T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
KİMYA ANABİLİM DALI
TAFLAN (Laurocerasus officinalis Roem.) BİTKİSİNİN MEYVE, ÇEKİRDEK VE YAPRAKLARININ MEVSİM DEĞİŞİKLİĞİNE GÖRE ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN BELİRLENMESİ VE FENOLİK BİLEŞİK TAYİNİ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Hazırlayan: MEHMET SONER ENGİN Danışman: Yrd. Doç. Dr. MAHFUZ ELMASTAŞ
TAFLAN (Laurocerasus officinalis Roem.) BİTKİSİNİN MEYVE, ÇEKİRDEK VE YAPRAKLARININ MEVSİM DEĞİŞİKLİĞİNE GÖRE ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN BELİRLENMESİ VE FENOLİK BİLEŞİK TAYİNİ
MEHMET SONER ENGİN
YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİMDALI
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TAFLAN (Laurocerasus officinalis Roem.) BİTKİSİNİN MEYVE, ÇEKİRDEK VE YAPRAKLARININ MEVSİM DEĞİŞİKLİĞİNE GÖRE ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN BELİRLENMESİ VE FENOLİK BİLEŞİK TAYİNİ
MEHMET SONER ENGİN YÜKSEK LİSANS TEZİ
KİMYA ANABİLİMDALI
Bu tez 21/09/2007 tarihinde aşağıda belirtilen jüri tarafından oy birliği ile kabul edilmiştir. Ünvanı Adı soyadı imza
Başkan: Doç. Dr. İsa GÖKÇE
Üye: Yrd. Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ
Üye: Yrd Doç. Dr. Lokman ÖZTÜRK
ONAY:
Bu tez 07/09/2007 tarih ve 32 sayılı Enstitü Yönetim Kurulu tarafından belirlenen jüri üyelerince kabul edilmiştir.
/ /2007
Prof. Dr. Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü
ÖZET
TAFLAN (Laurocerasus officinalis Roem.) BİTKİSİNİN MEYVE, ÇEKİRDEK VE YAPRAKLARININ MEVSİM DEĞİŞİKLİĞİNE GÖRE ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN BELİRLENMESİ VE FENOLİK BİLEŞİK TAYİNİ
MEHMET SONER ENGİN Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi, 51 sayfa
Danışman: Yrd. Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ
Jüri: Doç. Dr. İsa GÖKÇE Jüri: Yrd. Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ
Jüri: Yrd. Doç. Dr. Lokman ÖZTÜRK
Günümüzde antioksidanların gıda sanayinde kullanımı oldukça yaygın olup hemen hemen tükettiğimiz her ürüne antioksidan maddeler katılmaktadır. Bunlar gıdaları bozulmaya karşı korumakta olup onların daha uzun süreli saklanmasını sağlar, bunlardan bazıları bütillenmiş hidroksi toluen (BHT) ve bütillenmiş hidroksi anisol (BHA) bileşikleridir ancak bunların toksik etkilerinden şüphelenilmektedir. Bu nedenle son yıllarda yeni, daha güvenli ve ucuz antioksidan maddelerin bulunması için doğal ürünler üzerinde yaygın çalışmalar yapılmaktadır
Antioksidanlar vücutta çok kısa ömürlü fakat saldırgan olan serbest radikaller diye adlandırılan moleküllerle savaşırlar. Eğer serbest radikaller nötralize edilmezlerse vücutta ciddi hasarlara neden olabilirler.
Bu çalışmada taflan bitkisinin yaprak, meyve ve çekirdeklerinin hasat döneminin antioksidan kapasite ve fenolik bileşiklerin üzerine etkisi araştırılması amaçlanmıştır. Bitki kısımlarının etil alkol ekstresi hazırlandı, bu ekstrelerin total antioksidan aktivite, serbest radikal giderme aktivite, fenolik bileşik tayini ve indirgeme gücü aktiviteleri belirlendi.
Bu çalışmada elde edilen sonuçlara göre taflan bitkisinin yaprak, meyve ve çekirdeklerinin antioksidan kapasitesi hasat döneminin etkisi olmadığı görülmüştür. Ayrıca taflan bitkisinin antioksidan kapasitesinin en yüksek olan kısmın yaprakları olduğu sonucuna varılmıştır.
ABSTRACT
EFFECT OF THE CLIMATIC CHANGES ON ANTIOXIDANT ACTIVITY AND FENOLIC COMPOUNDS OF LAUROCERASUS OFFICINALIS ROEM
MEHMET SONER ENGİN Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Science Department of Chemistry Science
Master Thesis, 51 Pages
Supervisor: Asst. Prof. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ
Jury: Associate Prof. Dr. İsa GÖKÇE Jury: Asst. Prof. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ
Jury: Asst. Prof. Dr. Lokman ÖZTÜRK
At the present time, the antioxidants are widely used at the nutrient industry and they are added nearly to every products consumed by the human beings. The antioxidants protect the foods against to decay and enable to keep them for a long time. Some of them are butylated hydroxytoluene (BHT) and butylated hydroxyanisol (BHA) compounds; however, their toxic effects are not clear. For this reason, at the present time to get more trustworthy and cheaper antioxidants, the studies on the natural sources have an increase.
The antioxidants struggle with the molecules called as free radicals which are harmful but don’t have a long lifetime in an organism. If the free radicals are not taken under control, they may cause serious harm in the organism.
In this study, the objective is to evaluate the effect of climatic changes on the antioxidant activity and fenolic compounds of Laurocerasus officinalis roem. For this purpose, ethanolic extract of Laurocerasus officinalis roem. was prepared and total antioxidant activity, DPPH activity and reduction power activity were carried out for determination of antioxidant capacity. According to the results, it was obtained that there is no effect of climatic changes on the antioxidant capacity and total fenolic compound. In addition, it was observed that the highest antioxidant capacity of this plant was its leaves.
TEŞEKKÜR
Çalışmalarım boyunca değerli yardım ve katkılarıyla beni yönlendiren sayın hocam Yrd. Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ ’a, yine bu çalışmayı destekleyen, deneylerimde ve çalışmalarımda kıymetli tecrübelerinden faydalandığım Doç. Dr. İsa GÖKÇE, Doç. Dr. İbrahim DEMİRTAŞ, Öğr. Gör. Dr. Ramazan ERENLER, Arş. Gör.Dr. Ömer IŞILDAK ’a ve Arş. Gör. Sema BİLGİN ’e teşekkürü bir borç bilirim. Ayrıca yüksek lisans süresince maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen aileme ve değerli eşim AYŞEN ENGİN ‘e teşekkür ederim.
İÇİNDEKİLER ÖZET ... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR ... iii İÇİNDEKİLER ... iv ŞEKİLLER LİSTESİ ... vi 1. GİRİŞ VE LİTERATÜR ÖZETİ... 1 1.1. Yayılma Alanı ... 1
1.2. Karayemişin Bitki Ve Meyve Özellikleri ... 2
1.3. İklim Ve Toprak İstekleri ... 4
1.4. Karayemişin Kullanım Alanları Ve Sağlık Açısından Önemi ... 5
1.4.1. Kullanım Alanları ... 5
1.4.2. Sağlık Açısından Önemi ... 6
1.5.Literatür Özeti... 7
2.SERBEST OKSİJEN RADİKALLERİ VE ANTİOKSİDANLAR ... 7
2.1. Reaktif Oksijen Türleri Ve Etkileri ... 7
2.1.1. Yaşam İçin Oksijen (O2)... 7
2.1.2. Moleküler Oksijenin Özellikleri ... 8
2.1.3. Reaktif Oksijen Türleri (ROT) ... 9
2.1.4. Süperoksit Radikali (O2⋅⋅⋅⋅−−−−) ... 9
2.1.5. Hidrojen Peroksit (H2O2) ... 11
2.1.6. Hidroksil Radikali (OH••••)... 12
2.1.7. Hücrede Reaktif Oksijen Türlerinin (ROT) Kaynağı ... 12
2.1.8. Serbest Oksijen Radikallerinin Etkileri ... 19
2.1.9. Serbest Radikallerin Lipidlere Etkileri... 21
2.1.11. Serbest Radikallerin Nükleik Asitler Ve DNA’ya Etkileri... 24
2.1.12. Serbest Radikallerin Karbonhidratlara Etkileri ... 25
2.2. Serbest Radikallere Karşi Hücresel Savunma (Antioksidant Savunma Sistemleri,Antioksidantlari)... 25
2.3. Antioksidan Sistem ... 27
2.3.1. Endojen Antioksidanlar ... 28
2.3.1.1. Enzim Olan Endojen Antioksidantlar ... 28
2.3.1.2. Enzim Olmayan Endojen Antioksidantlar ... 29
2.3.2. Eksojen Antioksidantlar ... 29
2.3.2.1.Vitamin Eksojen Antioksidantlar ... 29
2.3.2.2. İlaç Olarak Kullanılan Eksojen Antioksidantlar... 30
