Miad yenidoğan sıçanlarda oluşturulan hipoksik iskemik ensefalopati modelinde intraperitoneal olarak uygulanan fenitoinin beyin hasarına etkisi

(1)

M AD YEN DO AN SIÇANLARDA OLU TURULAN

H POKS K SKEM K ENSEFALOPAT MODEL NDE

NTRAPER TONEAL OLARAK UYGULANAN

FEN TO N N

BEY N HASARINA ETK S

UZMANLIK TEZ

DR. GÜL Z BAYRAM

TEZ DANI MANI

YRD. DOÇ. DR. M NE C NB

DEN ZL - 2008

T.C.PAMUKKALE ÜN VERS TES TIP FAKÜLTES

ÇOCUK SA LI I VE HASTALIKLARI ANAB L M DALI

(2)

(3)

TE EKKÜR

Tez ara t rmam birlikte yürüttü üm, deste ini, güvenini hep hissetti im, yo un çal ma temposunun içinde zaman n esirgemeyen de erli hocam Say n Yrd.Doç.Dr.Mine Cinbi ’e, tezimin tüm a amalar nda deste ini ve yard m n esirgemeyen, engin bilgi ve deneyimleriyle bana yol gösteren, de erli hocam Anatomi Anabilim Dal Ba kan Say n Doç.Dr.Esat Ad güzel’e, her zaman sayg yla anaca m hocalar m Çocuk Sa l ve Hastal klar Anabilim Dal Ba kan Say n

Doç.Dr.Serap Semiz’e, Say n Prof.Dr.Hacer Ergin’e, Say n

Prof.Dr.-lknur K l ç’a, Say n Doç.Dr.Dolunay Gürses’e, Say n

Doç.Dr.Ahmet Akçay’a, , Çocuk Sa l ve Hastal klar Bölümü’nün tüm

çal anlar na, Deney Hayvanlar Laboratuar çal anlar na, gerek

asistanl m dönemimde, gerekse tez a amas nda sab r ve destekleriyle yan mda olan aileme ve e ime te ekkürlerimi sunar m.

(4)

Ç NDEK LER

SAYFA 1. G R VE AMAÇ 1 2. GENEL B LG LER 2

H POKS VE SKEM 2

H POKS K- SKEM K BEY N HASARI VE

NÖROPATOLOJ K ÖZELL KLER 2 H POKS K SKEM K BEY N HASARI GEL M NDE

HÜCRESEL MEKAN ZMALAR 3 ENERJ YETMEZL VE HÜCRE Ç AS DOZ GEL M 5

SERBEST OKS JEN RAD KALLER 6

EKS TATÖR NÖROTRANSM TTER VE NÖROTOKS S TE 8

HÜCRE Ç KALS YUM B R K M 10

NFLAMATUAR HÜCRELER VE MED ATÖRLER 11 SKEM VE H POKS K SKEM K HÜCRE ÖLÜMÜ 11

FEN TO N 12

H POKAMPAL FORMASYON 13 H POKAMPUS 13

SIÇANLARDA H POKAMPUS 15

3. GEREÇ VE YÖNTEM 17

H POKS - SKEM MODEL 18

LAÇ VE SERUM F ZYOLOJ K VER LMES 18 DOKUNUN HAZIRLANMASI 18

(5)

STEREOLOJ K YÖNTEMLER 19 OPT K D SEKTÖR VE OPT K PARÇALAMA 20

KES T ÖRNEKLEME ORANI 21

ALAN ÖRNEKLEME ORANI 22 KES T KALINLI ININ ÖLÇÜMÜ 22 KALINLIK ÖRNEKLEME ORANI 23

NÖRON SAYIMI 23

TOPLAM NÖRON SAYISI 24 STAT ST KSEL YÖNTEMLER 25

4. BULGULAR 26

SIÇANLARIN HÜCRE SAYIM SONUÇLARI VE KULLANILAN PARAMETRELER 26 GRUPLARIN H POKAMPAL ALANLARDAK TOPLAM NÖRON

SAYILARI ORTALAMALARI 32

5.TARTI MA 35 6.SONUÇLAR 42 7.ÖZET (Türkçe- ngilizce) 39-40 8.KAYNAKLAR 45

(6)

