B‹YOLOJ‹K BEL‹RTEÇLER VE BOS’UN PC12 HÜCRE HATTI
CANLILI⁄I ÜZER‹NE ‹N V‹TRO ETK‹S‹N‹N DE⁄ERLEND‹R‹LMES‹*
BIOCHEMICAL MARKERS IN CEREBROSPINAL
FLUID (CSF) AND EVALUATION OF THE EFFECT
OF CSF ON PC12 CELL LINE VIABILITY IN
ALZHEIMER’S DISEASE
Dr. Erdem YAKA
Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi Nöroloji Anabilim Dal› ‹ZM‹R
Tlf: 0232 412 40 51 Fax: 0232 259 05 41 Gelifl Tarihi: 30/11/2005 (Received) Kabul Tarihi: 20/02/2006 (Accepted) ‹letiflim (Correspondance)
1 Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi Nöroloji Anabilim Dal› ‹ZM‹R
2 Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi Araflt›rma Laboratuvar› (ARLAB) ‹ZM‹R 3 Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi
Halk Sa¤l›¤› Anabilim Dal› ‹ZM‹R 4 Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi
Anestezi ve Reanimasyon Anabilim Dal› ‹ZM‹R
A
BSTRACT
Introduction: The definite diagnosis of Alzheimer’s disease (AD) is based on post mortem pathological
examination. To date, there is no laboratory test that can discriminate patients with AD from healthy individuals. Although, there is a relatively high accuracy rate of the clinical diagnosis of AD (~%90) in expert research academic centers, the studies which aim to find out pathognomonic laboratory markers available for AD still continue. In the perspective of recent knowledge, there are three cerebrospinal fluid (CSF) markers which have the highest sensitivity and specificity: Beta-amyloid (Aβ)1-40,Aβ1-42and phospho-tau (p-tau).
Aims: In this study, concentrations of these markers in CSF were quantified by using ELISA and the
sensitivity and specificity for our laboratory were determined. Also, the effects of ‘Probable Alzheimer’s Disease’ (PRAD) patients’ CSF on the survival of PC12 cell line were assessed. For that purpose, cell line viability was evaluated by 3-(4,5-dimethylthiazol–2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) test and the results were compared between groups.
Material and Methods: In the present study, 15 PRAD patients and 15 control subjects were included.
PRAD patients were selected from the patients of Dokuz Eylül University Neurology Department Dementia Outpatient Clinic and control subjects were selected from the patients who were undergone epidural anesthesia because of any surgical operation.
Results: There was a significant decrease of Aβ1-40(p=0.014) and increase of p-tau (p=0.04) in
patients with AD when compared with controls. Aβ1-42 concentration was not significantly different between
groups (p=0.054) There was a positive corelation between duration of the disease and CSF of p-tau concentration in patients with AD (Spearman Rho=0.575; p=0.025). There was no significant difference in cell line viability values between groups (p=0.056).
Conclusion: There is an urgent heed for an evaluation of protective and toxic substances in the CSF
of patients with AD.
Ö
Z
Girifl: Günümüzde, Alzheimer hastal›¤›n›n (AH) kesin tan›s› ancak post-mortem beyin incelemesi ile
nulabilmektedir. Yaflayan bir hastada kesin AH tan›s› koyabilecek hiçbir laboratuvar incelemesi yoktur. Bu ko-nuda özelleflmifl merkezlerde, AH tan›s› klinik ölçütlerle % 90 do¤rulukla konmakla birlikte, her sa¤l›k merke-zinde uygulanabilecek, kesin tan› koymay› hedefleyen laboratuvar belirteçlerine ulaflmak için çal›flmalar devam etmektedir. Son bilgiler ›fl›¤›nda, duyarl›l›k ve özgüllükleriyle ön plana ç›kan üç BOS belirteci vard›r: Amiloid beta (Aβ)1-40,Aβ1-42ve fosfo-tau (f-tau).
Amaç: Çal›flmam›zda bu belirteçlerin olgu ve kontrollerde BOS düzeyleri, ELISA yöntemiyle belirlenmifl,
klinik tan› esas al›narak özgüllük ve duyarl›l›klar›, laboratuvar›m›z için hesaplanm›flt›r. Ayr›ca, ‘Muhtemel Alz-heimer hastal›¤›’ (MAH) olgular›n›n BOS’lar›n›n PC12 hücre hatt›na sitotoksik etkisinin olup olmad›¤› araflt›-r›lm›flt›r. Bu amaçla hücre hatt›na AH ve kontrol BOS’lar›n›n eklenmesinden sonra, hücre canl›l›¤›, 3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) testiyle de¤erlendirilmifl ve gruplar aras›nda karfl›-laflt›rma yap›lm›flt›r.
Gereç ve Yöntem: Çal›flmaya, Dokuz Eylül Üniversitesi Nöroloji Anabilim Dal› Demans Poliklini¤i
has-talar› aras›ndan seçilmifl 15 Alzheimer hastas› ve nörolojik bir sorunu olmayan, herhangi bir cerrahi giriflim nedeniyle spinal anestezi uygulanmas› gereken hastalar aras›ndan seçilmifl 15 kontrol dahil edilmifltir.
Bulgular: Alzheimerli olgular›n ve kontrollerin BOS belirteçleri ortalamalar› karfl›laflt›r›ld›¤›nda,
olgula-r›n Aβ1-40ortalamalar›n›n kontrollerin ortalamalar›ndan anlaml› olarak düflük oldu¤u (p=0.014), f-tau de¤er
ortalamalar›n›n olgularda anlaml› olarak yüksek oldu¤u saptanm›flt›r (p=0.04). Alzheimerli olgular›n Aβ1-42
talamalar› ise kontrollerden farkl› bulunmam›flt›r (p=0.054). Olgularda, f-tau’nun ayr›ca, hastal›k süresi ile or-ta güçlükte pozitif korelasyon gösterdi¤i bulunmufltur (Spearman Rho=0.575; p=0.025). Canl› kalan hücre say›s› ortalamalar› de¤erlendirildi¤inde, olgular›n canl› kalan hücre say›s› ortalamas›n›n da kontrollerden farkl› olmad›¤› izlenmifltir (p=0.056).
Sonuç: Alzheimer hastalar›n›n BOS’lar›ndaki koruyucu ve toksik maddelerin araflt›r›lmas› gereklidir.
