamur, Mut, Karaman ve Ereğli yörelerinde Enterococcus suĢları, özelinde de Enterococcus
faecium türüne ait suĢların baskın olduğu tespit edilmiĢtir. Kültüre-bağlı yöntemle yapılan analizler
sonucunda toplam 1365 adet bakteri saflaĢtırılmıĢ ve bunların 432 adeti tanımlanmıĢtır. Kültürden-bağımsız yöntemle yapılan analizlerde ise Enterococcus ve Streptococcus cinsine ait türlerin en fazla bulunan türler olduğu görülmüĢtür. Kültüre bağlı yöntemde toplam 13 farklı laktik asit bakterisi tespit edilirken, kültürden-bağımsız yöntemde 20 farklı laktik asit bakterisi türü saptanmıĢtır. Tez çıktısı olarak elde edilen saf laktik kültürler ve bilgilerin önemli bir kültürel miras olan Orta Toroslar yöresi deri Tulum peynirlerinin korunması ve devamının sağlanmasına katkıda bulunması ve bu konuda yapılacak ileri araĢtırmalara temel teĢkil etmesi umulmaktadır.
v
ABSTRACT Ph.D THESIS
DETERMINATION OF MICROBIAL COMPOSITION OF SKIN BAG TULUM CHEESES PRODUCED IN TRADITIONAL WAYS IN CENTRAL TAURUS
REGION Talha DEMĠRCĠ
THE GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE OF SELÇUK UNIVERSITY
THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY IN FOOD ENGINEERING
Advisor: Prof. Dr. Nihat AKIN 2019, 139 Pages
Jury
Advisor Prof. Dr. Nihat AKIN Prof. Dr. AyĢe GÜRSOY Prof. Dr. Cemalettin SARIÇOBAN
Assist. Prof. Dr. DurmuĢ SERT Assist. Prof. Dr. Birsen BULUT SOLAK
Within the scope of this project, changes in chemical properties and bacterial compositions of skin Tulum cheeses produced in traditional ways in Central Taurus region have been observed during 180 days maturation period. The purpose of the study is to identify microflora unique to Central Taurus regional cheeses, to demonstrate their changes during maturation and to base starter experiments from bacteria detected in these cheeses in advanced stages for this cheese type. For this purpose, bacterial flora was followed during maturation by culture-dependent and culture-independent (PCR-DGGE) methods. It has been determined that strains belonging to Enterococcus, especially Enterococcus faecium strains, are dominant in the Anamur, Mut, Karaman and Ereğli regions in the analyzes made by culture-dependent methods. A total of 1365 bacteria have been purified and 432 of them have been identified as a result of the culture-dependent analysis. In culture-independent analyzes, it was found that the species belonging to the genus Enterococcus and Streptococcus were the most common species. A total of 13 different lactic acid bacteria were detected in culture-dependent method, while 20 different lactic acid bacteria strains were determined in culture-independent method. It is hoped that the pure lactic cultures and information obtained as a project output contribute to the preservation and maintenance of the Central Taurus regional skin-tender cheese, an important cultural heritage, and to be the basis for further research in this regard.
vi
ÖNSÖZ
Tez çalıĢmamın her aĢamasında bilgi ve tecrübesi ile bana yol gösteren, karĢılaĢtığım zorluklarda yardımını esirgemeyen değerli danıĢman hocam Sayın Prof. Dr. Nihat AKIN‟a, tezimin de içerisinden ortaya çıktığı 214Z054 numaralı projeyi destekleyen TÜBĠTAK TOAG‟a, proje kapsamında birlikte çalıĢtığımız ve laboratuvar çalıĢmalarında yardımlarını gördüğüm ArĢ. Gör. Didem SÖZERĠ ATĠK, Gıda Yük. Mühendisi Edibe Rabia ÖZKAN, ArĢ. Gör. Hale Ġnci ÖZTÜRK NEGĠġ, Dr. Öğr. Üyesi Kübra AKTAġ, Öğr. Gör. Dr. Aysun ORAÇ, Öğr. Gör. Dr. Çiğdem KONAK GÖKTEPE, Gıda Yük. Mühendisi Erhan KAZANCIGĠL ve Gıda Müh. Gizem ÇAM‟a teĢekkürü borç bilirim. Kendi laboratuvar imkanlarını, bilgi ve tecrübelerini çalıĢmamın her aĢamasında sunan Prof. Dr. Erdoğan EĢref HAKKI, Dr. Öğr. Üyesi Mohd Kamran KHAN, Dr. Öğr. Üyesi Anamika PANDEY ve Moleküler Biyolog Fatma AKIN‟a, ortaya çıkan aksaklıkları çözmemde yol gösterici olan Doç. Dr. Ömer ġĠMġEK‟e ve her zaman desteklerini hissettiğim, tüm öğrenim hayatım süresince hep yanımda olan aileme ve manevi desteğini benden esirgemeyen değerli eĢim Sümeyye DEMĠRCĠ‟ye en içten teĢekkürlerimi sunarım.
Talha DEMĠRCĠ KONYA-2019
vii ĠÇĠNDEKĠLER ÖZET ... iv ABSTRACT ... v ÖNSÖZ ... vi ĠÇĠNDEKĠLER ... vii SĠMGELER VE KISALTMALAR ... ix TABLOLAR DĠZĠNĠ ... x ġEKĠLLER DĠZĠNĠ ... xi 1. GĠRĠġ ... 1 2. KAYNAK ARAġTIRMASI ... 4
2.1. Tulum Peyniri Tanımı ve Üretimi ... 4
2.2. Laktik Asit Bakterileri ... 6
2.3. Tulum Peynirlerinin Laktik Asit Bakterisi Florası ... 8
2.4. Laktik Asit Bakterilerinin Peynirde Aroma OluĢturması ... 11
2.5. Bakterilerin Tanımlanmasında Kullanılan Güncel Genotipik Yöntemler ... 13
2.6. Peynirdeki Mikrobiyal Flora Tespiti için DGGE Uygulamaları ... 15
3. MATERYAL VE YÖNTEM ... 17
3.1. Örneklerin Toplanması ve Karakteristikleri ... 17
3.2. Mikroorganizmalar ve Kültür ġartları ... 17
3.3. Ġzole Edilen Bakterilerin Morfolojik, Fizyolojik ve Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi ... 18
3.4. Kültüre EdilmiĢ Bakterilerden DNA Ekstraksiyonu ... 18
3.5. Peynir Örneklerinden Toplam DNA Ekstraksiyonu ... 19
3.6. PCR Amplifikasyonu ve DGGE KoĢulları ... 19
3.7. DGGE Bantlarının Tanımlanması ... 20
3.8. Kimyasal Analizler ... 21
4. ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA ... 22
4.1. Kimyasal Analiz Sonuçları ve TartıĢma ... 22
4.1.1. pH ... 22 4.1.2. Titrasyon asitliği ... 24 4.1.3. Kuru madde ... 26 4.1.4. Yağ ... 27 4.1.5. Protein ... 29 4.1.6. Tuz ... 30
viii
4.2. Kültüre-Bağlı Yöntemle OlgunlaĢma Periyodunda Bakteriyal Dinamik Sonuçları
ve TartıĢma ... 32
4.2.1. Kültüre bağlı yöntemle olgunlaĢma periyodunda izole edilip tanımlaman suĢlar ... 32
4.2.2. Anamur yöresi peynirlerinin olgunlaĢma boyunca kültüre-bağlı yöntemle belirlenen bakteriyal dinamiği ... 64
4.2.3. Mut yöresi peynirlerinin olgunlaĢma boyunca kültüre-bağlı yöntemle belirlenen bakteriyal dinamiği ... 66
4.2.4. Karaman yöresi peynirlerinin olgunlaĢma boyunca kültüre-bağlı yöntemle belirlenen bakteriyal dinamiği ... 69
4.2.5. Ereğli yöresi peynirlerinin olgunlaĢma boyunca kültüre-bağlı yöntemle belirlenen bakteriyal dinamiği ... 71
4.3. Kültürden-Bağımsız Yöntemle OlgunlaĢma Boyunca Bakteriyal Dinamik Sonuçları ve TartıĢma ... 104
4.3.1. Anamur yöresi peynirlerinin kültürden-bağımsız yöntemle (PCR-DGGE) olgunlaĢma boyunca bakteriyal dinamiği ... 104
4.3.2. Mut yöresi peynirlerinin kültürden-bağımsız yöntemle (PCR-DGGE) olgunlaĢma boyunca bakteriyal dinamiği ... 104
4.3.3. Karaman yöresi peynirlerinin kültürden-bağımsız yöntemle (PCR-DGGE) olgunlaĢma boyunca bakteriyal dinamiği ... 104
4.3.4. Ereğli yöresi peynirlerinin kültürden-bağımsız yöntemle (PCR-DGGE) olgunlaĢma boyunca bakteriyal dinamiği ... 105
4.4. Tüm Yöre Peynirlerinin Bakteriyal Dinamiğinin Belirlenmesinde Metotlar Arası Farklılıklar ve TartıĢma ... 119
5. SONUÇLAR VE ÖNERĠLER ... 126
5.1 Sonuçlar ... 126
5.2 Öneriler ... 129
ix SĠMGELER VE KISALTMALAR Simgeler β : Beta g : Gram g : Dakika dönüĢ hızı μl : Mikrolitre ml : Mililitre mg : Miligram M : Molar V : Volt Kısaltmalar
BLAST: Basic local alignment search tool(s)
CO2 : Karbondioksit
DGGE: Denaturing gradient gel electrophoresis
DNA : Deoksiribo nükleik asit
E. : Enterococcus
F365 : Forward 365
FISH : Floresans ın situ hibridizasyon
H2O2 : Hidrojen peroksit
kb : Kilo baz
kob : Koloni oluĢturan birim
LA : Laktik asit
LAB : Laktik asit bakterisi
L. : Lactobacillus
Lc. : Lactococcus
LM17 : Laktoz M17