TABLOLAR D Z N

Sayfa No Tablo 1: Birinci grup 4 nolu s çan n disektör partikül say lar

ve hata katsay s hesaplanmas nda kullan lan parametreler 24

Tablo-2: Birinci grup s çanlar n vücut a rl klar ,

sol hipokampal CA1, CA2, CA3 stratum piramidale alanlar ndaki,

toplam nöron say lar ve kullan lan parametreler 27

Tablo-3: -kinci grup s çanlar n vücut a rl klar ,

Tablo-4: TG-F1 grubu s çanlar n vücut a rl klar ,

Tablo-5 : TG-F2 grubu s çanlar n vücut a rl klar ,

Tablo-6: ‘Mann-Whitney U’ testi kullan larak,

(7)

EK LLER D Z N

Sayfa No ekil-1: H-E’de beyin hasar mekanizmalar 4 ekil-2: Aerobik(krebs siklusu) ve anaerobik yoldan(glikoliz),

enerji üretimi 6

ekil-3: Serbest oksijen radikallerinin olu um mekanizmalar 8 ekil-4: Glutamat reseptörleri 10 ekil-5: Hipokampal formasyonun ba lant lar 15 ekil-6: Birinci gruptaki s çanlar n nöron say lar 26 ekil-7: -kinci gruptaki s çanlar n nöron say lar 28 ekil-8: TG-F1 grubundaki s çanlar n nöron say lar 29 ekil-9: TG-F2 grubundaki s çanlar n nöron say lar 31 ekil-10: Gruplar n toplam nöron say s ortalamalar 33 ekil-11: Deney gruplar ndan birer s çana ait,

(8)

KISALTMALAR D Z N ADP: Adenozin difosfat

AMP: Adenozin 5’-monofosfat c-AMP: Siklik adenozin 5’-monofosfat

AMPA: Amino-3 -hidroksi-5-metil-4-izoksazol propiyonik asit ATP: Adenozin trifosfat

EAA: Eksitatör aminoasitler

FADH: Flavin-adenin-dinükleotid GABA: Gamma- amino butirik asit H E: Hipoksik–iskemik ensefalopati H2O2: Hidrojen peroksit

HOCL¯: Hipoklorik asit i.p.: -ntraperitoneal i.v.: -ntravenöz

KA: Kainat

LT: Lökotrien

LOOH¯: Lipit peroksit

mGluR1: Metabotropik glutamat 1 reseptör mGluR2: Metabotropik glutamat 2 reseptör mGluR3: Metabotropik glutamat 3 reseptör mGluR4: Metabotropik glutamat 4 reseptör mGluR5: Metabotropik glutamat 5 reseptör mGluR6: Metabotropik glutamat 6 reseptör mGluR7: Metabotropik glutamat 7 reseptör NADH: Nikotinamid-adenin-dinükleotid NMDA: N-metil-D-aspartat

NO: Nitrik oksit

NOS: Nitrik oksit sentetaz

PG: Prostaglandin RO¯: Alkoksil radikali ROO¯: Peroksil radikali

(9)

SR: Serbest radikali

SOR: Serbest oksijen radikaller

O¯2 : Süperoksit radikali

(10)

1. G R VE AMAÇ

Hipoksik iskemik ensefalopati (H-E), preterm ve term yenido anlarda görülen, birden fazla sistem tutulumu ile karakterize bir hastal kt r (1). Prenatal, natal ve posnatal faktörlerin etkisiyle sistemik hipoksi sonucu serebral kan ak m n n azalmas yla olu an beyin zedelenmesidir. Nörolojik morbidite ve mortalitenin en

önemli nedenidir (2). -nsidans term bebeklerde 2-4/1000’dir (3). H-E’li

yenido anlar n %20-50’si ölmektedir (4). Perinatal hipoksik-iskemik beyin hasarlanmas ndaki hücresel ve moleküler

olaylar n anla lmas nda önemli a amalar sa lanm t r. Çal malar hücre

homeostasisinden sorumlu biyokimyasal mekanizmalar n yetersizli inde beyin hasarlanmas n n nas l olu tu una odaklanm t r ve bu çal malarda rat modelleri önem kazanm t r. S çanlar n beyin geli imi, 12-13 günlük olduklar zaman, term yenido an n beyin geli imine benzer özellik göstermektedir (5).