2.3.2.3. Gıdalardaki Eksojen Antioksidantlar ... 30
2.4. Oksidatif Stres ... 30
2.4.1. Oksidatif Stres Araştırmaları ... 32
3. MATERYAL ve METOT... 33
3.1. Materyal... 33
3.2. Kullanılacak Kimyasal Madde, Malzeme Ve Cihazlar ... 33
3.3. Cihazlar... 33
3.4. Metot ... 33
3.4.1. Antioksidant Aktivitenin Belirlenmesi ... 34
3.4.2. DPPH Radikal Giderme Aktivitesi (DPPH•: 1,1-Difenil 2-Pikril Hidrazil) .. 34
3.4.3. İndirgeme Gücü ... 35
3.4.4. Total Fenolik Bileşik Tayini ... 35
3.5. Antioksidan Özellik Gösteren Bileşiklerin Saflaştirilmasi... 36
4. SONUÇ VE TARTIŞMA ... 37
4.1. Total Antioksidan Aktivite ... 37
4.2. Dpph Radikal Giderme Aktivitesi... 40
4.3. İndirgeme Gücü... 44
4.4. Fenolik Bileşik Tayni ... 46
5. KAYNAKLAR ... 49
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil Sayfa
1. Taflan Ağacının Yaprakları ... ...3
2. Taflan Meyvesinin Çiçekleri ... 3
3. Taflan Ağacının Meyvesi... 4
4. Stoplazmik Membrandaki Nötrofillerin Bir Kısmı ... 15
5. Serbest Radikallerin Nötralizasyonu ... 16
6. Membrandaki Hidroksilasyon ... 19
7. Serbest Radikallerin Hücreye Etkileri... 20
8. Reaktif Oksijen Türlerinin Zararı... 21
9. Yağ Asidi Zincirinin Bir Lipid Radikali Niteliği Kazanması... 22
10. Lipid Peroksidasyonu ... 23
11. Malondialdehit ... 23
12. Antioksidanların Hücredeki Etkileri ... 26
13. Serbest Radikallerin Nötralizasyonu ... 27
14. Oksidatif Stress... 31
15. Taflan Bitkisinin Yaprağının Olgunlaşma Evrelerine Göre Total Antioksidan Aktivitesi... 38
16. Taflan Bitkisinin Meyvesinin Olgunlaşma Evrelerine Göre Total Antioksidan Aktivitesi ... 39
17. Taflan Bitkisinin Çekirdeğinin Olgunlaşma Evrelerine Göre Total Antioksidan Aktivitesi... 40
18. Taflan Bitkisinin Yaprağının Olgunlaşma Evrelerine Göre Dpph Radikal Giderme (%) Aktivitesi ... 41
19. Taflan Bitkisinin Meyvesinin Olgunlaşma Evrelerine Göre Dpph Radikal Giderme (%) Aktivitesi ... 42
20. Taflan Bitkisinin Çekirdeğinin Olgunlaşma Evrelerine Göre Dpph Radikal Giderme (%) Aktivitesi ... 42
21. Kolon Kromatoğrafisi Sonrası Dpph Radikal Giderme Aktivitesi... 43
Şekil Sayfa 23. Taflan Bitkisinin Meyvesinin Olgunlaşma Evrelerine Göre Indirgeme Gücü... 45 24. Taflan Bitkisinin Çekirdeğinin Olgunlaşma Evrelerine Göre Indirgeme Gücü .. 45 25. Kolon Kromatoğrafisi Sonrası Total Indirgeme Gücü ... 46 26. Total Fenolik Hesaplanmasında Kullanılan Kalibrasyon Grafiği... 47
1. GİRİŞ VE LİTERATÜR ÖZETİ
Karayemiş bitkiler alemi içerisinde Laurocerasus officinalis olarak bilinmektedir. Bu meyve türü ülkemizde taflan adıyla da tanınmaktadır. Bitkinin tabi yayılma alanı Karadeniz’in doğu bölgeleri, Kafkaslar, Toroslar, Kuzey ve Doğu Marmara’dır. Genel olarak ılıman iklim bölgelerinin meyvesidir. Bu bakımdan en iyi karayemişler Karadeniz bölgesinin sahil kuşağında yetiştirilmektedir. Gövde ve dalları kış soğuklarına dayanıklıdır. Ancak çiçekler, erken ilkbaharda açtığından donlara karşı hassastır. Bu nedenle ilkbahar donların sık görüldüğü yerlerde yetiştiricilik oldukça güçtür.
1.1. Yayılma Alanı
Bitkinin doğal yayılma alanı Anadolu’da Karadeniz’in doğu bölgeleri, Toroslar, Kuzey ve Doğu Marmara ve Kafkaslardır. Avrupa’nın güneydoğusu, Balkanlar ve Kuzey İran başta olmak üzere dünyanın değişik yörelerinde karayemiş formlarına rastlanılmaktadır. Yurdumuzda karayemişin değişik formlarına şu bölgelerde rastlamak mümkündür:
• Karadeniz Bölgesi’nde; Rize dolaylarında, Trabzon çevresinde, Maçka Meryemana Vadisi’nde, Giresun, Samsun, Sinop (Ayancık), Zonguldak (Devrek), Kastamonu, Bartın ve Bolu çevresindeki yapraklı orman ve orman kıyılarında rastlanır.
• Marmara Bölgesi’nde; İzmit (Keltepe), Adapazarı dolaylarında, İstanbul çevresinde Belgrat Ormanları’nda ve Alemdağ’da, Bursa Uludağ’da ve Karadeniz kıyısı yakınlarındaki ormanlarda rastlanır.
• Güney Anadolu’da; Osmaniye’de Gâvur Dağları’nda ve lokal olarak ta Amanos Dağları’nda yer alır.
Karayemiş ağaçları bu sayılan bölgelerdeki yapraklı ağaç, özellikle kayın ormanlarında alt örtü olarak daha çok boylu çalı veya ağaççık formunda ya da makilerle
karışmış bir tür olarak bulunur. Yenilebilen formlar olan kültür karayemişlerine özellikle Doğu Karadeniz bölgesinde hemen her yerde rastlamak mümkündür.
1.2. Karayemişin Bitki ve Meyve Özellikleri
Bitkinin teşhisi: Regnum: Plantae Bölüm: Spermatophyta Alt bölüm: Angiospermae Sınıf: Magnoliatae (Dicotyledones) Familya: Rosaceae
Cins: Laurocerasus Duhamel. Tür: Laurocersus officinalis Roemer
Yaz – kış yaprağını dökmeyen (her dem yeşil) boylu çalı veya ağaç halinde bulunur. Yabanileri genellikle çalı formunda bulunur. Yetiştiriciliği yapılan çeşitler ise 5 – 8 m kadar boylanabilmektedirler. Derine giden kuvvetli bir kök sistemi vardır. Düzgün ve genellikle dik bir gövde yapar. Gövde grimsi siyah, donuk siyah renktedir. Sert odun dokusu ve kuvvetli bir dal sistemi vardır (İslam ve Bostan, 1996; İslam, 2004).
Dalcıkların uçlarına doğru çiçek salkımı görülür. Bunlar yaprak koltuğundan çıkar. Açık yeşil renkteki sürgünleri tüysüzdür. Boyları 5 – 25 cm uzunlukta olan yapraklar, elips ya da uzunca yumurta biçiminde, kısa saplı, sivri uçlu, tam kenarlı veya düzensiz seyrek dişlidir. Uzun şerit halindeki yapraklar deri gibi serttir. Üst yüzü parlak koyu yeşil renkte, alt yüzü açık solgun yeşil renkte ve tüysüzdür (şekil 1) Yaprak orta damarı alt yüzde bariz bir çıkıntı yapar. Yaprağın alt bölümünde 2 – 4 tane beze bulunur. Beyaz renkli çiçekler 5 – 15 cm boyundaki bir eksen üzerinde, dik duran bir salkımda toplanmışlardır. Her bir çiçek üzerinde 5 çanak yaprak, 5 taç yaprak, 1 dişi organ ve 15 – 20 erkek organ bulunur (şekil 2). Meyveleri çekirdekli, sulu ve 6 – 25 mm boyundadır. Önceleri yeşil renkte olan meyveler olgunlaşınca tiplere göre mor siyah renkli, bazen açık veya koyu kırmızı, bazı çeşitlerde de sarı – kırmızı alacalı olmakla beraber genellikle
siyaha yakın koyu bir renk alır. Kiraz iriliğinde olan meyveler şekil olarak da genellikle kiraza benzemekte, kalp şeklinde, küt veya sivri uçlu, hafif uzun veya üsten basık ve bazen de üzüm taneleri gibi yuvarlak olabilmektedir (şekil 3). Çekirdek düzgün, sivri zeytin biçimindedir. Meyveleri tatlı, buruk ve acı arasında değişen yeme özelliklerine sahiptir (İslam ve Bostan, 1996; İslam, 2004).
Şekil 1. Taflan ağacının yaprakları
Şekil 3. Taflan ağacının meyvesi
1.3. İklim ve Toprak İstekleri
Anavatanı olması bakımından Karadeniz’in kıyı bölgesi karayemiş yetiştiriciliği bakımından uygun iklim özelliklerine sahiptir. İyi gelişme göstermesi ve bol ürün vermesi nemli, güneşli, ılıman iklim bölgelerinde olmaktadır. Erken çiçek açtığından (çeşit özelliği ve rakım durumuna bağlı olarak Şubat – Mart aylarında çiçek salkımları görülemeye başlar) ilkbahar geç donlarından zarar görebilmektedir. Bazı yıllar verimin az olmasının nedeni buna bağlanabilir. Yine tozlanma zamanı görülen sisler birtakım olumsuzluklara yol açabilmektedir. Hemen her çeşit toprakta yetişebilir. Havalanması iyi, derin topraklarda bol ürün verir. Genel olarak derin, iyi havalanan, nemli, humuslu – killi – kumlu topraklarda yetişir. Taşlık, kayalık arazilerde de yetişebilir. pH yönünden asidik topraklarda yetişse de kireçli topraklara da tolerans gösterir (İslam ve Bostan, 1996; İslam, 2004).