Anahtar sözcükler: Alzheimer hastal›¤›, BOS belirteçleri, Sitotoksisite, PC12 hücre hatt›
R
ESEARCH
Erdem YAKA
1Mehtap YÜKSEL E⁄R‹LMEZ
2Pembe KESK‹NO⁄LU
3Zahide ÇAVDAR
2fiermin GENÇ
2Kürflad GENÇ
2Leyla ‹Y‹L‹KÇ‹
4Görsev Gülmen YENER
1G
‹R‹fiD
emans, eriflkin merkezi sinir sisteminin edinsel nedenler-le hasarlanmas› sonucu, bilinç bulan›kl›¤› olmaks›z›n, bir-den fazla kognitif alan›n bozulmas›na ve bununla ilintili olarak günlük yaflam aktivitelerinin eskisi düzeyinde sürdürülememe-sine neden olan, do¤al seyri aç›s›ndan kal›c›, s›kl›kla da ilerle-yici bir klinik tablodur (1). Demans sendromlar› içerisinde en s›k görüleni Alzheimer hastal›¤›d›r (AH) (2).AH’nin tan›s› konusunda klinik bulgulara dayanan ölçek-lerin kullan›m›, %80-90 (3-4) özgüllük ve duyarl›l›k sa¤lamak-tad›r. Kesin tan›y› koymay› hedefleyen biyolojik belirteçlerin duyarl›l›k ve özgüllü¤ü ancak bu düzeye ulaflmakta ya da biraz geçmektedir. Toplam tau, amiloyid beta (Aβ)1-40ve Aβ1-42
gi-bi baz› ölçeklerin komgi-bine kullan›m› (5-7) ya da son olarak gi- bil-dirilen belirteç olan fosfo-tau (f-tau)’nun tek bafl›na (8-9) kulla-n›m› bu oranlar› yükseltmektedir. Çal›flmam›zda klinik ölçek-lerle ‘Muhtemel Alzheimer hastal›¤›’ (MAH) tan›s› alm›fl olgu-larda biyolojik belirteç olan Aβ1-40,Aβ1-42ve f-tau BOS
dü-zeylerininin klinik tan›ya katk›s›n›n incelenmesi ilk amaç ola-rak belirlenmifltir.
Kesin tan›s› histopatolojik kan›tlarla ortaya konan AH’de iki patolojik gösterge olan amiloyid plak (AP) ve nörofibriller yuma¤›n (NFY) nöronal hücrelere toksik etkileri bildirilmifltir (10). Ayr›ca, Alzheimer hastal›¤›nda beyinde nörotoksik etki-li ajanlar›n varl›¤› bietki-linse de (6) bu konuda beyin omurietki-lik s›v›-s› örneklerinin nöronal hücreler üzerine in vitro etkileri net de¤ildir. Alzheimer hastalar›n›n serum IgG örneklerinin s›çan-larda in vivo kolinerjik nöronlara toksik etkisi oldu¤u bildiril-mifltir (11). Ancak beklenenin tersine Alzheimer hastalar›n›n BOS ve beyin örneklerinin in vitro hücre canl›l›¤› üzerine, art-t›r›c› etkisinden söz eden yay›n da mevcuttur (12). Bunun d›-fl›nda di¤er nörolojik hastal›klarda da serum/BOS örnekleri-nin nöron geliflimini ve canl›l›¤›n› azalt›c› etkisi oldu¤unu sap-tayan çal›flmalar vard›r. Parkinson hastal›¤›nda BOS örnekle-rinin s›çan dopaminerjik nöronlar›na (13-14), multipl skleroz idrar örneklerinin in vitro s›çan glia kültürlerine (15-16) ve nö-ropatisi olan diyabet hasta serum örneklerinin in vitro s›çan arka kök ganglion nöronlar›na toksik etkisi (17) bildirilmifltir.
Bu çal›flman›n ikinci bir amac› olarak da MAH olgular›n›n BOS’lar›n›n PC12 hücre hatt›na sitotoksik etkisinin olup ol-mad›¤› araflt›r›lm›flt›r. Bu çal›flmada, bu amaçla hücre hatt›na AH ve kontrol BOS’lar›n›n eklenmesinden sonra hücre canl›-l›¤› 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bro-mide (MTT) testiyle de¤erlendirilmifl ve gruplar aras›nda kar-fl›laflt›rma yap›lm›flt›r.
AH’de BOS sitotoksisitesini araflt›ran bu araflt›rma, ayr›ca Ab1-40,Ab1-42ve f-tau gibi önemli üç belirteçle
korelasyonu-nu inceleyen ilk çal›flma olma özelli¤ine sahiptir.
G
EREÇ VEY
ÖNTEMOlgu ve Kontroller
Karfl›laflt›rmal› olgu serisi çal›flmas› yap›lm›flt›r.
Olgular: NINCDS-ADRDA tan› kriterlerine göre ‘muhtemel
AH’ tan›s› alm›fl olgular araflt›rmaya dahil edilmifltir.
Kontroller: Herhangi bir demansiyel semptomu olmayan,
olgularla benzer yafl grubundan olan, bir cerrahi giriflim için epidural anestezi uygulanan kifliler, kontrol grubu olarak arafl-t›rmaya dahil edilmifltir.
Araflt›rman›n De¤iflkenleri
Demografik de¤iflkenler ve al›flkanl›klar›:
• Yafl: Hasta ve/veya yak›nlar›na ve kontrollere yüz yüze
görüflme s›ras›nda sorularak elde edilmifltir.
• Cins: Kad›n ve erkek olarak belirtilmifltir.
• E¤itim y›l›: Hasta ve/veya yak›nlar›na ve kontrollere yüz
yüze görüflme s›ras›nda sorularak elde edilmifltir.
• Sigara: Hasta ve/veya yak›nlar›na ve kontrollere yüz yüze
görüflme s›ras›nda sorularak elde edilmifltir. Çal›flman›n yap›ld›¤› zamanki içicilik dikkate al›nm›flt›r.
Biliflsel durum: Mini mental durum testi (MMDT), Global Bozulma Ölçe¤i (GBÖ) ile de¤erlendirilmifltir. MMDT skorlar› 26 ve üstü, ifllevselli¤i tam olan ve GBÖ 1 olan sa¤l›kl› birey-ler kontrol grubunu oluflturmufllard›r. MMDT skorlar› 25 ve alt›nda olan ve GBÖ 4 ile 7 aras›nda de¤iflen Diagnostic and Stastistical Manual of Mental Disorders (DSM)-IV kriterine gö-re demans ve National Institute of Neurological and Commu-nicative Disorders and Stroke and the Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA) tan› kriterine göre ‘muhtemel AH’ tan›s›n› karfl›layan olgular AH grubu olarak al›nm›flt›r.