Hipoksik iskemik beyin hasar eksitatör amino asitlerden özellikle glutamat ve glutamat n NMDA reseptörü ile ili kilidir. Hipoksi iskemi modellerinde serebral korteks ve hipokampustan glutamat n sal n m mikrodiyaliz tekni iyle gösterilmi tir. Antikonvülzan olarak kullan lan fenitoin, glutamat sal n m n azaltmaktad r. Voltaj ba ml Na kanallar n bloke ederek ve Na-K-ATPaz uyararak hücreiçi/d iyon dengesini korumaktad r. Sodyum ba ml aksiyon potansiyelinin amplitüdünü azaltmakta ve enerji metabolizmas n bask lamaktad r. Bunlar n yan s ra fenitoin, iskemide, laktat ve serbest ya asitlerinin birikimini önlemektedir (6).

Bu çal ma; hipoksi-iskemi uygulanm s çan modelinde, hipokampusun piramidal hücre tabakas nda meydana gelen hücre azalmas üzerine fenitoinin etkisini stereolojik yöntemlerle ara t rmak ve de i ik fenitoin dozlar n n hücre azalmas n önleme konusundaki fark n ortaya koymak üzere planlanm t r.

(11)

2. GENEL B LG LER

H POKS VE SKEM

Kan dola m n n oldu u bir veya birden fazla dokuda oksijenin parsiyel yoklu u hipoksemi, oksijenin tam yoklu u ise anoksemi olarak tan mlan r. Asfiksi, progressif hipoksemi ve asidoz ile sonuçlanan pulmoner veya plasental gaz de i iminin bozulmas d r. -skemi sistemik hipotansiyon, kardiyak arrest veya oklüsiv vasküler hastal k nedeniyle dokulara giden kan ak m n n kesilmesi veya azalmas d r. Hipoksik-iskemi, doku düzeyinde iskemi ile birlikte hipoksemi olmas d r (7,8).

H POKS K- SKEM K BEY N HASARI VE NÖROPATOLOJ K ÖZELL KLER

Perinatal asfiksinin temel özellikleri derin asidemi (kord kan nda pH< 7.00), dü ük apgar skoru, hipoksik iskemik ensefalopati ve multiorgan sistem disfonksiyonudur. Hipoksik iskemik ensefalopatili bebeklerde primer hasarlay c olay n gerçekle ti i dönemi belirlemek çok zordur; ancak %20‘sinin antepartum, %35’inin intrapartum, %35’inin intrapartum ve antepartum, %10’unun postpartum dönemde geli ti i gösterilmi tir (9). Kronik fetal hipoksi ve akut hipoksik iskemik zedelenme gestasyonel ya a göre de i en nöropatolojik bulgularla sonuçlan r (4). Hipoksik iskemik beyin hasar nda ba l ca 6 çe it patolojik lezyon geli mektedir. Bunlar selektif nöron hasar , status marmaratus, parasagital beyin hasar , periventriküler lökomalazi, intraventriküler veya periventriküler kanama ve fokal veya multifokal iskemik beyin lezyonudur. Rat çal malar iskemiden sadece 10 dakika sonra selektif nöron hasar n n geli ti ini göstermi tir (10,11). Nöropatolojik lezyonlar, prematür infantlarda daha çok serebral hemisferlerin beyaz cevherinde görülmekteyken, term yenido anlarda serebral korteks, serebellar hemisferler, bazal gangliyonlar, hipokampus gibi beyin bölgelerinin gri cevherinde görülmektedir. Bunlar n içinde hipokampus hipoksiye en duyarl bölgedir. Beyaz cevherin akut lezyonunda, glial elementlerin proliferasyonuyla reaktif gliozis meydana gelmektedir. Reaktif gliozis, sentrum semiovale ve korpus kallosum’un da içinde bulundu u serebral hemisferlerin periventriküler beyaz cevherinde olu maktad r. Postmortem çal malar, reaktif gliozis olu umunun, hipoksi-iskemiyle beraber sepsis, intrauterin enfeksiyon gibi çok say da nedene ba l olarak da ortaya ç kt n

(12)

göstermi tir. Akut hipoksik-iskemik beyin hasar nda görülen di er bir patoloji ise beyin ödemidir. Özellikle ciddi beyin hasar nda beyin ödemiyle beraber lateral ventriküllerde daralma, serebral giruslarda düzle me ve hipokampal yap larda herniasyon görülmektedir. Hipoksik-iskemik beyin hasar nda kronik lezyonlar çok çe itli olup term yenido anlarda akut dönemden en az üç hafta sonra geli mektedir (12).