MgCl2 : Magnezyum klorür
MRSV: MRS vankomisin
NaCl : Sodyum klorür
PCA : Plate count agar
PCR : Polymerase chain reaction
PDO : Protected designation of origin
PTS : Phospho transferase system
R1064 : Reverse 1064
SOLAB: Starter olmayan laktik asit bakterisi
S. : Streptococcus
spp : Türler
subsp. : Alt türler
SSCP : Single strand conformation polymorphism
TAE : Tris asetat
x
TABLOLAR DĠZĠNĠ
Tablo 1. Türkiyede üretilen belli baĢlı mahalli tulum peynirleri ... 5 Tablo 2. Hedef mikroorganizma grupları ve inkübasyon Ģartları ... 18 Tablo 3. Farklı yörelerden toplanan peynir örneklerinin depolama süresince pH
değerlerinin karĢılaĢtırılması ... 22 Tablo 4. Farklı yörelerden toplanan peynir örneklerinin depolama süresince titrasyon asitliği (%) değerlerinin karĢılaĢtırılması ... 24 Tablo 5. Farklı yörelerden toplanan peynir örneklerinin depolama süresince kuru madde (%) içeriğinin karĢılaĢtırılması ... 26 Tablo 6. Farklı yörelerden toplanan peynir örneklerinin depolama süresince yağ (%) içeriğinin karĢılaĢtırılması ... 28 Tablo 7. Farklı yörelerden toplanan peynir örneklerinin depolama süresince protein (%) içeriğinin karĢılaĢtırılması ... 29 Tablo 8. Farklı yörelerden toplanan peynir örneklerinin depolama süresince tuz (%) değerlerinin karĢılaĢtırılması ... 30 Tablo 9. Kültüre Bağlı Yöntemle OlgunlaĢma Süresince Ġzole Edilip Tanımlaman SuĢlar ... 29 Tablo 10. Anamur yöresi peynirlerinden kültüre-bağlı yöntemle izole edilen bakterilerin depolama süresince değiĢimleri (suĢ bazında) ... 75 Tablo 11. Mut yöresi peynirlerinden kültüre-bağlı yöntemle izole edilen bakterilerin depolama süresince değiĢimleri (suĢ bazında) ... 78 Tablo 12. Karaman yöresi peynirlerinden kültüre-bağlı yöntemle izole edilen
bakterilerin depolama süresince değiĢimleri (suĢ bazında) ... 82 Tablo 13. Ereğli yöresi peynirlerinden kültüre-bağlı yöntemle izole edilen bakterilerin depolama süresince değiĢimleri (suĢ bazında). ... 87 Tablo 14. Anamur yöresi peynirlerinden kültüre-bağlı yöntemle izole edilen bakterilerin depolama süresince değiĢimleri (tür bazında) ... 94 Tablo 15. Mut yöresi peynirlerinden kültüre-bağlı yöntemle izole edilen bakterilerin depolama süresince değiĢimleri (tür bazında) ... 95 Tablo 16. Karaman yöresi peynirlerinden kültüre-bağlı yöntemle izole edilen
bakterilerin depolama süresince değiĢimleri (tür bazında) ... 96 Tablo 17. Ereğli yöresi peynirlerinden kültüre-bağlı yöntemle izole edilen bakterilerin depolama süresince değiĢimleri (tür bazında) ... 97 Tablo 18. Anamur yöresi peynirlerden kültüre-bağlı yöntemle izole edilen bakterilerin depolama süresince değiĢimleri (cins bazında) ... 99 Tablo 19. Mut yöresi peynirlerden kültüre-bağlı yöntemle izole edilen bakterilerin depolama süresince değiĢimleri (cins bazında) ... 99 Tablo 20. Karaman yöresi peynirlerden kültüre-bağlı yöntemle izole edilen bakterilerin depolama süresince değiĢimleri (cins bazında) ... 100 Tablo 21. Ereğli yöresi peynirlerden kültüre-bağlı yöntemle izole edilen bakterilerin depolama süresince değiĢimleri (cins bazında) ... 101
xi
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ
ġekil 1. Anamur yöresi peynirlerinin kültüre-bağlı yöntemle olgunlaĢma süresince belirlenen bakteriyal dinamiği ... 66 ġekil 2. Mut Yöresi peynirlerinin kültüre-bağlı yöntemle olgunlaĢma süresince
belirlenen bakteriyal dinamiği ... 68 ġekil 3. Karaman yöresi peynirlerinin kültüre-bağlı yöntemle olgunlaĢma süresince belirlenen bakteriyal dinamiği ... 71 ġekil 4. Ereğli yöresi peynirlerinin kültüre-bağlı yöntemle olgunlaĢma süresince
belirlenen bakteriyal dinamiği ... 74 ġekil 5. Tüm yöre peynirlerinde kültürden-bağımsız yöntemle olgunlaĢma boyunca yapılan bakteriyal dinamik analizlerinin DGGE görüntüleri* ... 106
1
1. GĠRĠġ
Çok sayıda peynir çeĢidinin bulunduğu ülkemizde Tulum peyniri, Beyaz peynir ve KaĢar peynirinden sonra en çok üretilen peynir çeĢidi olup, yüksek bir ekonomik değere sahiptir (Çakmakçı, 2008). Telemenin ufalanıp, tuzlandıktan sonra Tulumlara basılması ve belli bir süre olgunlaĢması sonucu elde edilen peynir olarak tanımlanan Tulum peyniri beyaz ve krem renkte, yüksek yağlı, kolay dağılmayan, yarı sert/sert, homojen tekstürde ve uzun süre olgunlaĢmanın oluĢturduğu asidik bir tatta bir peynir çeĢidi olarak bilinmektedir (Kurt ve ark., 1991). Sütün dayanıklılığını arttırmak için Türklerin Orta Asya'dan günümüze kadar peyniri keçi ya da koyun Tulumlarına (derilerine) basmaları sonucu elde edilen bir peynir olan Tulum peyniri üretildiği dağlık bölgelerde sütün muhafazasını ve değerlendirilmesini sağladığı gibi yüksek besin değeri ile üreticisine ciddi bir ekonomik getiri de sağlamaktadır (Durlu-Özkaya ve Gün, 2007). Popülerliğinin giderek arttığı bilinen Tulum peynirinin üretiminde halen daha standart bir teknik uygulanmamaktadır (Sert, 2011). Genellikle dağlık bölgelerde ve küçük aile iĢletmelerinde veya ilkel mandıralarda geleneksel metotlarla üretildiği bilinen Tulum peyniri üretimi sütün bol olduğu Mart-Temmuz aylarında artmaktadır (Akın, 2002). Geleneksel Ģekliyle çok meĢakkatli bir üretim süreci olan Tulum peyniri için gıda güvenliği içerisinde standart bir proses ile üretime geçilmesi önem arz etmektedir.
Geleneksel Tulum peyniri genellikle ülkemizde üretildiği Ģehre göre farklı isimlerle anılmaktadır. Erzincan bölgesinde üretilen ġavak veya Erzincan en meĢhur Tulum peyniri olarak bilinirken, Çimi Tulum peyniri (Antalya), Afyon Tulum peyniri (Afyon), Kargı Tulum peyniri (Çankırı, Çorum), Isparta Tulum peyniri (Isparta) ve Ġzmir (salamuralı) Tulum peyniri gibi Tulum peynirleri de bilinen ve sık tüketilen Tulum peynirleridir. Orta Toroslar Bölgesinde ise özellikle göçebe yörükler tarafından sıklıkla tüketilen Divle Tulum peyniri (Karaman) ve Selçuklu Tulum peyniri (Konya, Aksaray, NevĢehir) gibi peynirler de popüler Tulum peynirleri arasındadır (Cakir ve ark., 2016).
Geleneksel peynirler kültürel bir miras ve bu lezzeti oluĢturan mikroorganizmalar mikrobiyal gen kaynağı olarak kabul edilir. Bu peynirlerle ilgili deneysel çalıĢmalarla elde edilen bilgilerin kuĢaktan kuĢağa geçmesi çok önemlidir. Her bir geleneksel peynir, üretildiği orijinal ülkeye ve bölgesel iklim Ģartlarına bağlı olarak değiĢiklik gösterir. Ġklim Ģartlarının süt üretiminde kullanılan hayvanların türlerinin (koyun, keçi, inek) belirlenmesinde hem
2
doğrudan hem de bitki florasını etkilemek suretiyle dolaylı olarak etkili olduğu bilinmektedir (Anonim, 2018).
Hayvanların otlatıldığı ortamdaki bitki florası elde edilen sütün duyusal özelliklerini belirleyerek bundan elde edilen peynirin duyusal özelliklerini de etkileyecektir. Bu etkilenme özellikle çiğ sütten yapılan peynirlerin lezzeti üzerinde belirleyici rol oynamaktadır. Akdeniz bölgesinde yaz mevsimi sıcak ve kuru geçmekte, arazi ise küçük ve tepelik kayalıklardan oluĢmaktadır. Dolayısı ile bu bölge Ģartları altında büyükbaĢ hayvan yetiĢtiriciliği yapmak zordur. Bu nedenle daha çok koyun ve keçi yetiĢtiriciliği yapılmaktadır. Bu tür hayvancılık da ya göçerler ya da yarı göçerler tarafından doğal meralar ve çalılık arazilerde yapılmaktadır. Bu tür hayvanların laktasyon periyodunun kısa olması, süt üretiminin sezona bağlılık göstermesine neden olmaktadır. Bu tür sütlerden üretilen peynir gereksiniminin yüksek olması sebebiyle kullanılan farklı hayvanların sütlerine inek sütü karıĢtırılabilmektedir (Anonim, 2018).