• BOS bbelirteçleri: Aβ1-40, Aβ1-42 , f-tau BOS
belirteçle-ri olarak de¤erlendibelirteçle-rilmifltir.
Etik kkurul oonam›: Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi
Klinik ve Laboratuvar Araflt›rmalar› Etik Kurulu’nun 12 Hazi-ran 2003 tarihli 03/11/03 no’lu toplant›s› sonucunda çal›fl-man›n yap›lmas›nda etik aç›dan sak›nca olmad›¤›na dair onay al›nm›flt›r.
Verinin Toplanmas› ve ‹fllenmesi
Olgu grubu, 01.06.2004 ve 01.07.2004 tarihleri aras›nda Dokuz Eylül Üniversitesi Nöroloji Anabilim Dal› Demans Po-liklini¤inde muayene edilen Alzheimer hastalar› aras›ndan se-çilmifltir. Olgular hafif, orta, a¤›r evre Alzheimer hastalar›d›r. AH grubundaki olgulardan, lomber 4–5 aral›¤›ndan lateral de-kubit pozisyonda toplam 2.5 cc BOS al›nm›flt›r. Biyokimya tüplerine konan BOS’lar, 1000 rpm’de 5 dk. boyunca sant-rifüj edildikten sonra, dipte çökelti halinde olan
parçac›klar-dan ar›nd›r›larak derin dondurucuya (-75 °C ’de) kald›r›lm›flt›r. Kontrol grubu nörolojik bir sorunu olmayan, herhangi bir cer-rahi giriflim nedeniyle spinal anestezi uygulanmas› gereken hastalar aras›ndan seçilmifltir. Seçilen olgularla yüz yüze gö-rüflme yap›l›p, onamlar› yaz›l› olarak al›narak çal›flmaya dahil edilmifltir. Klinik bak›yla demans› olmad›¤› tespit edilen birey-lere MMDT uygulanm›flt›r. Kontrollerden, 2.5 cc BOS spinal anestezi amac›yla yap›lan lomber ponksiyon s›ras›nda Anes-teziyoloji ve Reanimasyon Anabilim Dal›nda çal›flan yard›mc› araflt›rmac› koordinasyonuyla al›nm›flt›r. Örnekler, ameliyat-haneden al›nd›ktan hemen sonra laboratuvara götürülerek AH grubundaki olgular›n BOS’lar›na uygulanan ifllemlerin ay-n›s› uyguland›ktan sonra derin dondurucuya kald›r›lm›flt›r. Ça-l›flman›n yap›ld›¤› güne kadar tüm örnekler derin dondurucu-da korunmufltur.
ELISA Yöntemi
F-tau, Aβ1-42ELISA kitleri (INNOTEST b amiloyid(1-42),
Inno-genetics, Gent, Belçika) ve Aβ1-40 ELISA kiti (Signal Select
Human β amiloyid(1-40) Biosource International, California,
USA) temin edilmifltir. Çal›flmaya dahil edilen 15 AH’nin ve 15 kontrol olgusunun BOS’lar› ELISA yöntemiyle f-tau, Aβ1-42
ve Aβ1-40için de¤erlendirilmifltir.
PC12 Hücre Kültürü ve ‹n Vitro Deneyler
PC12 hücre hatt› Fransa’dan temin edildi. PC12 hücreleri %10 oran›nda at serumu, %5 oran›nda fetal inek serumu, 50 U/ml penisilin ve 100 mg/ml streptomisin eklenen RPMI1640 kültür ortam› içinde poli-D-lizin (PDL) ile
kaplan-m›fl kültür kaplar›na ekildi. Kültürler s›k›fl›k duruma geldikle-rinde (genellikle haftada bir) pipetleme ifllemiyle mekanik ola-rak kültür kaplar›ndan ayr›laola-rak 1/4 oran›nda pasaj yap›laola-rak kültürler sürdürüldü. Kültürler karbondioksid enkübatöründe (%5 oran›nda karbondioksid içermektedir) ve 37 °C s›cakl›k-ta tutuldu. PC12 kültürlerinin ors›cakl›k-tam› iki günde bir s›cakl›k-taze kültür ortam›yla 2/3 oran›nda tazelendi.
‹n vitro deneyler için, 96 kuyucuklu ve PDL ile kaplanm›fl kültür kaplar›na 50 000 hücre/kuyucuk/200 µl kültür ortam› yo¤unlu¤unda ve %3 oran›nda serum (%2 at serumu ve %1 fetal inek serumu) içeren kültür ortam› içinde ekilmifl olan PC12 hücreleri kullan›ld›. Deneylerde düflük serum içeren kültür ortam›na geçilmesinin amac›, hücrelerin deneyler süre-since ço¤almas›n› önlemek ve serumun içerebilece¤i koruyu-cu faktörlerin etkisinden kaç›nmakt›r (18). Deneylerde her bir koflul için en az üçlü efl örnekler çal›fl›larak deneyler ayn› stan-dart koflullarda en az üç kez tekrarland›. Deney günü BOS ör-nekleri çözüldükten sonra 56 °C s›cakl›kta 30 dakika süreyle ›s›t›larak inaktive edildi. Bu ifllemin amac› BOS örneklerinin içerebilece¤i kompleman faktörlerinin inaktivasyonu yoluyla komplemana ba¤l› olabilecek hücre ölümü olas›l›¤›n›n d›fllan-mas›d›r. Bu ifllemler sonras› hasta ve kontrol BOS örnekleri
96 kuyucuklu kültür kaplar›na kuyucuk bafl›na 20 µl hacimde eklendi. Böylece, Alzheimer ve kontrol BOS’unun eklenme-di¤i saf hücre hatt› kuyucuklar›, AH grubunun BOS’lar›n›n ol-du¤u kuyucuklar ve kontrol BOS’lar›n›n eklendi¤i kuyucuklar elde edildi. Kültürler daha sonra karbondioksid enkübatörün-de 48 saat süresince enkübe edildi. Bu sürenin sonunda hüc-re canl›l›¤› MTT testi ile de¤erlendirildi.