H POKS K- SKEM K BEY N HASARI GEL M NDE HÜCRESEL MEKAN ZMALAR

Hipoksik iskemik beyin hasar nda kan beyin ak m n n ve oksijen da l m n n azalmas ile oksidatif yol kesintiye u ramakta ve anaerobik metabolizma hakimiyeti ba lamaktad r. Bu durum; adenozin trifosfat (ATP) üretiminin azalmas na, laktik asit birikimine ve hücresel fonksiyonlar n sürdürülmesinde yetersizli e neden olmaktad r (13). Enerji yetmezli i transsellüler iyon pompalar n n bozulmas na yol açmaktad r ve bunun sonucunda hücre içinde sodyum (Na+), kalsiyum (Ca++), klor (Cl-) ve su birikmektedir. Ayn zamanda enerji yetmezli i akson terminallerinden glutamat gibi nörotoksik eksitatör aminoasitlerin sal n m na neden olmaktad r. Glutamat; akut

dönemde sitotoksik ödeme katk da bulunmaktad r. Geç dönemde ise hücre içine Ca++

giri ini artt rmakta ve hücrede irreversibl hasara neden olmaktad r. Hipoksi-iskeminin hücre membran nda yapt hasar n sonucunda hücre sitoplazmas nda serbest ya asitleri birikmektedir, bunlar mitokondride indirgenme olaylar sonucu aç a ç kan serbest oksijen radikalleri ile peroksidasyona u ramaktad r. Bu olay takiben prostaglandin, ksantin, ürik asit sentezi ba lamakta ve bu kaskat n etkisiyle serbest radikallerin olu umu artmaktad r. Enerji yetmezli i nedeniyle plazma

membran ndan ç k azalan Ca++ ‘un hücre içinde a r birikimi, nörotoksisiteyle

sonuçlanan birçok membran, sitoplazma ve nükleer olaylar n geli mesine katk da

bulunmaktad r. Serbest radikaller içinde bulunan nitrik oksitin sentezi; Ca++ ve

nörotransmitterlerin etkisiyle uyar lmaktad r. Hücredeki enerji yetmezli i, asidoz

geli imi, glutamat ve nitrik oksit nörotoksisitesi, serbest radikal olu umu, Ca++

birikimi ve lipit peroksidasyonu hücre içi organellerde disfonksiyona, hücrenin yap sal bütünlü ünün bozulmas na ve sonuçta hücre ölümüne neden olmaktad r (14,15). Resusitasyon sonras ; serebral perfüzyonun ve oksijenizasyonun düzeldi i dönemde sekonder beyin hasar geli mektedir. Bu dönemde fosfor metabolitlerinin

(13)

konsantrasyonu ve intrasellüler pH bazal seviyelerine dönmektedir. Fosfokreatin/inorganik fosfat oran azalmaktad r. Takip eden süreçte kalsiyumun hücre içine al nmas , eksitatör nörotoksisitesi, serbest oksijen radikalleri ve nitrik oksit üretimi mitokondriyal fonksiyonlar n bozulmas na sebep olmaktad r. Sonuçta sekonder enerji yetmezli i olarak adland r lan dönem ba lamaktad r. Ayr ca bu dönemde endojen inflamatuar mediatörler beyin hasar n n artmas na katk da bulunmaktad r (13,16). Hipoksik iskemik hücre hasar mekanizmalar Nekil-1‘de gösterilmi tir.