1.4. Karayemişin Kullanım Alanları ve Sağlık Açısından Önemi
Karayemişin kullanılan kısımları yaprağı, çekirdeği ve meyvesidir. Yapraklarda şeker, tanen, kalsiyum oksalat ve önemli oranda prulaurasin isimli siyanogenetik bir glikozit bulunur. Bu glikozitin miktarı yaprağın gençliği nispetinde fazladır. Bunlardan başka emulsin isimli bir ferment bulunur. Bu ferment glikozite tesir ederse onu benzaldehit siyanhidrin ve glikoza parçalar. Bunlardan başka benzoik asit ve siyanidrik asit gibi maddeler (zehirli maddeler) de bulunur. Meyvelerde bu siyanogenetik glikozit ve dolayısıyla HCN bulunmamaktadır. Meyveleri üzerinde yapılan çalışmalarda karayemişte mineral maddelerin ve antioksidan maddelerin bol miktarda, buna karşın bakır ve çinko gibi ağır ve zararlı metallerin ise çok düşük miktarlarda bulunduğu tespit edilmiştir. Buna göre 1 kg karayemişte 2215 mg potasyum, 55 mg sodyum, 179 mg magnezyum, 153 mg kalsiyum, 0.8 mg bakır, 1.9 mg çinko, 8.3 mg demir ve 24.2 mg mangan bulunduğu tespit edilmiştir (İslam ve Bostan, 1996; İslam, 2004).
1.4.1. Kullanım Alanları
Meyvesi taze olarak tüketilir. Ayrıca reçel, pekmez, tuzlama, turşu ve kurutularak da değerlendirilir.
• Tokluk hissi verdiğinden diyet yiyeceği olarak kullanılır.
• Pasta, kek, bisküvi ve özellikle hoşaf ve kompostolara aroma ve tat vermek için kullanılır.
• Bazı ilaçların yapımında katkı maddesi olarak da kullanılır.
• Yapraklar çiçekçilikte çelenk yapımında, balık tezgahlarının süslenmesinde kullanılır. • Yaprakları domates, biber ve patlıcan gibi sebzelerin fidelerinin toprağa dikilmesi esnasında kök etrafına sarılmak suretiyle danaburnu ve diğer zararlıların zarar yapmasını yani fidenin köklerini kesmesini engellemek amacıyla kullanılır.
• Park ve bahçelerde süs bitkisi olarak kullanılır. Ayrıca sık budanmaya uygun olduğundan çit bitkisi olarak da kullanılır.
• Derine giden kök yapısı nedeniyle çay ve fındık bahçelerinin veya evlerin rüzgar alan yönüne dikilerek rüzgâr kıran olarak kullanılır.
• 3 – 4 yaşlı dalları Doğu Karadeniz Bölgesi’nde sepet yapımında kullanılmaktadır (İslam ve Bostan, 1996; İslam, 2004).
1.4.2. Sağlık Açısından Önemi
• Mide ülseri ve bağırsak tembelliğini giderir. Nefes darlığına iyi gelir. • İdrar söktürür, taş dürücüdür, hemoroite iyi gelir.
• Çekirdeği ile beraber yendiğinde böbreklerden taş düşürücü olarak (halk tarafından) kullanılmaktadır.
• Sigaraya karşı isteksizlik doğurur.
• Meyveler çekirdekleriyle toz edildikten sonra balla karıştırılır, bronşite iyi gelir.
• Yaprakları, çiçek açma döneminde zehirlidir. Gelişmesini tamamlayan taze yaprakları elle toplanıp destile edilerek eczacılıkta kullanılan Laura Cerasin maddesi elde edilir. Karayemişin taze ve genç yapraklarından elde edilen bu karayemiş suyu halk hekimliğinde yatıştırıcı, öksürük kesici, bulantı ve karın ağrılarını dindirici olarak kullanılır.
• İnsülin hormonunu geliştirir. Spazm çözüdür (sindirim sistemi).
• Kandaki asit – baz dengesini sağlar. Kalp çarpıntısını gidermek ve kan şekerini düşürmek için kullanılır.
• Dişleri korur. Kemik yapısını geliştirir. • Kasların düzenli çalışmasını sağlar. • Demir eksikliğini giderici özelliği vardır.
• Karayemişteki antioksidanlar, alzheimer, diyabet, doku ve cilt hastalıklarına karşı ve vücuttaki hücre yenilenmesi ile kansere karşı etkilidir.
• Karayemiş antioksidan özelliğiyle yaşın ilerlemesiyle vücutta meydana gelen oksidatif zararı azaltarak yaşlanmayı geciktirir (İslam ve Bostan, 1996; İslam, 2004).
Karayemişin tüm bu özellikleri düşünüldüğünde antioksidan karakterli bileşiklerin aktivitelerini inceleme ve saflaştırmanın önemi daha da artmıştır.
1.5. Literatür özeti
Antioksidan aktivite gösteren çok fazla bileşik vardır. Üzüm çekirdeğinde bulunan “resveratrol” bir non-flavonoid olup antioksidan karakterlidir. Hayvan deneyleri ve in vitro çalışmalarda resveratrol’ ün kardiyovasküler hastalıkları ve kanser riskini azalttığı ve bunu yüksek antioksidan kapasitesi ile meydana getirdiği kanıtlanmıştır (Belguendouz, et al., 1998 ; Clement et al., 1998)
Proanthocyanidinler bir floavon türevi olup antioksidan özellik göstermektedirler ve serbest radikal toplayıcı özellikleri yanında (Bagchi, et al.,1997; Bombardelli, et al., 1997) anti-inflammatuar, anti-allerjik, damar sertleşmesi, anti-viral ve anti-bakteriyel etkileri rapor edilmektedir (Bagchi, et al., 1997; Bagchi, et al., 1998).
2. SERBEST OKSİJEN RADİKALLERİ VE ANTİOKSİDANLAR
2.1. Reaktif oksijen türleri ve etkileri
2.1.1. Yaşam İçin Oksijen (O2)
Havasız yerde yaşayamayız. Yaşamımızı sürdürmek için havanın moleküler oksijenini (O2) tükettiğimizi biliyoruz. Total oksijen tüketimimizin %90'ından fazlasından
elektron transport zinciri (solunum zinciri), %5-10'undan da diğer oksijen gerektiren reaksiyonlar sorumludur. Elektron transport zincirinde moleküler oksijen, yakıtlardan (glukoz, yağ asidi ve amino asitlerin karbon iskeleti) türeyen NADH ve FADH2'den
elektronları alarak suya indirgenir. Bu yolda oksijen molekülünün kuvvetli oksitleyici gücü, ATP'nin yüksek enerjili fosfat bağı haline dönüştürülür.
Moleküler oksijen gerektiren fakat ATP' nin oluşumu reaksiyonuyla eşleşmeyen diğer reaksiyonlar, aminoasitlerin katabolizması, ilaçların detoksifikasyonu ve steroid hormonların sentezi gibi spesifik metabolik yollar için önemlidirler. Bu reaksiyonlarda diğer oksidazlar (oksijeni suya veya hidrojen perokside indirgeyen enzimler) ve oksijenazlar (oksijeni okside olan moleküle bağlayan enzimler) görev alırlar (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
2.1.2. Moleküler Oksijenin Özellikleri
Moleküler oksijen (O2), paralel spin durumlu iki ortaklanmamış (eşleşmemiş)
elektrona sahiptir. Ortaklanmamış (eşleşmemiş) elektron içeren atom, atom grubu veya moleküller serbest radikal olarak tanımlanırlar. Ancak Fe3+, Cu2+, Mn2+ ve Mo5+ gibi geçiş metalleri de ortaklanmamış elektronlara sahip oldukları halde serbest radikal olarak kabul edilmezler, fakat serbest radikal oluşumunda önemli rol oynarlar. Serbest radikaller pozitif yüklü (katyon), negatif yüklü (anyon) veya elektriksel olarak nötral olabilirler.
Serbest radikal tanımına göre moleküler oksijen, bir biradikal (diradikal) olarak değerlendirilir. Biradikal oksijen, radikal olmayan maddelerle yavaş reaksiyona girdiği halde diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girer. Biradikal oksijenin elektronlarından birinin enerji alarak kendi spininin ters yönünde olan başka bir orbitale yer değiştirmesiyle singlet oksijen oluşur. Singlet oksijen, eşleşmemiş elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif oksijen molekülüdür, delta ve sigma olmak üzere iki şekli vardır.
Organizmada geçiş metallerini (Fe2+ ve Cu+ gibi metaller) içeren enzimler vasıtasıyla moleküler oksijene tek elektronların transferi suretiyle oksidasyon reaksiyonları meydana gelir. Moleküler oksijen, biradikal doğasının bir sonucu olarak yüksek derecede reaktif oksijen türleri (ROT) oluşturma eğilimindedir (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
2.1.3. Reaktif Oksijen Türleri (ROT)
Reaktif oksijen türleri (ROT), normal oksijen metabolizması sırasında az miktarda oluşan süperoksit radikali (O2⋅⋅⋅⋅−−−−), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil radikali (OH••••)'dir. O2 e -O2 moleküler oksijen süperoksit radikali e- ,2H+ H2O2 e - , H+ H2O + OH hidroksil radikali e- , H+ H2O
Reaktif oksijen türleri, çeşitli serbest radikallerin oluştuğu serbest radikal zincir reaksiyonlarını başlatabilirler ve hücrede karbon merkezli organik radikaller (R•), peroksit
radikalleri (ROO•), alkoksi radikalleri (RO•), tiyil radikalleri (RS•), sülfenil radikalleri
(RSO•), tiyil peroksit radikalleri (RSO
2•) gibi çeşitli serbest radikallerin oluşumuna neden
olurlar (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
2.1.4. Süperoksit Radikali (O2⋅⋅⋅⋅−−−−)
Süperoksit radikali (O2⋅⋅⋅⋅−) hemen tüm aerobik hücrelerde moleküler oksijenin (O2)
bir elektron alarak indirgenmesi sonucu oluşur. İndirgenmiş geçiş metallerinin otooksidasyonu süperoksit radikali meydana getirebilir.