MTT Testi
MTT yöntemiyle bir hücre toplulu¤undaki canl› hücrelerin oran› kolorimetrik yöntemle kantitatif olarak saptanabilmek-tedir. Bu yöntem sa¤lam hücrelerde mitokondrinin MTT bo-yas›n›n tetrazolium halkas›n› parçalayabilmesi ilkesine dayan-maktad›r (18-19). Bu reaksiyon frajil bir mitokondrial enzim olan süksinat dehidrogenaz enziminin aktivitesine ba¤›ml›d›r. Tetrazolium halkas›n›n parçalanmas› sonucu soluk sar› renkli MTT boyas› koyu mavi-mor formazan ürününe dönüflmekte-dir. Sonuç olarak canl› ve mitokondri fonksiyonu bozulmam›fl hücreler mor renkte boyanmakta, ölü ya da mitokondri fonk-siyonu bozulmufl hücreler boyanmamaktad›r. Bu yöntem hüc-relerin MTT boyas›yla enkübasyonu, presipite reaksiyon ürü-nünün çözünür hale getirilmesi ve reaksiyon ürüürü-nünün kolori-metrik olarak ölçümü basamaklar›ndan oluflmaktad›r. Ayr›nt›-l› deney basamaklar› flu flekildedir:
1. 100 mg MTT (Sigma) maddesi 10 ml hacimde PBS (Phosphorylated buffer solution- Fosforile edilmifl tampon çözelti) içinde çözülerek %0.5’lik (10 mg/ml konsantras-yonda) stok MTT solüsyonu steril ve karanl›k koflullarda haz›rland›. Solüsyon 0.22 mm’lik filtre ile süzülerek deb-risler uzaklaflt›r›ld›. Bu solüsyon karanl›k ortamda ve 4 °C s›cakl›kta bir ay kadar bir süre saklanabilmektedir. 2. Deneylerde herhangi bir toksik ya da koruyucu ajan
ek-lenmeyen kültür koflullar› kontrol olarak kullan›ld›. Doksa-nalt› kuyucuklu kültür plaklar›na ekilen ve de¤iflik toksik ve/veya koruyucu ajanlar›n de¤iflik dozlar›yla karfl›laflt›r›-lan kültürlere hedeflenen enkübasyon süresinin sonunda 10 ml/kuyucuk hacimde MTT solüsyonu eklendi. 3. Kültür plaklar› alüminyum folyo ile sar›larak %5
karbondi-oksidli nemli hava içeren karbondioksid enkübatöründe 37 °C s›cakl›kta 4 saat süreyle tutuldu.
4. Enkübasyon süresinin sonunda faz-kontrast “inverted” mikroskop alt›nda canl› hücrelerde mor renkte formazan kristallerinin olufltu¤u, ölü hücrelerin ise boyanmad›¤› sap-tand›.
5. Kültür pla¤›, plak rotoru kullan›larak 1250 rpm h›zda 5 dk süreyle santrifüj edildi. Santrifüj sonras› çökelti at›ld›. 6. Formazan kristallerini çözünür duruma getirmek için
ön-ceden haz›rlanm›fl solubilizasyon solüsyonu 100 ml/kuyu-cuk hacimde eklendi. Bu solüsyon isopropranolol içinde haz›rlanm›fl 0.04 N HCl solüsyonundan oluflmakta ve oda s›cakl›¤›nda saklanmaktad›r.
7. Kültür pla¤› DEÜTF Hematoloji laboratuvar›nda bulunan ELISA plak okuyucusuna konularak absorbans de¤erleri 450 nm dalga boyunda okutuldu. Referans dalga boyu olarak 650 nm dalga boyu kullan›ld›. Kontrol ve hasta grubunda canl› oran› absorbans de¤erleri karfl›laflt›r›larak incelendi.
Veri Çözümlemesi
SPSS 11.0 paket program› ve Epi-info 2000 program› kulla-n›larak, da¤›l›mlar de¤erlendirilmifl, say›mla elde edilen de¤ifl-kenlerde (cins, yafl grubu, e¤itim grubu, sigara içicili¤i) aras›n-daki farkl›l›¤a Ki-kare (c2 Yates, Fisher-Exact test) analizi,
öl-çümle elde edilen veride ve sürekli de¤iflkenlerde (yafl ortala-mas›, e¤itim y›l› ortalaortala-mas›, Aβ1-40,Aβ1-42, f-tau ve MTT
ab-sorbans ortalamalar›) aras›ndaki farkl›l›¤a gruplar nonpara-metrik koflullar› sa¤lad›¤› için Mann Whitney U testi ile bak›l-m›flt›r. Klinik tan›ya göre f-tau için kesim noktas› belirleme amac›yla ROC e¤risi çizilmifl ve bu çal›flmaya özgü f-tau ke-sim noktas› belirlenmifltir. Çal›flmada p< 0.05 düzeyi anlaml› kabul edilmifltir.
S
ONUÇLARY
ukar›daki olgu ve kontrol tan›mlamas›na uyacak flekilde 15 olgu, 15 kontrol çal›flmaya al›nm›flt›r. Olgular›n yafl or-talamas› 69.7±10.5, kontrollerin yafl oror-talamas› 67.3±11.3 bulunmufltur. Yafl ortalamalar› aras›nda anlaml› fark saptan-mam›flt›r (p=0.63). Olgular›n e¤itim ortalamalar› 7.8 ± 4.7 y›l ve kontrollerin e¤itim ortalamalar› 7.5± 5.9 y›l olaraksaptan-m›flt›r. E¤itim sürelerinin ortalamalar› aras›nda anlaml› farkl›-l›k bulunmam›flt›r (p=0.86). Olgular›n hastafarkl›-l›k süresi ortala-mas› 2.67 y›l (SS=1.76 y›l) bulunmufltur. Hastal›k bafllang›ç yafl› ortalamas› 67.07 (SS=10.86) saptanm›flt›r.