(14)

ENERJ YETMEZL VE HÜCRE Ç AS DOZ GEL M

Beynin normal fonksiyonunu devam ettirebilmesi için yeterli oksijen ve glukozun bulunmas gereklidir. Nöronlarda glukozun y k m ile sa lanan enerji elektriksel uyar lar n iletimi ve biyosentetik reaksiyonlar için kullan lmaktad r. Fizyolojik artlarda glukozun pirüvata dönü ümü ile ba layan aerobik glikoliz yolu en önemli metabolik yoldur. Olu an pirüvik asit, mitokondri içinde Krebs siklusuna girmekte, elektron transferi ve NADH oksidadif fosforilasyonu ile ATP üretilmektedir (17). Dokuda hipoksi oldu unda mitokondri içinde oksijen parsiyel bas nc dü mekte mitokondrinin sitokrom sisteminde indirgenmi NADH ve FADH birikmektedir. ATP üretimi kesildi i için hücre içinde ADP ve AMP düzeyleri artarak anaerobik glikoliz uyar lmaktad r. ATP nöronlar da dahil olmak üzere tüm hücreler için en önemli enerji kayna d r. Aerobik yoldan net 36 molekül(M) ATP üretimine kar l k anaerobik yoldan sadece 2 M ATP üretimi olur (Nekil-2). Enerji üretim yetersizli i ATP ba ml iyon pompalar n etkilemekte ve sitotoksik ödem olarak adland r lan hücre içi Na ve Cl birikimine neden olmaktad r (18,19).

Hayvan ve insan çal malar perinatal serebral hipoksik iskeminin iyile me sürecinde sekonder enerji yetersizli inin devam etti ini göstermi tir. Gecikmi serebral enerji yetmezli i olarak da tan mlanan bu durum immatür s çanlarda, yenido an domuz yavrular nda, koyun fetüslerinde çal lm olup, iyile me döneminde 24-48 saat kadar devam etti i ve kal c beyin hasar n n geli imine önemli katk da bulundu u gösterilmi tir (12).

Hipoksik iskemi sürecinde oksijenin yoklu u ile oksidatif fosforilasyon kesintiye u ramakta ve pirüvat oksidasyon a amas nda bloke oldu u için laktata dönü mektedir (20). Enerji üretiminin öncelikle glikoliz yoluyla sa lanmas ATP üretiminin azalmas n n yan nda hücrenin asidifiye olmas na neden olmaktad r. Bir

molekül (M) glikozun anaerobik metabolizmas ile 2 M laktat ve 2 M H+

olu maktad r (21). Hücre içinde asidoz geli imi, glutamat reseptörleri arac l yla nörotoksisitenin artmas na neden olmaktad r (22,23).

(15)

ekil 2:Aerobik (Krebs siklusu) ve anaerobik yoldan (glikoliz) enerji üretimi

SERBEST OKS JEN RAD KALLER

Serbest radikaller (SR), d yörüngelerinde tek bir elektron içeren kimyasal türevlerdir. Bu durumda radikal ileri derecede reaktiftir, organik ve inorganik kimyasal maddelerle, nükleik asitlerle ve membranlarla tepkimeye girer. Serbest oksijen radikalleri (SOR) organizmada fizyolojik ko ullarda ve ya lanma sürecinde üretilmektedir. Baz patolojik süreçlerde a r miktarda SOR üretimi veya biyolojik

koruyucu mekanizmalar n çal mamas gibi durumlarda istenmeyen etkilerle

kar la lmaktad r. SOR, fizyolojik ko ullarda süperoksit dismutaz, endoperoksidaz, katalaz gibi endojen antioksidanlarla ve kolesterol, alfa-tokoferol, askorbik asit gibi koruyucu moleküllerin yard m yla h zl ca y k l r. Fenton veya Haber-Weis reaksiyonu, ksantin oksidaz enzimi, eikosonoid metabolizmas , katekolaminlerin katabolizmas , veya aktive olmu lökositlerde SOR olu umu gerçekle mektedir. Hipoksi-iskemi s ras nda ve sonras nda olu an SOR miktar fizyolojik koruyucu kapasiteyi a acak miktardad r ve bu süreçteki SOR üretiminde iki önemli yol vard r: Birincisi eikosonoid metabolizmas ve ikincisi ATP’nin y k m sonucu olu an ksantin yoludur. Beyinde miktar fazla olan ve hücre membran nda bulunan çoklu doymam