Fe3+ +
+ O2 Cu2+ + O2
Fe2+ + O2 O2
Cu+
Süperoksit radikali kendisi direkt olarak zarar vermez. Bu radikal anyonun asıl önemi, hidrojen peroksit kaynağı olması ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmasıdır. Süperoksit radikali düşük pH değerlerinde daha reaktifdir, oksidan perhidroksi radikali (HO2•) oluşturmak üzere protonlanır.
O2
+H+
HO2
Süperoksit radikali ile perhidroksi radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside olur diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonunda moleküler oksijen ve hidrojen peroksit meydana gelir.
HO2 + O2 + H+ O2 + H2O2
Süperoksit radikali hem oksitleyici hem indirgeyici özelliğe sahiptir. Örneğin ferrisitokrom c ya da nitroblue tetrazolium ile reaksiyonunda indirgeyici olarak davranarak bir elektron kaybeder ve moleküler oksijene okside olur.
sit c(Fe3+) + O2 O2 + sit c (Fe 2+)
Süperoksit radikali epinefrinin oksidasyonunda oksidan olarak davranarak bir elektron alır ve hidrojen perokside (H2O2) indirgenir.
Süperoksit radikalinin fizyolojik bir serbest radikal olan nitrik oksit (NO•) ile
birleşmesi sonucu bir reaktif oksijen türü olan peroksinitrit (ONOO−) meydana gelir.
Peroksinitrit, nitrit (NO2−) ve nitrat (NO3−) oluşturmak üzere metabolize edilir.
Peroksinitrit, azot dioksit (NO2•), hidroksil radikali (OH•), nitronyum iyonu (NO2+) gibi
toksik ürünlere dönüşebilir ki nitrik oksitin (NO•) zararlı etkilerinden peroksinitrit
sorumludur (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999)
2.1.5. Hidrojen Peroksit (H2O2)
Hidrojen peroksit (H2O2), süperoksidin çevresindeki moleküllerden bir elektron
alması veya moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması sonucu oluşan peroksitin iki proton (H+) ile birleşmesi sonucu meydana gelir.
O2 + e- + 2H+ H2O2
O2 + 2e- + 2H+ H2O2
Biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi, süperoksidin (O2⋅⋅⋅⋅−)
dismutasyonu ile olur. İki süperoksit molekülü, süperoksidin dismutasyonu reaksiyonunda iki proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluştururlar.
2O2 + 2H+ H
2O2 + O2
Bu reaksiyon, radikal olmayan ürünler meydana geldiğinden dismutasyon reaksiyonu olarak bilinir, ya spontan gerçekleşir ya da süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından katalizlenir. Spontan dismutasyon pH 4,8'de en hızlıdır, enzimatik dismutasyon ise spontan dismutasyonun nispeten yavaş olduğu nötral ya da alkali pH'da daha belirgindir.
Hidrojen peroksit bir serbest radikal olmadığı halde reaktif oksijen türleri (ROT) kapsamına girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynar. Çünkü Fe2+ veya diğer geçiş metallerinin varlığında Fenton reaksiyonu sonucu, süperoksit radikalinin
(O2⋅⋅⋅⋅−) varlığında Haber-Weiss reaksiyonu sonucu en reaktif ve zarar verici serbest oksijen
radikali olan hidroksil radikali (OH•) oluşturur.
Fenton reaksiyonu
Fe+2 + H2O2 Fe+3 + OH + OH
-Haber-weiss reaksiyon
+ H2O2 H
+
O2 + H2O + OH O2
Süperoksit radikalinin yağda çözünürlüğü sınırlı olduğu halde hidrojen peroksit yağda çözünür. Bu nedenle hidrojen peroksit kendisinin oluştuğu yerden uzakta olan fakat Fe2+ içeren membranlarda hasar oluşturabilir (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
2.1.6. Hidroksil Radikali (OH••••)
Hidroksil radikali (OH•), Fenton reaksiyonu ve Haber-Weiss reaksiyonu sonucu
hidrojen peroksitten oluşmaktadır. Ayrıca suyun yüksek enerjili iyonize edici radyasyona maruz kalması sonucunda oluşur.
Hidroksil radikali son derece reaktif bir oksidan radikaldir, yarılanma ömrü çok kısadır. Hidroksil radikali olasılıkla reaktif oksijen türlerinin (ROT) en güçlüsüdür. Oluştuğu yerde tiyoller ve yağ asitleri gibi çeşitli moleküllerden bir proton kopararak tiyil radikalleri (RS•), karbon merkezli organik radikaller (R•), organik peroksitler (RCOO•)
gibi yeni radikallerin oluşmasına ve sonuçta büyük hasara neden olur (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
R-SH + OH + H2O
-CH2- + OH -CH + H2O
RS
2.1.7. Hücrede Reaktif Oksijen Türlerinin (ROT) Kaynağı
Hücrede normal metabolik yollardaki enzimatik reaksiyonlarda enzimlerin aktif yerinde ara ürünler olarak devamlı şekilde serbest radikaller oluşabilir. Bazen bu serbest radikal ara ürünler enzimlerin aktif yerinden sızarlar, moleküler oksijenle kazara etkileşirler ve sonuçta serbest oksijen radikalleri oluşur.
Normalde hücrelerde en büyük serbest oksijen radikali kaynağı mitokondriyal elektron transport zincirinden sızıntıdır. Mitokondri iç zarında yerleşmiş oksidatif fosforilasyon zinciri bileşenleri büyük oranda indirgendiği zaman mitokondriyal süperoksit radikal üretimi artar (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
Endoplazmik retikulum ve nükleer membranda serbest radikal üretimi, membrana bağlı sitokromların oksidasyonundan kaynaklanır.
Birçok enzimin katalitik döngüsü sırasında da serbest radikaller ortaya çıkar. Bu enzimlerden biri ksantin oksidazdır. Ksantin oksidaz hasarlanmamış dokularda bir dehidrojenaz olarak vardır, pürinlerin yıkılım yolunda hipoksantinden ksantin ve ksantinden ürik asit oluşumu basamaklarında elektron akseptörü olarak moleküler oksijenden (O2) daha çok NAD+ kullanır. Oksijensizliğe bağlı olarak ADP'nin ATP'ye
fosforilasyonunun azaldığı durumlarda (iskemi durumlarında) ADP yıkılır ve pürin bazı, ksantin oksidazın bir oksidaz olarak etkili olmasıyla hipoksantine dönüştürülür. Ksantin oksidazın oksidaz olarak aktivite göstermesi durumunda hipoksantin ksantine ve ksantin ürik aside dönüşürken moleküler oksijen kullanılmakta, moleküler oksijen hidrojen perokside indirgenmektedir. İskemi durumlarında oksijen seviyesi düşük olduğundan önemli hasar olmaz. Ancak oksijen seviyesi reperfüzyon sırasında normale dönünce iskemi yerinde ksantin oksidaz etkisiyle fazla miktarda hidrojen peroksit (H2O2) ve süperoksit
radikali (O2⋅⋅⋅⋅−) oluşur, bunların etkisiyle de iskemi/reperfüzyon hasarı denen durum ortaya
çıkar. Ksantin oksidazın özellikle intestinal mukoza hücrelerinde görülen iskemi/reperfüzyon hasarında önemli faktör olduğu düşünülmektedir (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
Aldehit oksidaz yapı itibariyle ksantin oksidaza benzer, substratlarının çoğu aynıdır ve süperoksit radikali (O2⋅⋅⋅⋅−) üretir. Dihidroorotat dehidrojenaz, flavoprotein
dehidrojenaz, aminoasit oksidaz ve triptofan dioksijenaz gibi enzimler de serbest radikal oluşmasına neden olurlar.
Peroksizomlar çok önemli hücre içi hidrojen peroksit (H2O2) kaynağıdırlar.
Peroksizomlardaki D-amino asit oksidaz, ürat oksidaz, L-hidroksil asit oksidaz ve yağ asidi açil-CoA oksidaz gibi oksidazlar, süperoksit üretmeden bol miktarda hidrojen peroksit (H2O2) üretimine neden olurlar. Ancak peroksizomlarda, hidrojen peroksidin suya
ayrışmasını katalizleyen katalaz (CAT) enziminin aktivitesi de çok yüksek olduğundan peroksizomlardan sitozole ne kadar hidrojen peroksit (H2O2) geçtiği bilinmemektedir.
Hayvan hücrelerinde askorbik asit, tiyoller, adrenalin ve flavin koenzimleri gibi bazı bileşiklerin otooksidasyonu da süperoksit radikalinin (O2⋅⋅⋅⋅−) bir başka kaynağıdır.
Araşidonik asit metabolizması da reaktif oksijen metabolitlerinin önemli bir kaynağıdır. Fagositik hücrelerin uyarılması, fosfolipaz ve protein kinazın aktivasyonuna ve plazma membranından araşidonik asidin serbestleşmesine yol açar. Araşidonik asidin enzimatik oksidasyonuyla da çeşitli serbest radikal ara ürünleri meydana gelirler.