Olgu ve kontrollerin, BOS belirteçleri ve yafl de¤iflkenleri aras›nda, ayr› ayr› korelasyonlara bak›lm›flt›r. Her iki grupta da say› 30’un alt›nda oldu¤u için Spearman korelasyonu ile birlik-telik de¤erlendirilmifltir. Olgularda, yafl ve Aβ1-40 belirteci
aras›n-da anlaml›, güçlü, pozitif bir korelasyon saptanm›flt›r (Spearman Rho = 0,709 p=0,003). Olgularda, BOS belirteçleri ile hastal›k süresi aras›nda korelasyonlara bak›lm›flt›r. Yaln›zca f-tau ve has-tal›k süresi aras›nda pozitif, orta düzeyde anlaml› bir birliktelik saptanm›flt›r (Spearman Rho = 0,575 p=0,025).
fiekil 1’de olgu ve kontrollerin Aβ1-40de¤erlerinin
da¤›l›-m› görülmektedir. Olgular›n Aβ1.40 de¤er ortalamalar›
7388.9±4103.9 pg/ml, kontrollerin Aβ1-40de¤er
ortalama-lar› 12031.5±5297.9 pg/ml olarak hesaplanm›flt›r. Olgular-daki Aβ1-40de¤erlerindeki düflüklük istatistiksel olarak
anlam-l› bulunmufltur (p=0.0014).
fiekil 2’de olgu ve kontrollerin Aβ1-42de¤erlerinin
da¤›l›-m› görülmektedir. Olgular›n Aβ1.42 de¤er ortalamalar›
830±279.7 pg/ml, kontrollerin Aβ1-42 de¤er ortalamalar›
1086.6±409.9 pg/mlolarak hesaplanm›flt›r. Olgulardaki Aβ1-42de¤erlerindeki düflüklük istatistiksel olarak anlaml›
bu-lunmam›flt›r (p=0.054).
fiekil 3’de olgu ve kontrollerin f-tau de¤erlerinin da¤›l›m› görülmektedir. Olgular›n f-tau de¤er ortalamalar› 97.1±41.1 pg/ml, kontrollerin f-tau de¤er ortalamalar› 66.9±30.1 pg/ml olarak hesaplanm›flt›r. Olgulardaki f-tau de¤erlerindeki yükseklik istatistiksel olarak anlaml› bulunmufltur (p=0.04).
fiekil 1— Olgu ve kontrollerin Aβ1-40de¤erleri: Olgular›n Aβ1.40
de-¤er ortalamalar› 7388.9±4103.9 pg/ml, kontrollerin Aβ1-40 de¤er
ortalamalar› 12031.5±5297.9 pg/ml olarak hesaplanm›flt›r. Olgu-lardaki Aβ1-40 de¤erlerindeki düflüklük istatistiksel olarak anlaml›
bulunmufltur (p=0.0014).
fiekil 2— Olgu ve kontrollerin Aβ1-42de¤erleri: Olgular›n Aβ1.42
de-¤er ortalamalar› 830±279.7 pg/ml, kontrollerin Aβ1-42de¤er
ortala-malar› 1086.6±409.9 pg/ml olarak hesaplanm›flt›r. Olgulardaki Aβ1-42de¤erlerindeki düflüklük istatistiksel olarak anlaml›
fiekil 4’de olgu ve kontrollerin MTT abzorbans lar› görülmektedir. Olgular›n MTT abzorbans de¤er ortalama-lar› 74.1x(10-3) ± 13.7x(10-3), kontrollerin abzorbans
ortala-malar› 84.7x(10-3) ± 12.1x(10-3) olarak hesaplanm›flt›r.
Olgu-lardaki MTT abzorbans de¤er ortalamalar›ndaki düflüklük ista-tistiksel olarak anlaml› bulunmam›flt›r (p=0.056)
T
ARTIfiMAG
ünümüzde insanlar›n ortalama yaflam süresinin uzamas›-na paralel olarak yafll›larda görülen sa¤l›k sorunlar›n›n prevalans›nda art›fl gözlenmektedir. Alzheimer hastal›¤› da bu sa¤l›k sorunlar›ndan biridir. AH, nörodejeneratif hastal›klar içerisinde en s›k görülen (2) ve bir kez kaybedildi¤i zaman ye-rine yenisi konamayan beyin hücrelerinin ölümüne neden olan ilerleyici bir hastal›kt›r (19). Yap›lan çal›flmalar, klinik bulgular ortaya ç›kmadan 15 ile 20 y›l kadar önce nöron y›-k›m›na neden olan patolojik sürecin bafllam›fl oldu¤unu dü-flündürmektedir (20-21). AH’de de klinik bulgular saptand›-¤›nda, bellek ifllevinde çok önemli rol oynayan entorinal kor-teksteki nöronlar›n %50’si kaybedilmifl olmaktad›r (22). Bu nedenle AH klinik olarak ortaya ç›kmadan önce belirteçlerini saptay›p, patolojiyi geliflmeden durduracak tedaviler gelifltir-mek gerekgelifltir-mektedir.Yak›n zamanlarda buna iliflkin bir tedavi çabas› beta amilo-yid afl›s› olmufl ve yararl› etkileri deneysel olarak gösterilmifltir. Bu afl›n›n immünolojik yönden düzeltilmesi çabalar›n›n önü-müzdeki birkaç y›lda sonuç verece¤i düflünülmektedir (23). Tüm bu çabalar presemptomatik ya da semptomatik olgular›n belirlenmesine yönelik biyolojik belirteçlerin araflt›r›lmas›n› hakl› k›lmaktad›r. En iyi belirteçler patolojik süreç ile do¤rudan iliflkili olanlar ya da sadece patolojinin sonucu olarak oluflanlar-d›r. Bu çal›flmada, mevcut bilgiler ›fl›¤›nda duyarl›l›k ve özgüll-lü¤ü en üst düzeyde oldu¤u çeflitli çal›flmalarda saptanan Aβ 1-40,Aβ1-42ve f-tau biyolojik belirteç olarak araflt›r›lm›flt›r.
Bizim çal›flmam›zda da, Alzheimer grubundaki Aβ1-40
de-¤erleri, kontrol grubuna göre, anlaml› oranda düflük bulun-mufl (p=0,014) (Tablo 1) ve Aβ1-40’›n önemli bir belirteç
ol-du¤unu desteklemifltir. Ayr›ca, olgular›n yafllar› ve Aβ1-40
be-lirteç de¤erleri aras›nda anlaml›, güçlü, pozitif bir korelasyon saptanm›flt›r (Spearman Rho = 0,709 p=0,003). Bu istatik-sel de¤er her ne kadar nedenistatik-selli¤i ifade etmese de birlikteli-¤i ortaya koymas› aç›s›ndan çarp›c›d›r.