(16)

fosfolipidler SOR’lerin kayna d r. Ara idonik asitten prostoglandin (PG) olu umu

s ras nda SOR üretilmektedir ve bunu takiben lipid peroksidasyonu

gerçekle mektedir. Burada üretilen SOR hücre membran n n parçalanmas na ve hücre ölümüne neden olur. Adenin nükleotitlerinden ürik asitin sentezlendi i yol (ksantin yolu) di er SOR üretim yoludur. Hipoksi s ras nda ATP’ye fosforile olamayan AMP hücrede birikmektedir. Biriken AMP’den s rayla adenozin, inozin ve hipoksantin olu maktad r. Fizyolojik artlarda hipoksantin, ksantin dehidrogenazla önce ksantine, sonra ürik aside çevrilmektedir; ancak hipoksi durumunda hücre

içinde Ca++ konsantrasyonunun art ile ksantin dehidrogenaz enzimi proteaz

arac l yla ksantin oksidaza dönü ür. Reoksijenizasyon durumunda ise hipoksantin ksantin oksidaz ile tepkimeye girerek SOR olu turmaktad r (24,25). Serbest oksijen radikalleri d nda radikal olmayan reaktif oksijen türevleri de SR gibi davranmaktad r. Reaktif oksijen türevleri içinde süperoksit (O¯2), hidroksil (OH¯),

alkoksil (RO¯) ve peroksil (ROO¯) radikal olan gruptad r. Non- radikaller ise

hidrojen peroksit (H2O2), lipid peroksit (LOOH¯), hipoklorik asit (HOCL¯) ve

ozondur. Süperoksit, moleküler oksijene tek bir elektron eklenmesiyle olu maktad r. Normal ko ullar alt ndaO¯2radikalleri spontan olarak süperoksit dismutaz enzimiyle

H2O2’e dönü mektedir. Hidrojen peroksit ise baz metallerle tepkimeye girerek OH¯

radikalini olu turur. Hidroksil radikalleri SOR’lerin en reaktif olan d r ve hücre içindeki herhangi bir molekülle, örne in karbonhidrat, lipid, protein veya nükleik asit bazlar ndan herhangi birisiyle reaksiyona girerek sitotoksisiteye neden olmaktad r (26) (Nekil 3).

SOR bile iklerinden biri olan nitrik oksit (NO); nitrik oksit sentaz (NOS) aktivitesi ile arjininden üretilmekte ve organizmada çift yönlü etki gösterdi i bilinmektedir. Fizyolojik fonksiyonlar n gerçekle mesi için gereklidir ve antioksidan savunmaya katk da bulunmaktad r. A r üretim durumunda radikal etki göstermekte ve peroksinitrit gibi daha güçlü radikal bile iklerin olu mas na neden olmaktad r

(27). Serebral iskemi s ras nda massif intrasellüler Ca++ birikimi ile NOS aktive

olmaktad r. Nitrik oksit, gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz aktive ederek glikolitik yolu kesintiye u ratmaktad r ve mitokondriyal elektron transport zinciri elemanlar n inhibe etmektedir. Bu etki sonucunda ATP üretimi bozulmaktad r. Ayr ca NO, OH¯ gibi daha reaktif SR olu umu için di er SR’lerle reaksiyona girebilmekte ve oksidatif metobolizmay etkileyerek nörotoksik etki göstermektedir (14).

(17)

Fizyolojik artlarda demir (Fe) ferritin, transferrin gibi proteinlere ba l ve non-toksik ferrik durumda bulunur. Hipoksi-iskemi s ras nda proteinlerden serbest ferrik demir sal n m olmakta ve demir hidroksil radikaline dönü mektedir. Ayr ca serbest ferrik demir, ferröz formun azalmas na neden olarak hasar n art na katk da bulunmaktad r (28).

ekil 3: Serbest oksijen radikallerinin olu um mekanizmalar

EKS TATÖR NÖROTRANSM TTER VE NÖROTOKS S TE

Serebral hipoksi iskemi sürecinde eksitatör aminoasitler (EAA) nörotoksik etki göstermektedirler. En önemli EAA olan glutamat n ekstrasellüler konsantrasyonu dü üktür ve bu denge nöronal ve glial hücrelerin geri al m mekanizmalar yard m yla sa lanmaktad r. Fokal serebral iskemide ekstrasellüler glutamat konsantrasyonu 2,5 ile 40 kat artt gösterilmi tir. Artan glutamat hücre içine letal düzeyde Ca++ giri ine neden olmaktad r. Bununla beraber enerji yetmezli i nedeniyle glutamat n presinaptik geri al n m bozulmakta ve ekstrasellüler konsantrasyonu artmaktad r (29,30).