Tulum peyniri gibi geleneksel peynirler farklı hayvan çeĢitlerinin sütleri (örneğin inek ve koyun sütleri karıĢtırılarak kullanılabilir) kullanılarak üretildiğinden lezzeti ve yapısı önemli farklılıklar göstermektedir. Bu bölgelerde ortam sıcaklığının gündüzleri yüksek olması ve elektrik bulunmaması sütün kalitesini muhafaza etmeyi önlemektedir. Bölgenin yerleĢim yerlerinden uzak olması sütün taĢınmasını zorlaĢtırmakta ve üretim maliyetini etkilemektedir. Bu nedenle, elde edilen sütün üretildiği yerde peynire iĢlenmesi zorunlu hale gelmektedir. Doğal olarak, bu bölgelerde uzun yıllardan beri geleneksel peynirlerin üretiminde o bölgeye has yerli hayvan (koyun ve keçi) türlerinin sütlerinin kullanılması ürünün karakteristiklerinin korunması açısından önemlidir. Kültürel bir miras olan geleneksel Tulum peynirinin yukarıda belirtilen Ģartlarındaki değiĢiklikler ürünün özelliklerinde de önemli değiĢikliklerin ortaya çıkmasına neden olabilmektedir. Bu çalıĢmada Orta Toroslar yöresinde geleneksel yollarla üretilen deri Tulum peynirlerinin mikrobiyal karakteristikleri belirlenerek önemli bir kültürel mirasın korunmasına ve devamının sağlanmasına katkı sağlanması amaçlanmıĢtır (Anonim, 2018).
Bunun yanında yeni kültürlerin ortaya çıkarılması; beslenme düzeninde ve gıda portföyünde hali hazırda neredeyse hazır/fast-food gıdalar haricinde gıda bulunmayan geliĢmiĢ ülkelerden ziyade, geleneksel gıdalarla beslenmeye devam edilen geliĢmekte olan ülkeler ve az geliĢmiĢ ülkeler tarafından devam ettirilmektedir. Fakat halen gıda sanayiinde
3
kullanılan laktik kültürlerin hemen hemen tamamının yurt dıĢından ithal ediliyor olması, kendi geleneksel ürünlerimizden izole edilen laktik asit bakterilerinin de çoğunlukla atıl vaziyette kalması, teknolojik ve fonksiyonel özelliklerinin saptanıp gıda endüstrisinin kullanımına sunulamaması gözlemlenen bir eksikliktir. Geleneksel gıda üretim ve tüketiminin çok azaldığı endüstrileĢmiĢ ülkelerde, yeni suĢların tanımlanma ve kullanılma olasılığı Türkiye gibi geleneksel gıda üretiminin yaygın olduğu ülkelere nazaran oldukça azdır. Dolayısıyla ülkemiz endüstriyel ölçekte kullanılabilecek mikroorganizmalar için ciddi bir kaynak olarak görülmektedir. Dünyanın çeĢitli ülkelerinde, çoğunlukla Asya kıtası ülkelerinde, araĢtırmacılar geleneksel olarak tüketilen ürünlerden izole ettikleri ve çeĢitli özelliklerini inceledikleri laktik asit bakterileri ile ilgili araĢtırmalar yapmaya devam etmekte ve çalıĢmaların sonuçlarına göre gerek starter kültür önererek gerekse asitliğin ilerlemesine fayda sağlayan ve fonksiyonel katkılar yapan starter olmayan bakteriler (SOLAB) önererek gıda endüstrisine katkı yapmayı sürdürmektedir. Bu yolla hem geleneksel ve yöresel gıdalarının uluslararası tanınırlığı sağlanmakta hem de yeni kültürlerin keĢfedilip kullanıma sunulmasının zorlaĢtığı gıda endüstrisine katkıda bulunulmaktadır. Orta Toroslar yöresinde geleneksel yöntemlerle üretilen deri Tulum peynirlerinden olgunlaĢma süresince izole edilen çok sayıda laktik asit bakterisinin zamanla tüm özellikleri belirlenerek bu kaynağa önemli bir katkıda bulunacağı düĢünülmüĢtür.
Özetle bu araĢtırmayla Orta Toroslar yöresinde 4 farklı lokasyonda (Anamur, Mut, Ereğli ve Karaman) geleneksel yöntemlerle üretilen deri Tulum peynirlerinin 180 günlük olgunlaĢma periyodu boyunca bakteriyal kompozisyonunun kültüre-bağlı ve kültürden-bağımsız yöntemlerle belirlenmesi, buna paralel olarak aynı periyotlarda fizikokimyasal özelliklerinin de belirlenmesi amaçlanmıĢtır ve bunun yanında kültüre-bağlı yöntemle mikroflora belirlenirken bu yörelere ait çok sayıda saf kültür elde edilmesi de amaçlar arasında yer almıĢtır.
4
2. KAYNAK ARAġTIRMASI
2.1. Tulum Peyniri Tanımı ve Üretimi
Peynir; starter kültür ilave edilmiĢ ya da edilmemiĢ sütün peynir mayası veya organik asitler kullanılarak pıhtılaĢtırılması ve oluĢan pıhtının parçalanmasıyla peynir altı suyunun ayrılması ve pıhtıda kalan fazla suyun uzaklaĢtırılması için pıhtının preslenmesi, ardından Ģekil verilmesi ve tuzlanması ile elde edilen bir süt ürünüdür. Kendine özgü tat, koku ve yapıya sahip olan peynir, çeĢidine göre taze veya olgunlaĢtırılmıĢ (3 hafta-2 yıl arasında) olarak tüketilir (Akın, 2010).
YaklaĢık 5000 yıldır çeĢitli Ģekillerde üretilen peynirin dünyada 1000‟den fazla çeĢidi bulunmakta ve bunların yaklaĢık 150 tanesi Türkiye‟de üretilmektedir (Akın, 2010). Türkiye‟de en yaygın olarak üretilen peynirler beyaz peynir, kaĢar peyniri, Tulum peyniri ve çeĢitli eritme peyniri tipleridir. Tulum peyniri süt naklinin zor olduğu ve diğer tip peynirlerin üretilemediği bölgelerde, genellikle geleneksel yöntemlerle yapılmaktadır. Tulum peyniri üretiminde çoğunlukla koyun ve keçi sütleri tercih edilmektedir. Son yıllarda Tulum peynirine olan talebin artması nedeniyle üretimde inek sütü de kullanılmaya baĢlanmıĢtır. Peynir yapımında kullanılan sütün çeĢit ve bileĢiminin bölgelere göre farklı olması piyasada çok farklı özelliklerde Tulum peyniri bulunmasına yol açmaktadır (KeleĢ, 1995).
Tulum peyniri yaygın olarak çiğ sütten geleneksel yöntemlerle üretilir. Bu peynirin üretiminde çiğ sütün sıcaklığı 30°C civarına ayarlanır. Sonra kuzu veya oğlak Ģirdeninden üretilen peynir mayasının süte eklenmesiyle pıhtı oluĢumu sağlanır ve oluĢan pıhtı parçalanır. Ardından düĢük sıcaklıkta (50-55°C) ısıl iĢlem uygulanır. Daha sonra peynir altı suyunun uzaklaĢtırılması için pıhtı bez keselere alınarak süzme iĢlemi yapılır. Bez keselerin kendi haline bırakılmasıyla süzme iĢlemi bir süre devam eder. Ardından süzmeyi hızlandırmak amacıyla keselerin üzerlerine ağırlık koyulur. Bazı durumlarda elde edilen taze peynir oda sıcaklığında su içerisinde bırakılır ve böylece içeriğindeki laktoz uzaklaĢtırılır. Gerekirse bu yıkama iĢlemi birkaç kez tekrarlanabilir. Su içeriğinin azaltılması için taze peynirlere tekrar baskı uygulanır. Elde edilen peynirler ufalanır ve karıĢtırılarak %2.5-3 civarında tuz eklenir. Önceden hazırlanmıĢ deri Tulumlara bu taze peynir-tuz karıĢımı uygun Ģekilde doldurulur.
5
Tulumlar çeĢitli yerlerinden delinerek oda sıcaklığında yaklaĢık 3 gün bekletilir. YaklaĢık 2-10°C‟ de %85 nispi nemli soğuk hava depolarında 3-6 ay süre ile olgunlaĢtırılır.
Tulum peynirleri yaygın olarak üretildiği yörelere göre farklı isimlerle anılmaktadır (Tablo 1) (TekinĢen ve Uçar, 2007). Erzincan (ġavak), Divle, Çimi ve Ġzmir (salamuralı) Tulum peynirleri en çok bilinenleridir. Geleneksel olarak olgunlaĢtırma iĢlemi obruk, mağara ve mahzenlerde yapılmakla birlikte son yıllarda soğuk hava depoları da yaygın bir Ģekilde kullanılmaktadır.
Tablo 1. Türkiyede üretilen belli baĢlı mahalli tulum peynirleri
Peynir ÇeĢidi Üretildiği Yöre
Afyon Tulum peyniri Afyon
Akçabelen (Çepni) Tulum peyniri BeyĢehir Çimi Tulum peyniri Serik, Akseki ve Manavgat Divle Tulum peyniri (Üçharman) Divle
Ereğli Tulum peyniri Ereğli Ermenek Tulum peyniri Ermenek Erzincan (ġavak) Tulum peyniri Erzincan ve Elazığ Giresun Tulum peyniri Giresun Isparta Tulum peyniri Isparta Karaburun lorlu Tulum peyniri Karaburun Karın kaymağı peyniri GümüĢhane ve SarıkamıĢ Kayseri Tulum peyniri Kayseri Konya küflü peyniri Konya Ordu çökelekli Tulum peyniri Ordu Pasinler lorlu Tulum peyniri Pasinler Tokat Tulum peyniri Vakfıkebir ve Sürmene
Daha önceki çalıĢmalarda Tulum peynirinin birçok yapım yöntemi nedeniyle farklı yörelerde farklı özellikler taĢıdığı rapor edilmiĢtir. Bu çalıĢma ile materyal ve yöntem kısmında belirtildiği üzere farklı 4 yöreden alınan geleneksel Tulum peyniri örneklerinin özellikleri ortaya konulup, yöresel farklılıklar ve benzerlikler tespit edilmiĢtir.