AH vakalar›ndaki BOS Aβ1-42de¤er ortalamalar›, kontrol
olgular›ndaki BOS Aβ1-42de¤er ortalamalar›na göre düflük
iz-lenimi vermekle birlikte, aralar›nda anlaml› fark tespit edilme-mifltir (p=0.054) (Tablo 1). Ayn› flekilde, Aβ1-42’nin AH’de ve
kontrollerde anlaml› fark göstermedi¤ini bulan baflka çal›flma-lar da vard›r (24-25). Ancak, hem Aβ1-42hem de Aβ1-40’›n
kontrollerden daha düflük oldu¤u (25-26) ve Aβ1-42’nin
pato-genezle daha yak›ndan ilintili oldu¤una ait kan›tlar da vard›r (25-27). AH’ye yönelik tan›mlanm›fl en son biyolojik belirteç f-tau proteinidir. Fosforile tau proteinin de¤iflik epitoplar›n› (threonin 181 ve 231, threonin 181, threonin 231, serin 235, serin 199, serin 296 ve 404) saptamak için ELISA yön-temleri gelifltirilmifltir (3, 28-30). Bu çal›flmalar›n da dahil ol-du¤u toplam 11 çal›flmada 800 Alzheimer hastas›, 370 kont-rol olgusu çal›fl›lm›flt›r. Sonuçta f-tau’nun %92 duyarl›l›k ve %80 özgüllükle AH’yi normal yafllanmadan ay›rt edebildi¤i
fiekil 3— Olgu ve kontrollerin f-tau de¤erleri: Olgular›n f-tau de¤er ortalamalar› 97.1±41.1 pg/ml, kontrollerin f-tau de¤er ortalamalar› 66.9±30.1 pg/ml olarak hesaplanm›flt›r. Olgulardaki f-tau de¤erle-rindeki yükseklik istatistiksel olarak anlaml› bulunmufltur (p=0.04).
fiekil 4— Olgu ve kontrollerin MTT absorbans ortalamalar›: Olgula-r›n MTT absorbans de¤er ortalamalar› 74.1x(10-3) ± 13.7x(10-3), kontrollerin absorbans ortalamalar› 84.7x(10-3) ± 12.1x(10-3) ola-rak hesaplanm›flt›r. Olgulardaki MTT absorbans de¤er ortalamalar›n-daki düflüklük istatistiksel olarak anlaml› bulunmam›flt›r (p=0.056)
saptanm›flt›r. BOS’da f-tau’nun -t-tau’nun aksine- iskemik in-me ve JCH’de artmad›¤› gösterilmifltir (31-32). Bizim çal›fl-mam›zda duyarl›l›k ve özgüllü¤ü yüksek olarak düflünülen the-ronin 181’de fosforile olmufl tau kullan›lm›flt›r. Alzheimer hastalar›n›n BOS f-tau de¤er ortalamalar›, kontrol grubunki-ne oranla anlaml› derecede artm›fl olarak bulunmufltur (p=0.04) (Tablo 1). Ayr›ca, olgularda, BOS belirteçleri ile has-tal›k süresi aras›nda korelasyonlara bak›ld›¤›nda yaln›zca f-tau ile hastal›k süresi aras›nda pozitif, orta düzeyde anlaml› bir birliktelik saptanm›flt›r (Spearman Rho = 0.575 p=0.025). Bu sonuç, hastal›k süresi artt›kça f-tau düzeyinin artaca¤›n› öngörmekte ve Alzheimer hastal›¤› ile f-tau düzeyinin yüksek-li¤inin birlikteli¤ine iflaret etmektedir.
Bu çal›flmada ayr›ca AH grubundan elde edilen BOS’lar›n sitotoksik olup olmad›¤› araflt›r›lm›flt›r. Daha önce s›çan me-zensefalik hücre kültürlerinde Parkinson hastalar›ndan al›nm›fl BOS örneklerinin, dopaminerjik nöronlar›n fonksiyonlar›n› ve büyümelerini durdurduklar› gösterilmifltir (13). Srinivasan ve ark (17) tip II diabetik nöropatili hastalar›n serum örneklerinin nöron hücre kültüründe komplemandan ba¤›ms›z, kalsiyum ba¤›ml› apoptozis yapt›klar›n› göstermifllerdir (17). Ayrca mul-tipl skleroz idrar örneklerinin in vitro s›çan glia kültürlerine toksik etkilerini bildiren çal›flmalar da mevcuttur (15, 16).
Pauwels ve ark (12) taraf›ndan yap›lan çal›flma, 7 Alzhe-imer hastas›n›n ve 26 sa¤l›kl› kontrolün BOS’u; ayr›ca, fron-tal kortekste NFY tespit edilmifl 2 Alzheimer hastas›n›n ve be-yinlerinde NFY olmad›¤›ndan emin olunan 2 kontrolün otop-si ile al›nm›fl frontal korteks ve hipokampus örnekleri ile ya-p›lm›flt›r. Bu örneklerin, 17 günlük bir s›çan embriyosunun oksipital korteksinden haz›rlanm›fl hücre kültürü üzerine sito-toksisitesine bak›lm›flt›r. Sonuçta, kontrol ve AH grubu hipo-kampus örneklerinin hücre kültüründe yaratt›klar› etki aras›n-da bir farkl›l›k saptanmam›flt›r. Fakat AH grubunun BOS ve frontal korteks örneklerinin kontrol grubuna göre anlaml› oranda hücre canl›l›¤›n› artt›r›c› etkileri oldu¤u tespit edilmifl-tir (12). Çal›flmada, AH örneklerinin nöron koruyucu etkileri, AH ‘n›n beyinlerinde olmay›p, sa¤l›kl› bireylerde oldu¤u Uc-hida ve ark’n›n (33) yapt›¤› bir çal›flmada gösterilen ‘büyüme yok edici faktöre’ [(BYF) growth inhibitory factor (GIF)] ba¤-lanm›flt›r. BYF içeren örneklerin hücre hatt›nda canl›l›¤›
azal-t›c› yönde etki gösterdikleri sonucuna var›lm›flt›r. Bu protein, sa¤l›kl› insanlar›n beyinlerinde saptanm›flt›r, fakat AH kor-tekslerinde BYF-pozitif astrositlerin dramatik olarak azald›kla-r› tespit edilmifltir.