Araşidonik asit metabolizması sonucu serbest radikal üretimine "enzimatik lipid peroksidasyonu" denir.
Serbest radikallerle prostaglandin metabolizması birbiriyle yakından ilişkilidir. Reaktif oksijen metabolitleri, fosfolipaz aktivasyonu yoluyla prostaglandin E2,
prostaglandin F2, 6-keto prostaglandin F1α ve tromboksan B2 sentezini sağlarlar.
Prostaglandin E2 ve I2 (prostasiklin) de adenilat siklazı aktive ederek cAMP sentezini
artırırlar. PGA, PGE1 ve PGE2'nin burun mukozası damarlarında vazokonstriksiyona neden
olduğu bilinmektedir. Özellikle demir ve bakır olmak üzere geçiş metalleri, fizyolojik şartlarda elektron alış verişi şeklinde gerçekleşen oksidoredüksiyon reaksiyonlarında görev alırlar. Geçiş metalleri bu özellikleri nedeniyle serbest radikal reaksiyonlarını hızlandıran katalizör vazifesi görürler. Demir ve bakır, tiyollerden tiyil sentezini H2O2 ve O2⋅⋅⋅⋅− den OH•
sentezini katalizlerler (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
R-SH + Cu+2 + H+ + Cu+ H2O2 + Fe+2 Fe+3 + OH + OH
-O2 + H2O2 Fe, Cu OH + OH + O2 RS
Mn2+ nın O2⋅⋅⋅⋅− tarafından oksidasyonu Mn3+ veya Mn-Oksijen kompleksinin
oluşumunu sağlar, bunlar da O2⋅⋅⋅⋅− den daha çok oksitleyicidirler. Metal iyonlarının serbest
radikal reaksiyonlarındaki asıl önemi lipid peroksidasyonundaki etkileriyle ilgilidir. Geçiş metalleri lipid peroksidasyonunu başlatmaktan çok, sentezlenmiş olan lipid hidroperoksitlerinin (LOOH) parçalanmalarını ve lipid peroksidasyonunun zincir reaksiyonlarını katalize ederler. Böylece daha az zararlı olan radikalleri daha zararlı hale getirirler.
Lipid-OOH + Fe+2(Cu+) Lipid-O + Fe3+(Cu2+) + OH
-Lipid-OOH + Fe3+(Cu2+) Lipid-OO + Fe2+(Cu+) + H+
Aktive olmuş makrofajlar, nötrofiller ve eozinofillerde fagositik solunumsal patlama sırasında da çeşitli serbest radikaller oluşur.
Fagositik lökositler opsonize mikroorganizmalar, C5a kompleman faragmanı, lökotrien B4, bakteriyel orijinli N-formil oligopeptitler gibi partiküler ya da çözünebilir bir
uyarıcıyla uyarıldıklarında lizozomal komponentleri dışarıya vermeye başlarlar ve reaktif oksijen metabolitlerinin oluşumuyla birlikte mitokondri dışında oksijen tüketiminde bir patlama (solunumsal patlama) gösterirler. Fagosite edilmiş bakteri, solunumsal patlama ürünlerinin etkisiyle öldürülür. Ancak bu oksidan ürünler hücrelerin antioksidan savunma güçlerini aştığında normal konak hücrelere zarar verirler ve çeşitli hastalıkların patogenezinde rol oynarlar.
Fagositlerin uyarılması, heksoz monofosfat şantı yoluyla glukozun oksidasyonunda artışa yol açar. Solunumsal patlama sırasında elektron vericisi olarak NADPH kullanılır ve moleküler oksijenin (O2) süperoksit radikaline (O2⋅⋅⋅⋅−) indirgenmesi
sonucu NADP+ üretimi artar ve heksoz monofosfat yolu aktive olur. Heksoz monofosfat yolunun aktivasyonuna neden olan NADP+ nin diğer kaynağı hidrojen peroksidin (H2O2)
detoksifikasyonundan sorumlu olan glutatyon peroksidaz-glutatyon redüktaz sistemidir.
Şekil 5.Serbest radikallerin nötralizasyonu
Nötrofiller ve monositlerin primer lizozomal granüllerinde Fe-hem içeren miyeloperoksidaz enzimi bulunur. Çeşitli uyarıcıların etkisiyle fagositler miyeloperoksidaz içeren granüllerini ekstrasellüler aralıktaki fagositik vakuol içine boşaltırlar. Miyeloperoksidaz, hidrojen peroksit (H2O2) varlığında klorür, iyodür ve bromürün
asit (HOBr) oluşturur. Bu bileşikler ve bunların tuzları güçlü oksidanlardır, biyolojik olarak önemli moleküllerle reaksiyona girerek mikroorganizmayı etkileyen toksik ajanlar meydana getirirler.
Fagositin kendisi de reaktif oksidanların zarar vermelerine karşı hassastır. Bununla birlikte kendilerini oksidanlarına karşı koruyabilirler. Fagositlerin antioksidan sistemleri, süperoksidi hidrojen perokside dönüştüren süperoksit dismutaz (SOD), hidrojen peroksidi suya indirgeyen katalaz (CAT), hidrojen peroksidi detoksifiye edici glutatyon peroksidaz-glutatyon redüktaz sistemi, antioksidan vitaminlerden α-tokoferol (vitamin E) ve askorbik asit (vitamin C) gibi antioksidanlardır. Nötrofillerden toksik ajanların sızıntısı veya sekresyonu, yakın hücrelere ve çözücü sistemlere zarar verir. Fagosit kaynaklı oksidanlar ototoksik, immünosupresif ve mutajenik etkiler gösterirler. Örneğin romatoit artritli (RA) hastaların diz eklemlerinde fazla miktarda nötrofil birikir ve bu nötrofillerden ortama salıverilen serbest radikaller eklem hasarını hızlandırırlar.
Bazı yabancı toksik maddeler hücrede serbest radikal üretimini artırırlar. Bu maddeler ya doğrudan serbest radikal üretirler ya da serbest radikallerin ortadan kaldırılmasını sağlayan antioksidan aktiviteyi düşürürler. Bu tip maddeler dört grupta toplanabilirler:
1) Toksinin kendisi bir serbest radikaldir. Örneğin kirli havanın koyu rengini veren azot dioksit gazı (NO2•) böyle bir maddedir. Azot dioksit (NO2•) etkili bir lipid
peroksidasyonu başlatıcısıdır.
Lipid-H + NO2 Lipid + HNO2
2) Toksin bir serbest radikale metabolize olur. Örneğin kuru temizlemede kullanılan toksik bir madde olan karbon tetraklorür (CCl4), karaciğerde sitokrom p450
serbest radikali de moleküler oksijenle (O2) etkileşerek peroksil serbest radikali (CCl3O2•) oluşturur. CCl4 P-450 CCl3 + Cl -CCl3 + O2 CCl3O2
Triklorometil serbest radikali (CCl3•) ve peroksil serbest radikali (CCl3O2•)
kuvvetli lipid peroksidasyonu başlatıcısıdırlar. Böylece reaktif serbest radikal üretimi karaciğerde antioksidan savunmaları aşar, sellüler membranlarda oksidatif yıkım ve ciddi doku hasarı meydana gelir.
3) Toksinin metabolizması sonucu serbest oksijen radikali meydana gelir. Örneğin özellikle karaciğerde biriken paraquat bir serbest radikale indirgendikten sonra tekrar yükseltgenerek rejenere edilirken oksijen indirgenir ve böylece bol miktarda süperoksit radikali (O2⋅⋅⋅⋅−) üretilmiş olur.
Diyabetik bir ajan olan alloksan da paraquat gibi etki eder. Antikanserojen bir madde olan doksorubicin de DNA replikasyonunu inhibe ederken olasılıkla önemli miktarda süperoksit radikali (O2⋅⋅⋅⋅−) ve hidroksil radikali (OH•) üretimine neden olur. Birçok
endojen bileşiğin ve ksenobiyotiğin hidroksilasyonunu, endoplazmik retikulum membranında yerleşmiş iki üniteden oluşmuş bir hem proteini olan sitokrom P450 katalize eder.
Şekil 6. Membrandaki hidroksilasyon
Bu reaksiyonlarda oksijen kaynağı olarak moleküler oksijen kullanıldığı gibi peroksitler (ROOH) de kullanılabilir. Ancak, alkol ve asetonla indüksiyonunda olduğu gibi bazı hallerde sitokrom P450 aşırı miktarda süperoksit radikali (O2⋅⋅⋅⋅−) üreten bir izoenzime
dönüşür.
4) Toksin antioksidan aktiviteyi düşürür. Örneğin parasetamolün karaciğerde sitokrom P450 tarafından metabolizması antioksidan aktivitede önemli yeri olan glutatyonla reaksiyona giren bir ürün oluşturarak sonuçta glutatyonun miktarını azaltır (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
2.1.8. Serbest Oksijen Radikallerinin Etkileri
Reaktif oksijen türlerinin (ROT) oluşumu enflamasyon, radyasyon, yaşlanma, normalden yüksek parsiyel oksijen basıncı (pO2), ozon (O3) ve azot dioksit (NO2•),
kimyasal maddeler ve ilaçlar gibi bazı uyarıların etkisiyle artar. Serbest radikaller hücrelerin lipid, protein, DNA, karbonhidrat ve enzim gibi tüm önemli bileşiklerine etki ederler.