Son yıllarda standart Tulum peyniri üretiminde pastörizasyon iĢlemi ve starter kültür kullanımı ile ilgili sınırlı sayıda çalıĢma yapılmıĢtır. Günümüzde gıda güvenliği ile ilgili konuların önem kazanması pastörize sütten peynir üretimini zorunlu hale getirmiĢtir. Ancak sütün pastörize edilmesi, bu sütten üretilecek Tulum peynirinin geleneksel özelliklerinin ortaya çıkmasında sorun oluĢturmaktadır. Bu sorun göz önüne alındığında geleneksel Tulum peynirlerinin mikroflorasının belirlenmesi zorunlu hale gelmektedir. Tulum peynirinde
6
olgunlaĢma çoğunlukla doğal mikroflora yardımıyla olmaktadır. OluĢan lezzet üzerinde, üretimde kullanılan teknik, süt çeĢidi, mikrobiyal flora ve olgunlaĢtırma Ģartları gibi faktörler etkilidir (Akın, 2002; Sert, 2011).
2.2. Laktik Asit Bakterileri
Laktik asit bakterileri gram pozitif, katalaz ve oksidaz negatif, nitratı nitrite indirgeyemeyen, bazı istisnalar hariç hareketsiz, Sporolactobacillus inulinus hariç spor oluĢturmayan, kok, kokobasil veya basil, DNA baz kompozisyonunun %53‟den daha azını G+C diziliĢinin oluĢturduğu bakteriler olarak tanımlanmaktadır. Glukozu baĢlıca laktik asite veya laktik asit, CO2 ve etanole fermente ederler. Tüm laktik asit bakterileri anaerobik olarak
geliĢirler fakat O2 varlığında da geliĢebildiklerinden „aerotolerant‟ olarak
adlandırılmaktadırlar. Katalaz aktivitesine sahip olmasalar da peroksit radikallerini detoksifiye eden süperoksit dismutaz enzimine sahiptirler. Laktik asit bakterileri
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus ve Streptococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus ve Weisella türlerinden oluĢur.
Laktik asit bakterileri yalnızca Ģekerleri metabolize ederek enerji elde edebildiği için bulundukları ortamlar Ģekerin bulunduğu ortamlarla kısıtlıdır. Kısıtlı biyosentetik aktiviteye sahip oldukları için tüm besinsel ihtiyaçlarını içeren kompleks bir besi ortamında geliĢtirilebilirler. Bir kısmı fırsatçı patojen olarak değerlendirmeye alınsa da çok büyük bir kısmı faydalı veya zararsız olarak değerlendirilmektedir. Süt ve süt ürünlerinde ve bitkisel materyallerde bulunurlar. Ġnsanların ağız boĢluğunun, intestinal bölgesinin normal florasıdır ve bu bölgelerde faydalı roller üstlenir. Özellikle Streptococcus cinsinin bazı türleri olmak üzere çok az sayıda laktik asit bakterisi türü hayvanlar için patojendir. Ġnsanda ise
Streptococcus pyogenes boğaz ağrısı, zatürre ve diğer bazı piyojenik enfeksiyonlar, kızıl
hastalığı ve çeĢitli kan zehirlenmeleri gibi semptomlar oluĢtururken; Streptococcus
pneumoniae lober pnömoni, orta kulak iltihabı ve menenjite sebebiyet vermektedir (Todar, 2012).
Laktik asit bakterileri gıda fermantasyonlarında kullanılan mikroorganizmalar arasında en önemli gruplar arasındadır. Bu bakteriler fermente ürünlerin tadına ve tekstürüne katkıda bulunurken aynı zamanda da ürettiği yüksek miktarda laktik asit ve büyüme inhibe edici maddeler ile gıdaları bozan bakterilerin geliĢmesini inhibe ederler. Yoğurt, peynir, tereyağı, sucuk, turĢu, zeytin gıdalarda fermantasyonu gerçekleĢtiren bakteriler genellikle laktik asit
7
bakterileridir, fakat bazı suĢlar da bira, Ģarap ve iĢlenmiĢ et ürünlerinde bozulmadan sorumludur.
Laktik asit bakterileri grup olarak farklı karbonhidratları ve karbonhidratlarla ilgili bileĢenleri degrade etme konusunda çok ciddi bir kapasiteye sahiptir. Genellikle baskın son ürün laktik asittir fakat farklı Ģartlara adapte olup metabolizmasını buna göre değiĢtirme yeteneğine de sahiptirler. ġekeri fermente etme Ģekillerine göre laktik asit bakterileri homofermantatif ve heterofermantatif olmak üzere iki temel kategoriye ayrılır. Lactobacillus cinsinin bazı türlerini, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus,
Tetragenococcus ve Vagococcus türlerinin büyük çoğunluğunu içine alan homofermantatif
grup Embden-Meyerhof metabolik yolu ile heksozları fermente eder. Diğer kategorideki heterofermantatif grup Leuconostoc türlerinin tamamının ve aynı zamanda bazı Lactobacillus,
Oenococcus ve Weisella türlerini içine alır. Her iki kategorinin birbirinden enzim seviyesinde
en belirgin ayrımı parçalama iĢlemini yapan enzim olarak EMP metabolik yolunda fruktoz 1-6 difosfatın diğer yolda ise fosfoketolaz (PK) enziminin kullanılmasıdır. AĢırı glukoz ve kısıtlı O2 varlığında homolaktik laktik asit bakterileri 2 mol pirüvat elde etmek için EMP
yolunu kullanarak 1 mol glukozu katabolize ederler. Hücre içi redoks dengesi piruvatın laktik asite indirgenmesi ile beraber gerçekleĢen NADH‟ın oksidasyonu sayesinde muhafaza edilir. Bu proses ile tüketilen her glukoz molekülü baĢına 2 mol ATP üretilir(Todar, 2012).
Laktik asit bakterilerinin inorganik azot kaynaklarını kullanarak amino asit sentezleme yeteneği çok sınırlıdır. Bu yüzden laktik asit bakterileri için azot kaynağı olarak aminoasitlerin hazır olarak sunulduğu geliĢme ortamları kullanılmaktadır. Laktik asit bakterilerinin aminoasit ihtiyacı türler arasında hatta tür içerisinde de suĢlar arasında farklılık göstermektedir. Bazı suĢlar birçok aminoasit için prototrofik iken bazıları ise geliĢmek için 13-15 aminoasite ihtiyaç duymaktadır. Ortamdaki serbest aminoasit miktarı bakterinin geliĢip yüksek hücre yoğunluğuna ulaĢmasını sağlayacak düzeyde değilse serbest amino asit elde etmek için peptit ve proteinleri hidrolize edebilecek bir proteolitik sisteme ihtiyaç duyarlar. Süt endüstrisinde sütün asidifiye edilmesi için kullanılan (örneğin peynir üretiminde) tüm
Lactococcus‟lar proteolitik sisteme sahiptir. Laktokokal proteolitik sistem sitoplazmik
membran dıĢında bulunan enzimler, transport sistemleri ve hücre içi peptidazlardan oluĢur. Laktik asit bakterilerinin proteolitik sisteme sahip olması fermente ürünlerin aynı zamanda tat, aroma ve tekstürlerine katkı sağlar. Swiss, Cheddar gibi çeĢitli peynir tipleri proteoliz kaynaklı aroma notlarına sahiptirler.
8
Birçok hayvansal veya bitkisel gıda laktik asit bakterileri ile fermente edilmektedir, çünkü bu bakteriler gıdanın üretimine ve değiĢimine fayda sağlayan özelliklere sahiptir. Fermente gıdaların asidik ve organoleptik özellikleri bu bakterilerin metabolik aktivitelerinin sonucu oluĢur. OlgunlaĢtırılmıĢ peynir, fermente sucuk ve turĢu gibi gıdalar üretildikleri hammadde ile kıyaslandıklarında çok daha uzun bir raf ömrüne sahip olmalarının yanında aynı zamanda fermente eden organizmalar direkt ve dolaylı yoldan gıdanın tat ve aroma karakteristiklerine katkıda bulunur. Fermente sütçülük ürünleri yüz yıllardır üretilmektedir fakat son yüz yıl içerisinde bu fermentasyonların mikrobiyal temelleri ortaya çıkarılmıĢtır. Starter kültürler kullanılmadan önce süt fermantasyonları sütte doğal olarak bulunan laktik asit bakterilerine bağlıydı. Ġlk ticari starter kültürler Danimarka‟da 19. yüzyılın sonlarında çiğ sütteki Ģu anda bilinmeyen karıĢık bir mikroorganizma grubundan elde edilmiĢtir. 1930‟larda tek bir saf kültürden starter oluĢturma fikri doğmuĢtur.
Fermente sütçülük ürünleri daha doğal, daha stabil, daha sağlıklı ve daha besleyici gıdalar olarak artan bir popülariteye sahiptir. Laktik asit bakterileri de yoğurt, tereyağı, ekĢi krema ve peynir gibi süt ürünlerinin üretiminde kullanılan asıl organizmalardır. Bazı fermente sütçülük ürünlerinde de son ürünün tekstürünü ve aromasını etkileyen CO2‟in üretimi için
ilave edilen, sekonder mikroflora diye de bilinen ek kültür olarak kullanılırlar(Todar, 2012).
2.3. Tulum Peynirlerinin Laktik Asit Bakterisi Florası
Peynirde olgunlaĢma sırasında bakteri, maya ve küfler metabolik faaliyet gösterebilmektedir. Bu mikroorganizmalar ya doğrudan metabolik aktiviteleri ile ya da dolaylı olarak otolizle peynir matriksi içine hücre içi enzimlerini bırakarak olgunlaĢmaya katkıda bulunmaktadırlar. Peynir olgunlaĢmasıyla iliĢkili olan mikroflora, çok fazla çeĢitlilik göstermekle birlikte starter laktik asit bakterileri ve ikincil mikroflora olmak üzere iki ana gruba ayrılabilir. Starter bakteriler peynir üretiminin baĢlangıcındaki asit üretiminden sorumludur ve bu nedenle yeterli asit üretim kapasitesine sahip olmaları önemlidir. Bununla birlikte peynirden izole edilen birçok türün önemli düzeyde asit üretmediği bildirilmiĢtir (Cogan ve ark., 1997). Ġkincil mikroflora ise peynir üretiminin baĢlangıcında herhangi bir aktif rol üstlenmemesine rağmen olgunlaĢmanın sonraki aĢamalarda starter bakteriler ile birlikte geliĢerek olgunlaĢmaya katkı sağlar. Starter bakteri olarak sıklıkla Lactococcus spp.,
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbruckii ve Lactobacillus helveticus kabul edilir.