Bizim çal›flmam›zda, ekledi¤imiz BOS’lar›n PC12 hücre hatt›nda ne oranda sititoksisite yaratt›¤›n› anlamak için MTT abzorbans de¤erlerine bak›ld›¤›nda, AH grubunun MTT de¤er ortalamalar›n›n kontrol grubuna oranla daha düflük olma e¤i-liminde olmakla beraber, aralar›nda anlaml› bir farkl›l›k olma-d›¤› tespit edilmifltir (p=0.056) (Tablo 1). Sonuçlar›m›z Pa-uwels ve ark’n›n (12) yapt›klar› çal›flmayla uyuflmamaktad›r. Bu durum, iki çal›flmadaki olgu-kontrol say›lar›ndaki farktan ya da çal›flmam›zdaki hastalar›n ço¤unda asetilkolinesteraz in-hibitörü (AE‹) kullan›lmas›ndan kaynaklan›yor olabilir. Ancak, AE‹ kullan›m›n›n, Ab (34) ve serbest radikallerle (35) yarat›lan PC12 hücre hatt›ndaki hasarlanmay› azalt›c› etkileri oldu¤unu bildiren çal›flmalar vard›r. AE‹’nin hücre koruyucu etkisinin gösteren bu çal›flmalar, Pauwels ve ark (12) ile bizim çal›flma-m›z aras›ndaki fark›n, ilaç kullan›m›ndan ba¤›ms›z oldu¤unu düflündürmüfl, bu iki çal›flmada elde edilmifl farkl› sonuçlar› aç›klamada yard›mc› olmam›flt›r.
Bütün bu kafa kar›flt›r›c› sonuçlar Alzheimer hastalar›n›n BOS’lar›nda, koruyucu ya da toksik maddelerin araflt›r›lmas›-n› gerektirmektedir. E¤er AH’de BOS’ta sitotoksisiteye ait ve-ri yoksa bu toksik etmenin peve-riferden kaynaklanabilece¤i de düflünülebilir. Engelhardt ve ark’n›n (11) yapt›klar› çal›flmada Alzheimer hastalar›n›n serumlar›ndan izole ettikleri IgG ‘nin s›çan beyinlerindeki kolinerjik nöronlar› harap ettiklerini gös-termifl olmalar›, BOS d›fl›nda nörotoksik etken tafl›yan vücut elemanlar› olabilece¤i görüflünü destekler niteliktedir. Bu ça-l›flmaya dayanarak, koruyucu ve/veya toksik etkenlerin orta-ya konmas› için, BOS’un orta-yan› s›ra, Alzheimer hastalar›n›n se-rum ve idrar örneklerinin de hücre hatt›na toksik etkilerini araflt›ran çal›flmalar›n yap›lmas› uygun olacakt›r.
T
EfiEKKÜRP
rojemiz Dokuz Eylül Üniversitesi Bilimsel Araflt›rma Proje Deste¤i ve TÜB‹TAK taraf›ndan desteklenmifltir. Bu arafl-t›rma Dokuz Eylül Üniversitesi T›p Fakültesi Araflarafl-t›rma Labo-ratuar› (ARLAB)’nda gerçeklefltirilmifltir.Tablo 1— Olgu ve kontrollerin BOS belirteçleri ve canl› kalan hücre say›s› ortalamalar›na göre karfl›laflt›r›lmas› Olgu Kontrol
Özellik Ortalama Standart Sapma Ortalama Standart Sapma p* Aβ1-42(pg/ml) 830.0 279.7 1086.6 409.9 0.054
Aβ1-40(pg/ml) 7388.9 4103.9 12031.5 5297.9 0.014
f-tau (pg/ml) 97.1 41.4 66.9 30.1 0.04
MTT absorbans ortalamas› 74.1 13.7 84.7 12.1 0.056
K
AYNAKLAR1. Öge AE, Nöroloji. ‹.Ü. ‹stanbul T›p Fakültesi temel ve klinik bi-limler ders kitaplar›, Nobel T›p Kitabevleri 2004; pp 369.
2. Davis KL, Hachouturian V. Strategies for the treatment of Alz-heimer’s disease. Neurology 1995; 43 (Suppl 4): 52–55.
3. Galasko D, Hansen LA, Katzman R, Wiederholt W, Masliah H, Terry R, et al. Clinical-neuropathological correlations in Alzhe-imer’s disease and related dementias. Arch Neurol 1994; 51 (9): 888–895.
4. Jellinger KA. Diagnostic accuracy of Alzheimer’s disease: a clini-copathological study. Acta Neuropathol 1996; 91 (2): 219–220.
5. Galasko D, Chang L, Motter R, Clark CM, Kaye J, Knopman D, et al. High cerebrospinal fluid tau and low amyloid beta 42 levels in the clinical diagnosis of Alzheimer disease and relation to apo-lipoprotein E genotype. Arch Neurol 1998; 55 (7): 937–945.
6. Hulstaert F, Blennow K, Ivanoiu A, Schoonderwaldt HC, Ri-emenschneider M, De Deyn PP, et al. Improved dicrimination of AD patients using beta-amyloid (1-42) and tau levels in CSF. Neurology 1999; 52 (8): 1555–1562.
7. Shoji M, Matsubara E, Kanai M, Watanabe M, Nakamura T, Tomikodoro Y, et al. Combination assay of CSF tau, A beta 1–40 and A beta 1-42(43) as a biochemical marker of Alzhe-imer’s disease. J Neurol Sci 1998; 158 (2): 134–140.
8. Sjogren M, Daviddson P, Tullberg M, Minthon L, Wallin A, Wikkelso C, et al. Both total and phosphorylated tau are incre-ased in Alzheimer’s disease. J Neurol Neurosurg Pscychiatry. 2001; 70 (5): 624–630.
9. Kolnken R, Buerger K, Zinkowski R, Miller C, Kerkman D, De-Bernardis J, et al. Detection of tau phosphorylated at threoni-ne 231 in cerebrospinal fluid of Alzheimer’s disease patients. Neurosci Lett. 2000; 287 (3): 187-190.
10. Clark CM, Xie S, Chittams J, Ewbank D, Peskind E, Galasko
D, et al. Cerebrospinal fluid Tau and β-Amyloid. How well do these biomarkers reflect autopsy-confirmed dementia digno-ses? Arch Neurol 2003; 60 (12): 1696–1702.
11. Engelhardt JI, Le WD, Siklos L, Obal I, Boda K, Appel SH.
Stereotaxic injection of IgG from patients with Alzheimer dise-ase initiates injury of cholinergic neurons of the basal forebra-in. Arch Neurol 2000; 57 (5): 681–685.