Süperoksit radikali (O2⋅⋅⋅⋅−) ve hidroksil radikali (OH•) sitoplazma, mitokondri,
nükleus ve endoplazmik retikulum membranlarında lipid peroksidasyonunu başlatır. Membranlarda lipid peroksidasyonu meydana gelmesi sonucu membran geçirgenliği artar. Serbest radikallerin etkisiyle proteinlerdeki sistein sülfhidril grupları ve diğer aminoasit kalıntıları okside olarak yıkılır, nükleer ve mitokondriyal DNA okside olur (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
Şekil 7. Serbest radikallerin hücreye etkileri
Serbest oksijen radikallerinin tüm bu etkilerinin sonucunda hücre hasarı olur. Hücrede reaktif oksijen türlerinin (ROT) ve serbest radikallerin artışı hücre hasarının önemli bir nedenidir. İskemi sonrasında reperfüzyon da reaktif oksijen türlerinin (ROT) artışına bağlı olarak iskeminin oluşturduğu hücre hasarını artırır.
Şekil 8.Reaktif oksijen türlerinin zararı
Serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarının birçok kronik hastalığın komplikasyonlarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Aterogenez, amfizem/bronşit, Parkinson hastalığı, Duchenne tipi musküler distrofi, gebelik preeklampsisi, serviks kanseri, alkolik karaciğer hastalığı, hemodiyaliz hastaları, diabetes mellitus, akut renal yetmezlik, Down sendromu, yaşlanma, retrolental fibroplazi, serebrovasküler bozukluklar, iskemi/reperfüzyon injürisi gibi durumlarda serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarı söz konusudur.
2.1.9.Serbest Radikallerin Lipidlere Etkileri
Lipidler serbest radikallerin etkilerine karşı en hassas olan biyomoleküllerdir. Hücre membranlarındaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları, serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar.
Poliansatüre yağ asitlerinin oksidatif yıkımı lipid peroksidasyonu olarak bilinir. Lipid peroksidasyonu kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve oldukça zararlıdır. Hücre membranlarında lipid serbest radikalleri (L•) ve lipid peroksit
radikallerinin (LOO•) oluşması, reaktif oksijen türlerinin (ROT) neden olduğu hücre
hasarının önemli bir özelliği olarak kabul edilir. Serbest radikallerin sebep olduğu lipid peroksidasyonuna "nonenzimatik lipid peroksidasyonu" denir.
Hücre membranlarında lipid peroksidasyonuna uğrayan başlıca yağ asitleri poliansatüre yağ asitleridir. Lipid peroksidasyonu genellikle yağ asitlerindeki konjuge çift bağlardan bir elektron içeren hidrojen atomlarının çıkarılması ve bunun sonucunda yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanmasıyla başlar.
Şekil 9.Yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanması
Lipid radikali (L•) dayanıksız bir bileşiktir ve bir dizi değişikliğe uğrar. Lipid
radikallerinin (L•) moleküler oksijenle (O
2) etkileşmesi sonucu lipid peroksit radikalleri
(LOO•) oluşur. Lipid peroksit radikalleri (LOO•), membran yapısındaki diğer poliansatüre
yağ asitlerini etkileyerek yeni lipid radikallerinin oluşumuna yol açarken kendileri de açığa çıkan hidrojen atomlarını alarak lipidperoksitlerine (LOOH) dönüşürler ve böylece olay kendi kendini katalizleyerek devam eder.
Şekil 10. Lipid peroksidasyonu
Lipid peroksidasyonu sonucu oluşan lipid peroksitlerinin (LOOH) yıkılımı geçiş metalleri iyon katalizini gerektirir. Plazma membranı ve subsellüler organel lipid peroksidasyonu serbest radikal kaynaklarının hepsiyle uyarılabilir ve geçiş metallerinin varlığında artar. Lokal olarak hidrojen peroksitten (H2O2) Fenton reaksiyonu sonucu
hidroksil radikali (OH•) oluşması zincir reaksiyonunu başlatabilir.
Lipid peroksitleri (LOOH) yıkıldığında çoğu biyolojik olarak aktif olan aldehitler oluşur. Bu bileşikler ya hücre düzeyinde metabolize edilirler veya başlangıçtaki etki alanlarından diffüze olup hücrenin diğer bölümlerine hasarı yayarlar.
Üç veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitlerinin peroksidasyonunda malondialdehit (MDA) meydana gelir.
Şekil 11.Malondialdehit (MDA)
Malondialdehit (MDA) kanda ve idrarda ortaya çıkar, yağ asidi oksidasyonunun spesifik ya da kantitatif bir indikatörü olmamakla beraber lipid peroksidasyonunun
derecesiyle iyi korelasyon gösterir. Bu nedenle biyolojik materyalde malondialdehit (MDA) ölçülmesi lipid peroksit seviyelerinin indikatörü olarak kullanılır.
Nonenzimatik lipid peroksidasyonu çok zararlı bir zincir reaksiyonudur. Direkt olarak membran yapısına ve ürettiği reaktif aldehitlerle indirekt olarak diğer hücre bileşenlerine zarar verir. Böylece doku hasarına ve birçok hastalığa neden olur (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
2.1.10. Serbest Radikallerin Proteinlere Etkileri
Proteinler serbest radikallere karşı poliansatüre yağ asitlerinden daha az hassastırlar. Proteinlerin serbest radikal harabiyetinden etkilenme derecesi amino asit kompozisyonlarına bağlıdır. Doymamış bağ ve kükürt içeren triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi aminoasitlere sahip proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenirler. Bu etki sonucunda özellikle sülfür radikalleri ve karbon merkezli organik radikaller oluşur.
Serbest radikallerin etkileri sonunda, yapılarında fazla sayıda disülfit bağı bulunan immünoglobülin G (IgG) ve albümin gibi proteinlerin tersiyer yapıları bozulur, normal fonksiyonlarını yerine getiremezler. Prolin ve lizin reaktif oksijen türleri (ROT) üreten reaksiyonlara maruz kaldıklarında nonenzimatik hidroksilasyona uğrayabilirler. Hemoglobin gibi hem proteinleri de serbest radikallerden önemli oranda zarar görürler. Özellikle oksihemoglobinin süperoksit radikali (O2⋅⋅⋅⋅−) veya hidrojen peroksitle (H2O2)
reaksiyonu methemoglobin oluşumuna neden olur (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
2.1.11. Serbest Radikallerin Nükleik Asitler ve DNA'ya Etkileri
İyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA'yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Hidroksil radikali (OH•) deoksiriboz ve bazlarla kolayca
hidrojen peroksit (H2O2) membranlardan kolayca geçerek ve hücre çekirdeğine ulaşarak
DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta hücre ölümüne yol açabilir. Süperokside
(O2⋅⋅⋅⋅−) maruz kalan DNA molekülleri hayvanlara enjekte edildiklerinde daha fazla antijenik
özellik gösterirler ki bu oldukça önemli bir etkidir, çünkü otoimmün bir hastalık olan sistemik lupus eritematozusta (SLE) ve romatoit artritte (RA) dolaşımda anti-DNA antikorlar bulunur (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
2.1.12. Serbest Radikallerin Karbonhidratlara Etkileri
Serbest radikallerin karbonhidratlara etkisiyle çeşitli ürünler meydana gelir ve bunlar, çeşitli patolojik süreçlerde önemli rol oynarlar. Diyabet ve diyabet komplikasyonlarının gelişimi, koroner kalp hastalığı, hipertansiyon, cilt hastalıkları, romatoit artrit, behçet hastalığı, çeşitli deri ve göz hastalıkları, kanser gibi birçok hastalıkta ve yaşlılıkta serbest radikal üretiminin arttığı, antioksidan savunma mekanizmalarının yetersiz olduğu gösterilmiştir. Ancak bu hallerde serbest radikal artışının sebep mi yoksa sonuç mu olduğu tam olarak bilinmemektedir (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
2.2. Serbest Radikallere Karşı Hücresel Savunma (Antioksidan Savunma Sistemleri, Antioksidanlar)
Reaktif oksijen türlerinin (ROT) oluşumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için birçok savunma mekanizmaları vardır. Bu mekanizmalar "antioksidan savunma sistemleri" veya kısaca "antioksidanlar" olarak bilinirler.
Şekil 12. Antioksidanların hücredeki etkileri
Antioksidanlar dört ayrı şekilde etki ederler:
1) Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma veya daha zayıf yeni moleküle çevirme toplayıcı etkidir. Antioksidan enzimler, trakeobronşiyal mukus ve küçük moleküller bu tip etki gösterirler.
2) Serbest oksijen radikalleriyle etkileşip onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltma veya inaktif şekle dönüştürme bastırıcı etkidir. Vitaminler, flavanoidler bu tarz bir etkiye sahiptirler.
3) Serbest oksijen radikallerini bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etki zincir kırıcı etkidir. Hemoglobin, seruloplazmin ve mineraller zincir kırıcı etki gösterirler.
2.3. Antioksidan Sistem
Antioksidan sistem; serbest radikalleri hücre zarına, nükleik asitlere (DNA) ve hücre bileşenlerine saldırmadan kendine çeker ve bağlar.