9
Ġkincil mikroflora; (i) Lactobacillus spp., Pediococcus spp., Enterococcus spp. ve
Leuconostoc spp.‟dan oluĢan starter olmayan laktik asit bakterileri, (ii) Propiyonik asit
bakterileri, (iii) Küfler, (iv) Yüzey olgunlaĢtırılmıĢ peynirlerde yüzeyde geliĢen bakteriler ve mayalar olarak sınıflandırılabilir.
ġavak Tulum peynirlerinde olgunlaĢma süresince laktik asit bakterilerinin çeĢitliliği geleneksel mikrobiyal yöntemler kullanılarak incelendiğinde Streptecoccus spp.,
Enterecoccus spp., Lactococcus lactis subsp. lactis ve Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris ‟in olgunlaĢmada en önemli rolü oynayan mikroorganizmalar oldukları belirtilmiĢtir
(Öksüztepe ve ark., 2005). Özellikle Enterecoccus türlerinin olgunlaĢma boyunca çok yüksek oranlarda bulunduğunu ifade etmiĢler ve bu bulguların çiğ sütten üretilen Tulum peynirlerinin olgunlaĢma periyodunda elde ettikleri sonuçlarla uyumlu olduğunu belirtmiĢlerdir. Aynı zamanda L. casei subsp. casei‟ nin olgunlaĢmanın 30. gününden sonra bir artıĢ gösterdiğini, L.
plantarum‟ un olgunlaĢma boyunca önemli bir değiĢim göstermediğini, diğer laktobasillere
ise ya çok düĢük seviyelerde rastlanıldığını ya da bunların olgunlaĢmanın bazı aĢamalarında tespit edildiğini belirtmiĢlerdir.
Bostan ve ark. (1992) deneysel olarak yapılan Tulum peynirlerinden 684 ve ticari Tulum peynirlerinden 488 izolat elde etmiĢlerdir ve izole etikleri suĢları morfolojik, kültürel ve biyokimyasal özellikleri yönünden incelemiĢlerdir. Bu çalıĢmada laktik streptokokların, özellikle çiğ sütten üretilen peynir örneklerinde olgunlaĢmanın ilk günlerinde, sayılarının yüksek olduğu tespit edilmiĢtir. Laktik streptokokların aksine laktobasillerin taze peynirlerde sayılarının az olmasına rağmen kısa sürede çoğalarak hakim mikroflorayı oluĢturduklarını ve bu durumun olgunlaĢmanın sonuna kadar devam ettiğini belirtmiĢlerdir. Patır ve AteĢ (2003) çiğ sütten üretilen Tulum peynirinde teleme ve olgunlaĢma döneminin çeĢitli aĢamalarında bazı laktik asit bakteri gruplarının sayımını ve izolasyonlarını yapmıĢlardır. Bu çalıĢma soncunda Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, L. casei subsp.
casei, L. plantarum, Leu. mesenteroides subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum ve Leuconostoc lactis türlerinin olgunlaĢmada diğer bakterilere nazaran daha
etkin bir role sahip olduğu bildirilmiĢtir.
Ryssel ve ark. (2015) yarı sert Danbo Danimarka peynirlerinde yüzeyde geliĢen mikrobiyal çeĢitliliği kültüre bağımlı ve kültürden bağımsız olacak Ģekilde incelemiĢtir. Peynir yüzeylerinde baskın cins olarak Lactococcus suĢları belirlenmiĢ, olgunlaĢmanın 4-18.
10
haftaları arasındaki baskın cins Corynebacterium olmuĢtur. Staphylococcus ve
Brevibacterium ikinci ve üçüncü en baskın türleri olmuĢtur.
Giannino ve ark. (2009) kültürden bağımsız yöntemle farklı rakım ve dağlarda bulunan Fontina peyniri üretiminde kullanılan çiğ süt ve taze pıhtının mikrobiyal çeĢitliliğini incelemiĢtir. S. thermophilus, E. faecium, E. faecalis, Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis gibi bakteriler dağlardaki hayvanlardan elde edilen sütün kolonizasyonu için tercih edilen bakteriler olurken tüm sekanslama sonucunda teleme içerisindeki baskın türlerin E. faecium,
E. faecalis ve S. thermophilus olduğu belirtilmiĢtir ve bu türlerin kaynağının çiğ süt olduğu
yapılan çalıĢmalarla doğrulanmıĢtır.
Riquelme ve ark. (2015) çiğ inek sütünden elde edilen Portekiz geleneksel peynirlerinden olan Piko peynirindeki bakteriyal biyoçeĢitliliği incelemiĢ ve en baskın cins olarak Lactococcus suĢlarını (%77) izole etmiĢtir. Mikrobiyotanın temel bileĢenleri olarak
Lactococcus, Streptococcus, Acinetobacter, Enterococcus, Lactobacillus belirlenmiĢtir.
Mikrobiyal çeĢitlilikte üretim çiftlikleri ve olgunlaĢma süreleri arasında değiĢim görülmüĢtür.
Lactobacillus cinsinin sayısında olgunlaĢma sonunda artıĢ gözlemlenmiĢtir.
Alegría ve ark. (2009) çiğ inek sütünden elde edilen geleneksel Ġspanyol peyniri Casin‟in kültüre bağlı ve kültürden bağımsız tekniklerle üretim ve olgunlaĢma sırasındaki mikrobiyal dinamiği incelemiĢtir. Kültüre dayalı teknikler sonucunda tespit edilen 14 adet
Lactococcus cinsinden Lactococcus garviae 3 günlük peynirde en baskın tür olmuĢ, 30. günde
ise bunun yerini Lactococcus lactis subsp. lactis almıĢtır. Üretim sırasında daha önce geleneksel Ġspanyol peynirlerinde hiç tanımlanmamıĢ olan S. thermophilus gözlemlenmiĢtir. Mangia ve ark. (2008) da Fiore Sardo peynirinin serbest amino asitlerini, serbest yağ asitlerini ve peynir mikroflorasını incelemiĢtir. Peynir olgunlaĢmasının 5. gününde en baskın türler
Lactococcus lactis ssp. lactis, daha sonra E. faecium, E. faecalis ve L. plantarum olarak
belirlenmiĢtir. OlgunlaĢma periyodu ilerledikçe Lactococcus lactis ssp. lactis ve Lb.
plantarum sayısında bir azalma gözlemlenmiĢ ve yerlerini L. brevis ve L. casei almıĢtır.
Öner ve ark. (2003) piyasadan toplanan Tulum peynirlerinde geleneksel mikrobiyal yöntemler kullanarak yapmıĢ oldukları çalıĢmada L. paracasei ssp. paracasei, L. bifermentans ve E. faecium‟un dominant florayı oluĢturduğunu belirlemiĢlerdir. Yine Hayaloglu ve ark.
11
(2007) da Tulum peynirlerinin mikrobiyal yükünü (toplam mezofilik bakteri, koliform ve maya-küf) belirledikleri araĢtırmada olgunlaĢmanın ilk aĢamasında toplam mezofilik bakteri sayısının en üst düzeyde bulunduğunu ancak 120 gün sonra azaldığını bildirmiĢlerdir. Morul ve ĠĢleyici (2012) ise yapmıĢ oldukları çalıĢmada Divle Tulum peynirinin mikrobiyolojik özelliklerini (aerobik mezofilik bakteri sayısını, Lactobacillus-Leuconostoc-Pediococcus grubu mikroorganizma, enterokok, Enterobactericea ve Pseudomonas türü mikroorganizma sayısını) geleneksel kültürel yöntemlerle belirlemiĢlerdir. Sonuç olarak inceledikleri Divle peynirlerinin halk sağlığı açısından riskli olduğunu belirtmiĢ ve bu peynir tipi üretiminde standardizasyonun oluĢturulmasını önermiĢlerdir.
Çakmakçı (2008), Tulum peynirlerinde laktik asit bakteri popülasyonuna olgunlaĢtırma ambalajının etkilerini araĢtırmıĢlar ve inceledikleri tüm ambalajlarda da olgunlaĢtırılan Tulum peynirlerinde Lactobacillus ve Enterococcus türlerinin dominant olduğunu belirtmiĢlerdir.
2.4. Laktik Asit Bakterilerinin Peynirde Aroma OluĢturması
Peynirdeki aroma maddeleri rennet, süt, starter ve starter olmayan laktik asit bakterilerinden gelen enzimlerin çalıĢması ile meydana gelir. Peynir olgunlaĢması esnasında aroma maddelerinin oluĢumu süt bileĢenlerinin çeĢitli kimyasal ve biyokimyasal dönüĢümlerinden daha yavaĢ ilerleyen bir prosestir. Bu konuda 3 ana metabolik yol tarif edilmektedir: laktozun (glikoliz), yağın (lipoliz) ve kazeinlerin (proteoliz) dönüĢümleridir. Bu metabolik yollardaki enzimlerin baĢlıca kaynakları fermantasyonlarda kullanılan starter kültürlerdir. Bu fermantasyonlarda kullanılan dominant organizmalar L. lactis, S.
thermophilus, Lactobacillus türleri, Leu. mesenteroides gibi laktik asit bakterileridir. Bu
starter organizmaların haricinde süt orjinli mezofilik laktobasiller de sütçülük ürünlerinde geliĢebilir ve aroma oluĢumunu sağlayan enzim aktivitelerinin bir kaynağı olabilirler. Laktozun fermantasyonu esnasındaki temel dönüĢümler laktatın laktik asit bakterileri tarafından meydana getirilmesini sağlar fakat ara reaksiyon olarak oluĢan piruvat alternatif olarak diasetil, asetaldehit, asetoin veya asetik asit gibi çeĢitli aroma maddelerine dönüĢtürülebilir.