12. Pauwels PJ, Van Assouw HP, De Ryck M, Leysen JE, Dom R,
Van Gool D. Towards an improved survival of rat brain neurons in culture by cerebrospinal fluid of patients with senile dementia of Alzheimer’s type . Brain Res. 1993; 610 (1): 8–15.
13. Hao R, Norgen RB Jr, Lau YS, Pfeiffer RF. Cerebrospinal fluid of
Parkinson’s disease patients inhibits the growth and function of do-paminergic neurons in culture. Neurology 1995; 45 (1): 138–142.
14. Yu SJ, Lo ES, Cochran EJ, Lin DH, Faselis CJ, Klawans HL,
Carvey PM. Cerebrospinal fluid from patients with Parkinson’s disease alters the survival of dopamine neurons in mesencep-halic culture. Exp Neurol 1994; 126 (1): 15–24.
15. Micoud F, Mandrand B, Malcus-Vocanson C. Comparison of
several techniques for the detection of apoptotic in vitro. Cell Prolif 2001; 34 (2): 99-113.
16. Malcus-Vocanson C, Giraud P, Broussole E, Perron H,
Mand-rand B, Ghazot G. A urinary marker for multiple sclerosis Lan-cet 1998; 351 (9112): 1330.
17. Srinivasan S, Stevens MJ, Sheng H, Hall KE, Wiley JW. Serum
from patients with type 2 diabetes with neuropaty induces complement-independent, calcium-dependent apoptosis in cul-tured neuronal cells. 1998; 102 (7): 1454–1462.
18. McGahon AJ, Martin SJ, Bissonnette RP, Mahbaubi A, Shi Y,
Mogil RJ, Nishioka WK, Green DR. The end of the (cell) line: methods for the study of apoptosis in vitro. In “Methods in Cell
Biology, Vol 46, Cell Death”, LM Schwartz and BA Osborne (eds.), 1995;150-181, Academic Press, San Diego.
19. Scinto LF, Daffner KR. Early diagnosis of Alzheimer’s disease.
Humana press 2000; pp 31.
20. Ulrich J. Alzheimer changes in nondemented patients younger
than 65: possible early stages of Alzheimer’s disease and seni-le dementia of Alzheimer’s type. Ann. Neurol. 1985; 17 (3): 273–277.
21. Johansson K, Bogdanovic N, Kalimo H, Winblad B, Viitatenen
M. Alzheimer’s disease and apolipoprotein E4 allele in older drivers who died in automobile accidents. Lancet 1997; 349 (9059): 1143–1144.
22. Gomez-Isla T, Price JL, McKeel Jr DW, Morris JC, Growdon
JH, Hyman BT. Profound loss of layer II entorhinal cortex ne-urons occurs in very mild Alzheimer’s disease. J Neurosci 1996;16 (14): 4491–4500.
23. Schenk D. Hopes remain for Alzheimer’s vaccine. Nature
2004; 431 (7007): 398.
24. Kanai M, Matsubara E, Isoe K, Urakami K, Nakashima K, Arai
H, Sasaki H, et al. Longitudinal study of cerebrospinal fluid le-vels of tau, Aβ1-40and Aβ18-42(43)in Alzheimer’s disease:a study
in Japan. Ann Neurol 1998; 44 (1): 17–26.
25. Andreasen N, Hesse C, Davidsson P, Minthon L, Wallin A,
Winblad B, et al. Cerebrospinal fluid Aβ1-40in Alzheimer’s
sease. Differences between early and late onset Alzheimer di-sease and stability during the course of didi-sease. Arch Neurol 1999; 56 (6): 673–680.
26. Tapiola T, Pirttila T, Mikkonen M, Mehta PD, Alafuzoff I,
Ko-ivisto K, et al. Three year follow up of cerebrospinal fluid tau, β-amyloid 42 and 40 concentrations in Alzheimer’s disease. Neurosci Lett 2000; 280 (2): 119–122.
27. Blennow K, Hampel H. CSF markers for incipient Alzheimer’s
disease. Lancet Neurol 2003; 2 (10): 605–613.
28. Vanmechelen E, Vanderstichele H, Davidsson P, Van
Kerscha-ver E, Van Der Pere B, Sjogren M, et al. Quantification of tau phosphorylated at threonine 181 in human cerebrospinal flu-id: a sandwich ELISA with a synthetic phosphopeptide for standardization. Neurosci Lett 2000; 285 (1): 49–52.
29. Ishiguro K, Ohno H, Arai H, Yamaguchi H, Urakami K, Park JM, et
al. Phosphorylated tau in human cerebrospinal fluid is a diagnostic marker for Alzheimer’s disease. Neurosci Lett 1999; 270 (2): 91–94.
30. Hu Y, He SS, Wang X, Duan QH, Grundke-Iqbal I, Iqbal K, et
al. Levels of nonphosphorylated and phosphorylated tau in ce-rebrospinal fluid of Alzheimer’s disease patients: an ultrasensi-tive bienzyme-substrate-recycle enzyme-linked immunosorbent assay. Am J Pathol 2002; 160 (4): 1269–1278.
31. Riemenschneider M, Wagenpfeil S, Vanderstichele H, Otto M,
Wiltfang J, Kretzschmar H, et al. Phospho-tau/total tau ratio in cerebrospinal fluid discriminates Creutzfeldt-Jakob disease from other dementias. Mol Psychiatry 2003; 8 (3): 343–347.
32. Buerger K, Zinkowski R, Teipel SJ, Arai H, DeBernardis J,
Kerkman D, et al., Differentiation of geriatric major depression from Alzheimer’s disease with CSF tau protein phosphorylated at threonine 231. Am J Psychiatry 2003; 160 (2): 376–379.
33. Uchida Y, Takio K, Titani K, Ihara Y, Tomanaga M. The
growth inhibitory factor that is deficient in the Alzheimer’s di-sease brain is a 68 amino acid metallothionein-like protein. Ne-uron 1991; 7 (2): 337–347.
34. Zhou J, Fu Y, Tang XC. Huperzine A and donepezil protect rat
pheochromocytoma cells against oxygen-glucose deprivation. Neurosci Lett. 2001; 306 (1–2): 53–56.
35. Svensson AL, Nordberg A. Tacrine and donepezil attenuate
the neurotoxic effect of A beta (25–35) in rat PC12 cells. Ne-uroreport. 1998; 9(7): 1519–1522.