Şekil 13. Serbest radikalin nötralizasyonu
Günümüzde antioksidanların gıda sanayinde kullanımı oldukça yaygın olup hemen hemen tükettiğimiz her ürüne antioksidan maddeler katılmaktadır. Bunlar gıdaları bozulmaya karşı korumakta olup onların daha uzun süreli saklanmasını sağlar, bunlardan bazıları bütillenmiş hidroksi toluen (BHT) ve bütillenmiş hidroksi anisol (BHA) bileşikleridir ancak bunların toksik etkilerinden şüphelenilmektedir. Bu nedenle son yıllarda yeni, daha güvenli ve ucuz antioksidan maddelerin bulunması için doğal ürünler üzerinde yaygın çalışmalar yapılmaktadır (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
Antioksidanlar vücutta çok kısa ömürlü fakat saldırgan olan serbest radikaller diye adlandırılan moleküllerle savaşırlar. Eğer serbest radikaller nötralize edilmezlerse vücutta ciddi hasarlara neden olabilirler.
Sürekli gelişmekte olan teknoloji, oluşan çevre kirliliği, sigara, UV vb. pek çok diğer etken sürekli olarak çeşitli toksik maddelerle karşı karşıya kalmamıza neden olmaktadır. Bu etkiler kendini serbest radikal oluşumuyla gösterir. Tüm bu nedenlerden dolayı dış etkilerle oluşan hastalıklar artmakta, genetik hastalıkların da çevresel etkilerle daha çok belirginleşmesine neden olmaktadır. Bu hastalıklara çözüm getirmek öncelikle bu hastalıkların oluşumunu engellemekle gerçekleşebilir. Bunun için de ilaçlardan öte alınan besinler önem kazanmaktadır. Serbest radikallerin etkilerini önleyen ve gıdalarda bol miktarda bulunması gereken C vitamini ve E vitamini kanser ve kalp hastalıkları gibi toplumda erken ölümlerin başlıca nedenleri olan hastalıkların oluşumunu önlemektedir. Besinlerin dışında dışarıdan yapılacak takviyelerin de yararlı olduğu yapılan doz tespit çalışmalarıyla anlaşılmıştır. Ancak vücudun hassas dengesi alınacak aşırı dozlarla bozulabilmekte, bunun sınırının konabilmesi gerekmektedir (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
Antioksidanlar, endojen kaynaklı veya eksojen kaynaklı olabilirler (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
2.3.1 Endojen Antioksidanlar
Endojen antioksidanlar, enzim ve enzim olmayanlar olmak üzere iki sınıfa ayrılırlar.
2.3.1.1 Enzim Olan Endojen Antioksidanlar şunlardır:
1) Süperoksit dismutaz (SOD). 2) Glutatyon peroksidaz (GSH-Px). 3) Glutatyon S-Transferazlar (GST). 4) Katalaz (CAT).
5) Mitokondriyal sitokrom oksidaz sistemi. 6) Hidroperoksidaz.
2.3.1.2. Enzim Olmayan Endojen Antioksidanlar şunlardır: 1) Melatonin. 2) Seruloplazmin. 3) Transferrin. 4) Miyoglobin. 5) Hemoglobin. 6) Ferritin. 7) Bilirubin. 8) Glutatyon. 9) Sistein. 10) Metiyonin. 11) Ürat. 12) Laktoferrin. 13) Albümin. 2.3.2 Eksojen Antioksidanlar
Eksojen antioksidanlar, vitaminler, ilaçlar ve gıda antioksidanları olmak üzere sınıflandırılabilirler.
2.3.2.1. Vitamin Eksojen Antioksidanlar şunlardır:
1) α-tokoferol (vitamin E). 2) β-karoten.
3) Askorbik asit (vitamin C). 4) Folik asit (folat).
2.3.2.2. İlaç Olarak Kullanılan Eksojen Antioksidanlar şunlardır:
1) Ksantin oksidaz inhibitörleri (allopürinol, oksipürinol, pterin aldehit, tungsten). 2) NADPH oksidaz inhibitörleri (adenozin, lokal anestezikler, kalsiyum kanal blokerleri, nonsteroid antiinflamatuvar ilaçlar, diphenyline iodonium).
3) Rekombinant süperoksit dismutaz. 4) Trolox-C (vitamin E analoğu).
5) Endojen antioksidan aktiviteyi artıranlar (GSH-Px aktivitesini artıran ebselen ve asetilsistein).
6) Nonenzimatik serbest radikal toplayıcılar (mannitol, albümin). 7) Demir redoks döngüsü inhibitörleri (desferroksamin).
8) Nötrofil adezyon inhibitörleri. 9) Sitokinler (TNF ve IL-1). 10) Barbitüratlar.
11) Demir şelatörleri.
2.3.2.3. Gıdalardaki Eksojen Antioksidanlar şunlardır:
1) Butylated hydroxytoluene (BHT). 2) Butylated hydroxyanisole (BHA). 3) Sodium benzoate.
4) Ethoxyquin. 5) Propylgalate.
6) Fe-superoxyde dismutase.
2.4. Oksidatif Stres
Hücrede normal metabolik yollardaki enzimatik reaksiyonlarda enzimlerin aktif yerinde ara ürünler olarak devamlı şekilde serbest radikaller oluştuğunu biliyoruz. Bazen bu serbest radikal ara ürünler enzimlerin aktif yerinden sızmakta, moleküler oksijenle kazara etkileşerek serbest oksijen radikalleri oluşturmaktadırlar.
Hücrede oluşan reaktif oksijen türleri (ROT), "antioksidan savunma sistemleri" veya kısaca "antioksidanlar" olarak bilinen mekanizmalarla ortadan kaldırılırlar. Ancak bazen hücresel savunma mekanizması vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla reaktif oksijen türleri (ROT) oluşabilir. Organizmada Hücresel savunma mekanizması vasıtasıyla ortadan kaldırılandan daha fazla reaktif oksijen türlerinin (ROT) meydana gelmesi oksidatif stres olarak tanımlanır.
Şekil 14.Oksidatif stres
Oksidatif stresin, serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarıyla birçok kronik hastalığın komplikasyonlarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Aterogenez, amfizem/bronşit, Parkinson hastalığı, Duchenne tipi musküler distrofi, gebelik preeklampsisi, serviks kanseri, alkolik karaciğer hastalığı, hemodiyaliz hastaları, diabetes mellitus, akut renal yetmezlik, Down sendromu, yaşlanma, retrolental fibroplazi, serebrovasküler bozukluklar, iskemi/reperfüzyon injürisi gibi durumların patogenezinde oksidatif stresin rolünden söz edilmektedir (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
2.4.1. Oksidatif Stres Araştırmaları
Oksidatif stresin hastalıkların patogenezinde rolü anlaşıldıkça bu alandaki çalışmalar da yoğunlaşmıştır. Oksidatif stres çalışmalarında serbest radikallerin artışı veya antioksidan savunma sistemlerinin yetersizliği araştırılmaktadır. Bunun için plazma, serum, eritrosit, doku örnekleri gibi çeşitli materyallerde analiz yapmaya uygun yöntemler geliştirilmiştir.
Serbest radikaller son derece reaktif ve kısa ömürlüdürler. Bu yüzden direkt olarak ölçülmeleri zordur. Serbest radikalleri direkt olarak ölçen tek analitik teknik spin rezonans spektrometrisidir. Spin rezonans spektrometrisi ileri teknik donanım gerektirir, ayrıca çok duyarlı olmaması ve mikromolar düzeyde sabit konsantrasyonlarda serbest radikaller gerektirmesi nedeniyle kullanımı yaygın değildir (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
Serbest radikal üretimi artışının belirlenmesi için bunların lipidlerle, proteinlerle ve DNA ile reaksiyonları sonucu oluşan çeşitli ürünlerin ölçümü gibi indirekt yöntemler kullanılır. Bu yöntemler arasında lipid peroksidasyonunun son ürünlerinin ölçümü en çok kullanılan yöntemdir.
Hidroksil serbest radikali (OH•) reaksiyon ürünlerinin ölçümü ile tayin edilebilir.
Hidroksil serbest radikali (OH•) salisilik asitle reaksiyona girerek 2,3-dihidroksibenzoat
(2,3-DHB) ve fenilalanin ile reaksiyona girerek o- ve m-tirozinleri oluşturur. Organizma sıvılarında 2,3-dihidroksibenzoat (2,3-DHB) veya o- ve m-tirozinlerin tespiti hidroksil serbest radikalinin (OH•) artışını gösterir. Ancak bu teknik uygulanması zor ve sonuçları
bakımından pek güvenilir değildir (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).
3. MATERYAL VE METOT
3.1. Materyal
Lauroceraus officinalis Roem. bitkisinin meyve, çekirdek ve yaprağı Karadeniz bölgesinin Samsun ilinde toplanmıştır. Bu çalışmada kullanılacak materyaller bitki meyvesinin olgunlaşma evrelerine göre bitkisinin yaprak ve meyveleri, meyvelerinin olgunlaşma önce dönemi, olgunlaşma dönemi ve olgunlaşma sonrası dönemlerinde toplanmıştır.
3.2. Kullanılacak Kimyasal Madde, Malzeme ve Cihazlar
Etanol, Eter, DPPH, Metanol, Linoleic asit, Metiyonin, FeCl3, FeCl2, Etil asetat,
Bütanol, Kloroform, Potasyum dihidrojen fosfat, Dipotasyum hidrojen fosfat, Amonyum Tiyosiyanat, Silika jel, Sephadex LH 20, Beher, Balon, Vezin Kabları vb. laboratuar malzemeleri.
3.3. Cihazlar
Evaporatör, pH metre, Mikro pipet, Manyetik karıştırıcı, Satrifuj, Çeşitli ebatlarda kromatografi kolonları, UV spektrometre, GC-MS.