Lipoliz metil ketonlar, sekonder alkoller, esterler ve laktonlar gibi aroma maddelerinin meydana gelmesi için öncü de olabilen serbest yağ asitlerinin oluĢumu ile sonuçlanır. Laktik asit bakterileri genellikle lipolize sekonder kültürlerden veya yüzey-olgunlaĢtırılan
12
peynirlerde olduğu gibi küflerin katkısından çok daha az katkı verir. Yağların dönüĢümü sonucu oluĢan aroma maddeleri özellikle Camembert ve Rokfor gibi yumuĢak peynirlerde önemlidir. Kazeinlerin dönüĢümü ise hiç Ģüphesiz sert ve yarı-sert tip peynirlerin aroma oluĢumu için en önemli biyokimyasal yoldur. Kazeinler rennet enzimlerinin aktiviteleri sayesinde ve laktik asit bakterilerinden gelen ve hücreyi saran proteinaz ve peptidazlar sayesinde parçalanmıĢ olur küçük peptitlere ve amino asitlere dönüĢürler. Spesifik bir aroma oluĢumu için ileri aĢamada amino asitler çeĢitli alkol, aldehit, asit, ester ve sülfür bileĢiklerine dönüĢürler(Smit ve ark., 2005).
Starter olmayan laktik asit bakterileri (SOLAB) gıda fermentasyonunda, aroma geliĢiminde starter kültürler ile beraber rol almaktadır. Starter kültür olan ve olmayan suĢlar, birlikte laktozu fermente ederek, süt proteinlerini peptitlere ve serbest aminoasitlere dönüĢtürür. Ayrıca sitratı lipit, ester ve uçucu metabolitlere parçalayarak aroma maddelerini oluĢturmaktadır. SOLAB olan Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus ve Leuconostoc türleri peynirden, sosisten ve yoğurttan izole edilebilmektedir. Ġzole edilen SOLAB türleri gıdanın çeĢidine, üretim dönemine ve iĢletmesine göre farklılık gösterse de genellikle L. casei suĢu genelde en tercih edilen suĢtur (Fitzsimons ve ark., 1999). OlgunlaĢma sürecinin baĢlangıcında starter kültür olarak kullanılan suĢ genelde 109
kob/g olmaktadır. Fakat olgunlaĢma süresinde organizma için oluĢan kötü Ģartlar (laktozun azlığı, sodyum klorür (NaCl) fazlalığı, düĢük pH ve düĢük sıcaklık vs) starter kültürü otolize zorlamakta ve starter kültürün hücre içi enzimlerinin peynir matriksine geçmesini sağlayarak olgunlaĢmaya etki etmektedir (Broadbent ve Steele, 2005). BaĢlangıç olarak kullanılan suĢ olgunlaĢmanın ilerleyen sürecinde sayı olarak azalmaktadır. Bunun tersine SOLAB populasyonu her türlü peynirlerde baĢlangıçta ve olgunlaĢma süresinin sonunda sırası ile 102
-104 kob/g ve 108-109 kob/g kadardır.
SOLAB‟ın ana kaynağı ısıl iĢlem uygulanmamıĢ sütten yapılan peynirlerdir (Berthier ve ark., 2001). Fakat bazı SOLAB uygulanan ısıl iĢlem normlarına (sıcaklık-süre) dayanıklıdır (Jordan ve Cogan, 1999; Somers ve ark., 2001). Peynirdeki laktoz olgunlaĢmanın ilk haftalarında metabolize olduğundan starter olmayan laktik asit bakterileri çoğalmak için enerji kaynağına ihtiyaç duyarlar. Lize (parçalanan hücre) olmuĢ hücrelerin süt yağı globül membranları, sitrat ve arjinin potansiyel enerji kaynaklarıdır. Metabolize olabilen Ģekerler olmadığı zaman sitrat SOLAB tarafından enerji kaynağı olarak kullanılmaktadır. Çok az da olsa kalıntı laktoz hala en önemli enerji kaynağıdır. L. plantarum, L. brevis, Leu.
13
mesenteroides, Pediococcus acidilactici ve Pediococcus pentosaceus D-ribozda
büyümemektedir. Fakat glukoz bulunduğu ortamda D-riboz metabolize olabilmektedir (Westby ve ark., 1993).
Starter olmayan laktik asit bakterileri, L. casei ve L. plantarum laktozu PTS sistemi ile fermente etmektedir (Yebra ve ark., 2006; Saulnier ve ark., 2007). Laktoz, glikoz ve galaktoza fosfo-β-galaktosidaz ile hidrolize olmaktadır. Glikoz ve galaktoz glikoliz ile 2 mol laktik aside parçalanmaktadır. Diğer taraftan fakültatif heterofermentatif Lactobacilluslar tarafından 1 mol CO2, 1 mol etanol, asetik asit ve 1 mol laktik asit üretilmektedir. Cheddar peynirinde
aerobik Ģartlarda Lactobacillus ve Pediococcus suĢları laktattan asetat ve CO2
üretebilmektedir. SOLAB peynirlerin olgunlaĢması sürecinde ortam Ģartlarına bağlı olarak L-laktatı D-laktat formuna değiĢtirmektedir. Ne zaman D-laktat oluĢursa Ca-D-laktat peynirde beyaz tortu oluĢturmaktadır. Heterofermentatif Lactobacillus sitratı enerji kaynağı olarak kullanmakta fakat fermente olabilen Ģekerler olduğu durumda sitratı metabolize edebilmektedir. Glikozun katabolik represyon gerçekleĢtirmesinden dolayı sitratın hızlı katabolizması galaktoz varlığında glukoz ve laktoza oranla daha yüksek olmaktadır.
2.5. Bakterilerin Tanımlanmasında Kullanılan Güncel Genotipik Yöntemler
Mikroorganizmaların tanımlanmasında klasik ve moleküler yöntemler kullanılmaktadır. Klasik yöntemler kullanıĢlı olmasına rağmen, türler arası varyasyonlar ve tekrarlanabilirliklerinin zayıf olması gibi bazı dezavantajları bulunmaktadır. Bunlara ek olarak; bu yöntemlerin daima alternatif sistemlere ihtiyaç duyması, daha çok cins düzeyinde bir tanı yapabilmesi, hem uzun zaman alması hem de sonuçların kontaminasyon ve el becerisine bağlı olarak değiĢebilmesi gibi dezavantajları da vardır. Günümüzde mikroorganizmaların tespit edilebilmesi ve tanımlanması için 16S rRNA ya da onu kodlayan gen gibi bazı moleküler yapıların kullanıldığı moleküler biyolojik teknikler, mikrobiyal çeĢitliliği araĢtırmak ve mikrobiyal toplulukların yapılarını analiz etmek için artık daha sıklıkla kullanılmaktadır. ġüphesiz bu metotların en önemli avantajlarından birisi mikroorganizmaların büyüme koĢullarından bağımsız olmalarıdır. Genotipik metotlar tür seviyesinden suĢ seviyesine kadar ayrım yapabilme özelliğine sahiptir (Temmerman ve ark., 2004; Singh ve Ramesh, 2009). Yukarıda ifade edilen bu nedenlerden ötürü yapılacak çalıĢmada Tulum peynirindeki bakteriyel floranın suĢ bazında tanımlanmasında moleküler yöntemlerle çalıĢma yoluna gidilmiĢtir.
14
Moleküler tanımlamada en yaygın olarak kullanılanı 16S rRNA geni nükleotid dizisi kullanılarak yapılan tanımlamadır.16S rRNA geni yaklaĢık 1,5 kb uzunluğundadır ve bu gen hem korunan hem de değiĢken bölgeler içermektedir (Sacchi ve ark., 2002). Bazı durumlarda genin tamamının sekanslanması söz konusu olsa da genellikle değiĢken bölgelerin kısmi sekanslanması bakterilerin tanımlanması için yeterli olmaktadır. 16S rRNA gen sekanslamasının, bakteriyel filogeni ve taksonomi çalıĢmalarında çok sık kullanılmasının sebepleri Ģunlardır i. Bakterilerde bulunan ortolog bir gendir, ii. Genin fonksiyonu zaman içinde değiĢmemiĢtir ve iii. 16S rRNA geni istenen bilginin alınabilmesi için yeterli uzunluktadır (Patel, 2001; Janda ve Abbott, 2007). 16S rRNA geninin iyi korunan yani değiĢikliklere açık olmayan bir gen olmasının sebebinin hücre fonksiyonu için kritik bir gen olması ve bu nedenle de mutasyonların bu gende kolaylıkla tolere edilememesi olduğu varsayılmaktadır (Clarridge, 2004).
Son yıllarda Denatüre Edici Gradyan Jel Elektroforezi (DGGE), Sıcaklık Gradyan Jel Elektroforezi (TGGE), Tek Parçalı Kontrol Edilen Polimorfizm (SSCP) ve Floresans In Situ Hibridizasyon (FISH) yöntemleri peynirdeki mikrobiyal çeĢitliliğin belirlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır (Muyzer ve ark., 1993; Ercolini ve ark., 2004; Ogier ve ark., 2004). Bu yöntemlerden FISH yöntemi çok fazla iĢ gücü gerektirmesi, SSCP tekniği nicel olmaması ve gen kütüphanesi olmadan karĢılaĢtırma yapılamaması gibi dezavantajlara sahiptir. DGGE, dizi analizine ihtiyaç duyulması, PCR bazlı olması gibi dezavantajlarına rağmen hızlı olmasından dolayı yaygın olarak tercih edilen bir tekniktir (Cocolin ve ark., 2001; Ercolini ve ark., 2004; Temmerman ve ark., 2004). Ayrıca DGGE kültürel olmayan teknikler içerisinde peynir mikroflorasının belirlenmesinde en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir (Coppola ve ark., 2001; Cocolin ve ark., 2004; Flórez ve Mayo, 2006; Bonetta ve ark., 2008; Dolci ve ark., 2008; Giannino ve ark., 2009; Randazzo ve ark., 2012; Arcuri ve ark., 2013).
ÇeĢitli peynirlerin mikrobiyal florasının belirlenmesi üzerinde yapılan çalıĢmalarda diğer tekniklere kıyasla DGGE tekniğinin daha fazla kullanıldığı görülmektedir. Geleneksel bir süt ürünü olan Tulum peynirine uygulanabilirliğinin diğer tekniklere nazaran daha avantajlı olması sebebiyle bu çalıĢmada DGGE tekniği kullanılmıĢtır. Bu teknikte birçok organizmayı içeren bir örnekten direkt DNA izolasyonu yapıldıktan sonra hedef bölgeler PCR tekniği ile amplifiye edilir ve hedef bölge olarak genellikle 16S rRNA geninin değiĢken bölgeleri seçilmektedir. Bu değiĢken bölgelerden peynir mikrolorasının belirlenmesinde sıklıkla V1, V2 ve V3 değiĢken bölgeleri kullanılmıĢtır (Coppola ve ark., 2001; Cocolin ve
15
ark., 2004; Flórez ve Mayo, 2006; Bonetta ve ark., 2008; Dolci ve ark., 2008; Giannino ve ark., 2009; Randazzo ve ark., 2012; Arcuri ve ark., 2013).
2.6. Peynirdeki Mikrobiyal Flora Tespiti için DGGE Uygulamaları
ÇeĢitli peynirlerdeki mikrobiyal çeĢitliliğin tespitine yönelik güncel DGGE uygulamaları bulunmaktadır. Coppola ve ark. (2001) olgunlaĢmamıĢ farklı tipteki geleneksel ve ticari olarak üretilen Pasta Filata peynir örneklerine PCR-DGGE uygulayarak mikrobiyal çeĢitliliği belirlemiĢlerdir. Peynir örneklerinden direkt DNA izolasyonu yapmıĢ ve 16S-23S rDNA ara bölgesi ve 16S rDNA‟nın V3 bölgesini çalıĢmıĢlardır. DGGE analizi için V3 amplikonu ve laktik asit bakterisi referans markırlarını kullanmıĢlardır. AraĢtırmacılar Stilton peynirinde de 16S ribozomal DNA analiziyle PCR-DGGE kullanarak mikrobiyal popülasyonu tespit etmiĢlerdir. Florada DGGE fragmentinin sekanslanmasıyla Lc. lactis, E.
faecalis, L. plantarum, L. curvatus, Leu. mesenteroides, Staphylococcus equorum, ve Staphylococcus sp. türleri tanımlanmıĢtır (Ercolini ve ark., 2003).
Ercolini ve ark. (2004) manda sütünden yapılan geleneksel Mozzarella peynirinde üretim süresince mikrobiyal değiĢimi PCR-DGGE ile belirlemiĢlerdir. Doğal starterlerin son ürüne olan etkisini incelemiĢler ve bir seri parmakizi (fingerprint) yöntemiyle Mozeralla peynir üretiminde farklı adımlarda meydana gelen mikrobiyal çeĢitliliği tanımlayarak, starterin etkinliğini tespit etmeyi ve prosesi kontrol altına almayı hedeflemiĢlerdir. Flórez ve Mayo (2006) peynir sütündeki ve rennet ekstraktı kullanılarak yapılan geleneksel mavi damarlı Ġspanyol peynirindeki mikrobiyal popülasyonunu tanımlamayı hedefledikleri çalıĢmalarında bakteriyel 16S rRNA geninin V3 bölgesini ve ökaryotik 26S rRNA geninin D1 bölgesini PCR-DGGE ile analiz etmiĢlerdir. Örnekler arasındaki iç ve yüzey bölgelerindeki ve baĢlangıç ve 60 günlük olgunlaĢma süresi arasındaki mikrobiyal popülasyon farklılıklarını belirlemiĢlerdir. El-Baradei ve ark. (2007) da yumuĢak tip peynir olan geleneksel Mısır Domiati peynirinin bakteriyel çeĢitliliğini tanımlamak için PCR-DGGE ve PCR-TGGE kullanmıĢlardır.
Aponte ve ark. (2008) Ġtalya‟da ticari olarak çiğ sütten starter kültür ilavesiz üretilen Provolone del Monaco peynirindeki mikrobiyal floranın tanımlanmasına yönelik çalıĢmalarında PCR-DGGE yöntemini kullanmıĢlardır. Bonetta ve ark. (2008) tipik Ġtalyan peyniri Robiola di Roccaverano (PDO) ile çalıĢmıĢlardır. Dört farklı yöntemle ticari olarak
16
üretilen bu peynir örneklerinin mikrobiyel florasını tespit etmek amacıyla PCR-DGGE yöntemini kullanmıĢlardır. Florada baskın türlerin Lactococcus lactis subsp. lactis, Geotricum
spp. ve Kluyveromyces lactis olduğunu belirtmiĢlerdir. Dolci ve ark. (2008) Ġtalya‟da
geleneksel olarak üretilen Castelmagno PDO (Protected Designation of Origin-Kökeni korunmuĢ) peynirinin üretim ve olgunlaĢma sürelerinde 3 farklı üretici firmadan 3 farklı aĢamada (süt, teleme ve peynir) alınan örneklerde PCR-DGGE yöntemi kullanarak dominant mikrobiyal florayı tanımlamıĢlardır.
Gala ve ark. (2008) Ġtalya‟da üretilen Parmigiano Reggiano peynirinin 12 aylık olgunlaĢma süresi boyunca değiĢim gösteren mikroflorasının tespitine yönelik çalıĢmada PCR-DGGE yöntemini kullanmıĢlardır. Rantsiou ve ark. (2008) ise Yunanistan‟da ticari firma tarafından üretilen 4 farklı beyaz peynirde PCR-DGGE yöntemini kullanarak LAB ve maya florasını tespit etmiĢlerdir. Van Hoorde ve ark. (2008) ise çiğ sütten yapılan geleneksel 2 farklı Gouda tipi peynirde PCR–DGGE yöntemini kullanarak LAB çeĢitliliğini ortaya koymuĢlardır.
Yapılan literatür çalıĢmasında farklı ülkelerde farklı tip geleneksel peynirler üzerine yapılan çalıĢmalarda mikrofloranın belirlenmesinde PCR–DGGE yönteminin uygulandığı görülmüĢtür. Ülkemizde de DGGE tekniği kullanılarak peynir üzerinde yapılan çalıĢma sayısının çok az olması dikkat çekicidir. Bu durum projede geleneksel yöntemle üretilen Tulum peynirlerinin mikrobiyal florasının belirlenmesinde DGGE yönteminin kullanılma sebeplerindendir.
17
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1. Örneklerin Toplanması ve Karakteristikleri
Orta Toroslar yöresinde (Konya-Ereğli, Karaman, Mersin-Mut, Mersin-Anamur) geleneksel yöntemle çiğ sütten (starter kültür kullanılmadan) üretilen 32 adet (4*8) deri Tulum peyniri, üreticilere ürettirilmiĢtir. Yukarıda belirtilen 4 lokasyondan 8 adet örnek (8 biyolojik tekerrür) alınmıĢ ve alınan her bir örnek 7 eĢit parçaya bölünüp her bir parça 2 kg‟lık deri Tulumlara basılmıĢ ve her bir parça ayrı bir depolama periyodunda analiz edilmiĢtir. Deri Tulum peyniri örnekleri üreticilerle benzer Ģartlarda olgunlaĢtırılmıĢtır. Peynir örnekleri, deri Tulumu depolayan soğuk hava depolarından alınan bilgiler ıĢığında, %85 nispi nemli ortamda ön olgunlaĢtırma ve asıl olgunlaĢtırma olarak iki aĢamalı olgunlaĢtırılmaya tabi tutulmuĢtur. Ön olgunlaĢtırma 15°C sıcaklıkta 4 gün yapıldıktan sonra, asıl olgunlaĢtırma 2-4°C depo sıcaklığında gerçekleĢmiĢtir. OlgunlaĢtırmanın ilk 3 ayı içerisinde mikrobiyal aktivitenin yoğun olacağı, daha sonraki dönemde mikrobiyal aktivitenin azalacağı ve enzimatik aktivitenin ise olgunlaĢtırmada daha etkin olacağı tahmin edildiğinden olgunlaĢtırma periyodundaki örnek alma zamanları olgunlaĢtırmanın 7., 15., 30., 60., 90. ve 180. günleri olarak belirlenmiĢtir. Tüm kitleyi temsil edecek Ģekilde örnek alınabilmesi için Tulumun farklı kısımlarından aseptik koĢullarda örnekler alınarak karıĢtırılmıĢtır. Peynir örneklerinde herhangi bir mikrobiyal farklılık oluĢmaması için örnekler soğuk zincirde laboratuvara ulaĢtırılarak, gerekli analizler yapılmıĢ ve zamana bağlı olmayan analizler (kuru madde, yağ, protein vb.) için bir miktar örnek -20°C‟de vakum ambalajlı olarak muhafaza edilmiĢtir.
3.2. Mikroorganizmalar ve Kültür ġartları
Ġzole edilecek mikroorganizmaların sayımı ve izolasyonu için her peynir örneğinden 10 g alınarak üzerine 90 ml steril %2‟lik Sodyum Sitrat (Merck, Darmstadt, Germany) çözeltisi ilave edilip Stomacher ile homojen hale getirilmiĢtir. Seri dilüsyonlar peptonlu su (%0.1 w/v) ile hazırlanmıĢtır. Uygun dilüsyonlardan 100 µl alınarak kullanılacak besiyerlerine yayma yöntemi ile ekim yapılmıĢtır. Ayrıca fakültatif anaerobik mikroorganizmalar için gerekli inkübasyon ortamı Anaerocult C (Merck) ile sağlanmıĢtır. Kullanılan besiyerleri Randazzo ve ark. (2006) ve Helmark ve ark. (2004) tarafından önerilen besiyerlerinden seçilmiĢ ve aĢağıdaki tabloda verilmiĢtir. Ekim yapılan petrilerden koloniler
18
izole edilerek art arda 2 kez aynı besiyeri petrisine çizilip inkübe etmek suretiyle saflaĢtırılmıĢtır.