3.4. Metot
Taflan bitkisinin meyve ve yaprakları toplanıp güneş görmeyen yerde iyice kurutulduktan ve öğütüldükten sonra ekstraksiyon için etil alkol kullanılarak ekstrakte edilir. Daha sonra elde edilen her bir ekstraktin total antioksidan aktivitesi (Mitsuda et al., 1996), serbest radikal (DPPH·) giderme aktivitesi (Blois, 1958), indirgeme gücü aktivitesi (Elmastaş ve ark., 2006), in vitro olarak ölçülür ve total fenolik bileşik tayini spektroskopik olarak (Slinkard, Singleton, 1977) yapılır. Bu aktivitelerin her biri α-tokoferol (vitamin E),
bütillenmiş hidroksi toluen (BHT), bütillenmiş hidroksi anisol (BHA) gibi antioksidan maddelerin antioksidan aktiviteleri ile karşılaştırılır.
Bu işlemler taflan (Laurocerasus officinalis roem.) bitkisinin yaprakları, meyve ve çekirdekleri için ayrı ayrı yapılır.
3.4.1. Total Antioksidan Aktivitenin Belirlenmesi
Bitki ekstraktının antioksidan aktivitesini belirlemek için tiyosiyanat metodu kullanıldı. 1 mg/ml konsontrasyonda olacak şekilde hazırlanan stok çözeltiden, 0,5 ml alınarak vezin kaplarına ilave edilir, üzerine 2,5 ml linoleik asit ve 2 ml tampon çözelti (pH 7.0 , 0.04 M, fosfat tamponu) eklenir. Bu işlemler standartlar (BHA, BHT ve α-tokoferol) içinde yapılır. Karışımlar 37 oC de 5-6 saat süreyle inkübasyona bırakılır. Daha sonra bu numunelerden 50 µl alınır, üzerine 2,35 ml alkol eklenir, 50 µl FeCl2 (ışık almayacak) ve
50 ml amonyum tiyosiyanat eklenir ve 500 nm de absorbans okunur. Kontrol çözelti olarak 2,5 ml linoleik asit üzerine 2,5 ml tampon çözelti konulur. Kör ise numune dışındaki çözeltilerdir (etanol, FeCl2, amonyum tiyosiyanat)Lipid peroksidasyon yüzdesi şu formülle
bulunur (Mitsuda et al., 1996).
% inhibisyon= ( A0-A1) / A0 x 100
A0; kontrol reaksiyonun absorbansı,
A1; numunelerin absorbansı.
3.4.2. DPPH Radikal Giderme Aktivitesi (DPPH•: 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil)
Bitki kısımlarının serbest radikal (DPPH•: 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil) giderme aktiviteleri Blois (1958) metoduna göre yapıldı. Deney kısaca şöyle yapıldı.Her bir tüpe 0,1 mM DPPH (1,1-Difenil 2-pikril hidrazil) in etanol çözeltisinden 1 mL alınarak üzerine stok çözeltiden 80, 120, 160, 200 µl ilave edildi. Toplam hacim 4 mL olacak şekilde etil
alkol ilave edildi. Işık görmeyen yerde 30 dakika inkübe edildikten sonra 517 nm de absorbans okundu. Kör çözelti etil alkol, kontrol çözelti numunesiz çözeltidir. (Blois, 1958)
3.4.3. İndirgeme Gücü
Her bir ekstre 50, 100, 250, 500 µl alınır ve toplam hacim 2,5 ml olacak şekilde tamponla tamamlanır. Daha sonra 2,5 ml K3Fe(CN)6 eklenir ve 50 oC de 20 dk bekletilir.
Sonrasında çıkarılarak oda sıcaklığına getirilir. 2,5 ml TCA eklenir ve 3000 rpm de 10 dk santrifüj edilir.
Süpernatant kısmından 2,5 ml alınır ve üzerine 2,5 ml deiyonize su eklenir. 0,5 ml FeCl3 eklenir ve 700 nm de ölçüm yapılır. Kontrol ekstre dışında kalan kısımdır (2,5 ml
tampon ile başlanır ve sırayla işlemler devam eder) α-tokoferol, BHT , BHA standartlarına da aynı işlemler yapılır. Kör: FeCl3 + su + TCA / FeCl3 + su (Elmastaş ve ark., 2006)
3.4.4. Total Fenolik Bileşik Tayini
Her ekstre için 100 µl (0.1 ml) alınır (50 ml lik balon jojeye). 45 ml deiyonize su ilave edilir. Daha sonra 1 ml folin ciocalteu reaktifi eklenir ve 3 dk beklenir. Son olarak 3 ml %2 lik Na2CO3 ilave edilir ve karışım 2 saat bekletilir. 760 nm de absorbanslar okunur.
Kör: 45 ml su + 1 ml folin ciocalteu + 3 ml % 2 lik Na2CO3 ile 50 ml ye su ile
seyreltilir. Standart (gallik asit): 0,05 mg/ml ; 0,1 mg/ml ; 0,25 mg/ml ; 0,5 mg/ml ; 1 mg/ml lik çözeltileri hazırlanır. Fenolik bileşik tayininde gallik asitle hazırlanan standartlar tıpkı ekstreler gibi inkübe edilir (100 µl alınarak ekstreler gibi çalışılır)(Slinkard, Singleton, 1977).
3.5.Antioksidan Özellik Gösteren Bileşiklerin Saflaştırılması
Yaptığımız deneysel çalışmalar sonucunda olgunlaşma sonrası dönemdeki yaprak numunesinin antioksidan karakterli bileşiklerinin saflaştırmasına karar verildi. Elimizdeki yaprak numunesi (216 g) ekstraksiyon işlemlerine tabi tutulduktan sonra 2 ayrı tüpe ayrıldı.
Elimizdeki ekstraktaki antioksidan karakterli bileşikleri saflaştırmak için kolon kromatoğrafisi yöntemi kullanıldı. Bunun içinde yürütücü faz tayin edilmesi gerektiğinden ince tabaka kromatoğrafisi yöntemi ile yürütücü faz tayin edildi.
Yürütücü faz olarak % 30 luk etilasetat / hegzan içindeki konsantrasyonu belirlendi. Daha sonra tayin için ayırdığımız 2 tüpten 1.si alınarak tartıldı ve 9,3 g madde olduğu tespit edildi. Bu madde etilasetat + alkolde çözüldü, ilk başta karışım silikajel kolondan süzülmeye başlandı. Hareketli faz olarak % 30 luk etilasetat / hegzan kullanıldı.
İlk kolondan süzüldükten sonra süzülen kısım büyük kolona tatbik edildi ve yürütücü faz ile yürütülmeye başlandı. Bir süre sonra fraksiyonlar tüplere alınmaya başlandı ve ince tabaka ile tayin edildi. Yürütücü faz ile gelen fraksiyonlar 68 tane tüpü doldurdu, kolondan gelmeyen kısım etil asetat ile yürütüldü ve 13 tane tüp dolduruldu.
Her bir fraksiyon, orjinal numune standart olarak alınarak, ince tabaka kromatoğrafisi ile yürütüldü, UV ışık altındaki gözlemlerden sonra aynı Rf değeri veren tüpler birleştirildi. Daha sonra birleştirilen tüpler için daha önce yapılan bazı deneyler yapıldı. Sonuçlardan bazıları aşağıda verildi.
4. SONUÇ VE TARTIŞMA
Taflan bitkisinin yaprak meyve ve çekirdeğindeki antioksidan kapasitesinin olgunlaşma evrelerine göre değişimini incelediğimiz bu çalışmada meyve yaprak ve çekirdeğinin total antioksidan aktivite, indirgeme gücü aktivitesi, serbest radikal giderme aktivitesi ve total fenolik bileşik tayini yapıldı.
4.1.Total Antioksidan Aktivite
Linoleik asit peroksidasyonunun temeline dayanılarak yapılan total antioksidan aktivite testi taflan bitkisinin yaprak, meyve ve çekirdeğine uygulandı. Olgunlaşma evrelerine göre total antioksidan aktivitenin düştüğü şekil 15 de görülmektedir.
Şekil 15 de görüldüğü gibi yaprak için total antioksidan aktivitenin en yüksek olduğu ham yaprak (HY),sonra olgun yaprak (OY) ve en düşük total antioksidan aktiviteye sahip olan olgunlaşma sonrası yaprak (OSY) olduğu görülmektedir. Bu test için standart olarak BHT ve α-tokoferol kullanıldı. Olgunlaşma dönemine göre yaprakların ve standartların total antioksidan aktivitesini karşılaştırdığımızda aktivite büyükten küçüğe doğru sırasıyla HY (%89,325)> OY (%57,303)> BHT (%41,13)> α-Tokoferol (%33,98)> OSY (% 18,82) şeklindedir.
0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900 0 10 20 30 40
İnkubasyon süresi (saat)
A b s o rb a n s ( 5 0 0 n m )
Kontrol HY OY OSY BHT a-Tokoferol
Şekil 15: Taflan bitkisinin yaprağının olgunlaşma evrelerine göre total antioksidan aktivitesi [ham yaprak (HY), olgunlaşmış yaprak (OY), olgunlaşma sonrası yaprak (OSY), bütillenmiş hidroksi toluen (BHT)]
Şekil 16 de görüldüğü gibi total antioksidan aktivitenin en yüksek ham meyve (HM) sonra olgunlaşmış meyve (OM) ve en düşük total antioksidan aktiviteye sahip olgunlaşma sonrası meyve (OSM) olduğu görülmektedir. Total antioksidan aktivite büyükten küçüğe doğru sırasıyla HM (%75,56)> BHT (%41,13)> α-tokoferol (%33,98)> OM (%21,07)> OSM (%17,13) şeklindedir.