Tablo 2. Hedef mikroorganizma grupları ve inkübasyon Ģartları
Besiyeri Hedef Bakteri Grubu Ġnkübasyon koĢulları
MRS Laktobasiller 42°C 'de 48 saat, anaerobik koĢullarda MRS-V Leukonostoklar 25°C 'de 72 saat aerobik koĢullarda M17 Streptokoklar 37°C‟de 48 saat, aerobik koĢullarda LM17 Streptokoklar ve Laktokoklar 30°C‟de 72 saat, aerobik koĢullarda Rogosa Mezofilik Laktobasiller 37°C 'de 72 saat, anaerobik koĢullarda PCA Aerobik mezofilikler 37°C 'de 48 saat, aerobik koĢullarda
3.3. Ġzole Edilen Bakterilerin Morfolojik, Fizyolojik ve Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi
SaflaĢtırılmıĢ bakteri izolatlarının koloni morfolojileri dikkate alınarak, Gram Boyama Seti (Merck) kullanılarak gram boyama yapılmıĢtır. Ayrıca katalaz testi için deney tüpüne buzdolabı sıcaklığında (+4ᵒC) 1 ml %30‟luk H2O2 koyularak ve 1 ml bir gece inkübe edilmiĢ
kültür üzerine eklenerek gaz çıkıĢı olup olmadığı gözlemlenmiĢtir. Glukozdan gaz üretimi et ekstraktı ve sitrat içermeyen, %2 glukoz içeren MRS broth ile Durham tüpü kullanılarak test edilmiĢtir (Tjandraatmadja ve ark., 1990; Gürakan, 1991).
3.4. Kültüre EdilmiĢ Bakterilerden DNA Ekstraksiyonu
Laktik asit bakterilerini geliĢtirmek amacıyla kültür ortamı olarak; MRS, M17, LM17, Rogosa, PCA ve MRS-Vankomisin besiyerleri kullanılmıĢtır. MRS agar 42°C‟de 48 saat fakültatif anaerobik koĢullarda, M17 ve LM17 37°C'de 48 saat aerobik koĢullarda, Rogosa Agar 37°C'de 48 saat anaerobik koĢullarda, PCA 30°C‟de 48 saat aerobik koĢullarda inkübasyona bırakılmıĢtır. Laktik asit bakterilerini tanımlamak amacıyla yukarıda belirtilen besiyerleri üzerinde geliĢerek tek düĢmüĢ durumda olan koloniler içerisinde 10µl PCR-grade su bulunan steril eppendorf tüpleri içerisinde süspanse edilmiĢtir. Her örnek süspansiyonundan 1 µl alınarak içerisine 1.2 µl MgCl2, 3 µl PCR buffer, 1‟er µl reverse ve
forward primerler, 0.5 µl Taq Dna polimeraz ve 1 µl dNTP solüsyonları eklenerek 30 µl son hacimli karıĢım hazırlanmıĢtır. Kullanılan kimyasallar (Thermo Scientific) tarafından sağlanmıĢtır.
19
3.5. Peynir Örneklerinden Toplam DNA Ekstraksiyonu
Peynir örnekleri 1:10 oranında steril Ringer çözeltisi içerisinde çözündürülüp Stomacher kullanılarak homojenize edilmiĢtir. Peynir süspansiyonundan 1 ml alınarak Nutrient Broth içerisinde 30°C‟de 24 saat inkübe edilmiĢtir. Bakteriyal DNA ekstraksiyon kitinin (Vivantis Technologies Sdn. Bhd. Selangor Darul Ehsan, Malaysia) protokolü Ģu Ģekilde uygulanmıĢtır: AktifleĢen koloni süspansiyonundan 1 ml alınarak 4°C‟de 6000 g‟de 2 dakika santrifüj edilmiĢtir. Elde edilen pellet 100 µl Buffer R1 ile yeniden süspanse edilip, süspansiyona 15 µl lizozim (50mg/ml) katılıp karıĢtırıldıktan sonra 37°C‟de 20 dakika inkübasyona bırakılmıĢtır. Süspansiyon 4°C‟de 10.000 g‟de 3 dakika santrifüj edildikten sonra oluĢan pellete 180 µl Buffer R2 ve 20 µl proteinaz K (20mg/ml) eklenerek 65°C‟de 20 dakika (+30 dakika opsiyonlu) inkübe edilmiĢtir. Elde edilen lizata 20 µl RNaz (20mg/ml) eklenerek 37°C‟de 5 dakika yeniden inkübe edilmiĢtir. Lizatın iki katı hacmi Buffer BG ile karıĢtırılıp 65°C‟de 10 dakika inkübasyona bırakılmıĢtır. KarıĢıma 200 µl absolüt etanol (>95%) ilave edilip karıĢtırılmıĢtır. Elde edilen örnekler toplama tüpleri içerisine transfer edilip 10.000 g‟de 1 dakika santrifüj edilmiĢtir. Spin kolonları içerisinde kalan kısım 650 µl Yıkama Bufferı ile yıkanmıĢ ve yeniden 10000 g‟de 1 dakika santrifüj edilmiĢtir. Spin kolonları yeni bir mikrosantrifüj tüpüne yerleĢtirilip üzerine 50 µl Elüsyon Bufferı ilave edilip 2 dakika bekletilmiĢtir. Son olarak 10.000 g‟de 1 dakika santrifüj edilerek elde edilen DNA -20°C‟ta depolanmıĢtır (Vivantis technologies, 2018).
3.6. PCR Amplifikasyonu ve DGGE KoĢulları
Elde edilen tüm DNA‟lar F365 (forward) (5‟-ACWCCTACGGGWGGCWGC-3‟) ve R1064 (reverse) (5‟-AYCTCACGRCACGAGCTGAC-3‟) universal primerlerle birlikte 16S rRNA V3 bölgesini çoğaltmak için Ģablon DNA materyali olarak kullanılmıĢtır. Primerlerin tamamı Sentegen (Sentegen Biotech, Ankara/Turkey) tarafından sağlanmıĢtır. PCR amplifikasyonu BioRAD termal döngüleme (T100™, Foster City, California, USA) cihazı kullanılarak toplam 30 µl hacimde gerçekleĢmiĢtir.
Amplifikasyon iĢlemi için olan PCR koĢulları Ģu Ģekildedir: 95°C‟de 5 dakika baĢlangıç denatürasyonu, her bir döngü; 95°C‟de 30 saniye, 58°C‟ta 30 saniye ve 72°C‟de 45
20
saniye olacak Ģekilde toplam 35 döngü gerçekleĢtirilmiĢtir. Tamamlanan döngülerin 72°C‟de 10 dakika boyunca uzama iĢlemi gerçekleĢtirilerek sona ermiĢtir. 30 µl lik toplam hacimli PCR ürünlerinin her birinden 1:6 oranında Loding Dye ile boyanarak, Etidyum bromür (%1) veya RedJel içeren agaroz jeli üzerine yüklenerek TBE tamponu (1X) ile dolu olan elektroforez cihazında yürütülmüĢtür. Elektroforez koĢulları 100V‟da 1 saat yürütülecek Ģekilde ayarlanmıĢtır. Kalan PCR ürünleri sekansa gönderilmek üzere -20°C‟de depolanmıĢtır. Sekansa gönderilen 16S rRNA V3 bölgeleri Standart Nükleotid BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) veri tabanındakilerle karĢılaĢtırılarak kimlikleri tespit edilmiĢtir.
DGGE %30-50 formamide-üre (Bio-Rad) denatürasyon aralıklarıyla [%100 denatüre edici madde 7M üre ve %40 (hacim/hacim) formamide denktir] %6 poliakrilamid jel üzerinde 60°C‟de D-CODE (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) cihazında çalıĢılmıĢtır. Elektroforez koĢulları olarak 50V 55°C‟de 10 dakika ön yürütme ve ardından 150V 60°C‟de 6 saat yürütme iĢlemi Ģeklinde uygulanmıĢtır. Elektroforezden sonra jeller 15 dakika Gel-Red içeren TAE tamponu (1X) içerisinde bekletilmiĢ ve bantlar Chemi-Doc (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) cihazında görüntülenmiĢtir.
3.7. DGGE Bantlarının Tanımlanması
Poliakrilamid jeller üzerindeki bantlar her baz çiftini temsil edecek Ģekilde seçilip kesilmiĢ ve 4°C‟de bir gece boyunca DNA‟nın su içerisine diffüze olması sağlanmıĢtır. Bu çözelti içerisindeki bakteriyal kromozomların 16S rRNA V3 bölgelerini çoğaltmak amacıyla bakteri hücrelerinin ribozomal bölgesine homolog olan F338 ön primer ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3‟) ve 3‟ terminal ucuna GC DNA takısı (5‟-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGG CACGGGGG-3‟) takılarak ve 518R geri yön primer (5‟-ATTACCGCGGCTGCTGG-3‟) ile birlikte PCR iĢlemi uygulanmıĢtır. PCR ürününün son hacmi 30 µl olacak Ģekilde 5 µl Ģablon olarak kullanılarak kromozomal DNA, 1.2 µl MgCl2, 3 µl PCR tampon, 1‟er µl primer, 0.5 µl Taq polimeraz ve 1 µl dNTP içeren
karıĢım hazırlanarak daha önceden belirtilen PCR koĢulları altında yeniden amplifiye edilmiĢtir. PCR ürünleri sekansa gönderilerek Standart Nükleotid BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) veri tabanındakilerle karĢılaĢtırılarak kimlikleri tespit edilmiĢtir (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
21
3.8. Kimyasal Analizler
Peynir örneklerinde protein, yağ, kül, kuru madde, pH, titrasyon asitliği, su aktivitesi gibi fizikokimyasal analizler toplanan bütün örnekler için rutin olarak Kirk ve Sawyer (1991) tarafından verilen yöntemlere göre 3 paralelli olarak çalıĢılmıĢtır.