(18)

Glutamat 2 tip glutamat reseptörü ile etki göstermektedir (Nekil 4). Birincisi metabotropik glutamat reseptörleridir. Amino asit dizilimlerine göre bu reseptörler 3 s n fa ayr lmaktad r.

Birinci s n fta: Metabotropik glutamat 1.reseptör (mGluR1), metabotropik glutamat 5.reseptör (mGluR5)

-kinci s n fta: Metabotropik glutamat 2.reseptör (mGluR2), metabotropik glutamat 3.reseptör (mGluR3)

Üçüncü s n fta: Metabotropik glutamat 4.reseptör (mGluR4), metabotropik glutamat 6.reseptör (mGluR6), metabotropik glutamat 7.reseptör (mGluR7) ve metabotropik glutamat 8.reseptör (mGluR8) bulunmaktad r.

Her s n f n farkl sinyal iletim mekanizmalar vard r. Birinci s n f metabotropik glutamat reseptörleri fosfolipaz C’yi aktive etmektedir, bunun sonucunda hücre içi diaçilgliserol ve inozitoltrifosfat düzeyi artmakta ve inozitoltrifosfat duyarl depolardan Ca sal n m ve protein kinaz aktivasyonu gerçekle mektedir. Buna kar l k 2. ve 3. s n f metabotropik glutamat reseptörleri adenil siklaz enzimini inhibe ederek etki göstermektedirler. Presinaptik ve postsinaptik metabotropik glutamat

reseptörlerinin fonksiyonlar yerle im yerlerine göre de i mektedir. Yap lan

çal malarda bu reseptörlerin direkt aktivasyonlar yla ili kili olarak nöroprotektif kan t bulunamam t r (29).

Glutamat n reseptörlerinin ikincisi iyonotropik glutamat reseptörleridir. Bunlar N-metil-D-aspartat (NMDA), 5-metil-4-izoksazol propiyonik asit (AMPA) ve kainat (KA) reseptörleridir. NMDA reseptörleri hipokampusun CA1 bölgesinde, talamusta, striyatumda, serebellumun purkinje ve granül hücrelerinin bulundu u tabakalarda ve serebral korteksin 3. 5. ve 6. tabakalar nda bulunmaktad r. AMPA reseptörleri serebral korteksin derin tabakalar nda, talamusta, striyatumda, serebellumun moleküler tabakas nda, striyatum lusidum tabakas nda, hipokampusun piramidal hücreleri içinde, KA reseptörleri ise sadece hipokampusun striyatum lusidum tabakas nda bulunmaktad r. -lginçtir ki perinatal nöronal hasarlanmada hipokampus, serebellum ve bazal gangliyonlar s k tutulan bölgelerdir ve ayn zamanda bu bölgelerde çok say da glutamat nöronu bulunmaktad r. NMDA, AMPA ve KA

reseptörlerinin aktive olmas durumunda Ca++ kanallar aç larak hücre içi serbest

Ca++’da art olmakta bunun sonucunda da aktive olmu proteaz, lipaz ve

(19)

ekil 4: Glutamat reseptörleri

HÜCRE Ç KALS YUM B R K M

Kalsiyum çe itli hücresel reaksiyonlarda kofaktör olarak rol oynar. Nöronal

fonksiyonlarda ve nöronal metabolizmada Ca++ homeostaz n n etkisi önemlidir.

Hücre içinde %100’e yak n bir k sm organellere ba l d r ve serbest Ca++

konsantrasyonu oldukça dü üktür. Bu organellerden en önemlisi endoplazmik

retikulum ve mitokondridir. Ayr ca Ca++ daha az miktarlarda nükleus ve plazma

membran na ba l halde bulunur. Hücre içi serbest Ca++ konsantrasyonu ise sitozole

da lm olan spesifik Ca++ ba layan proteinlerin yard m yla, dü ük düzeylerde

tutulmaktad r (33). Fizyolojik artlarda iyon veya reseptör ba ml kanallarla hücre

içine giren Ca++, plazma membran ve hücre içi organellerde birikmektedir. Plazma

membran ndaki Ca++- Na+ de i im kanal ve ATP’ye ba ml Ca++ kanal ,

mitokondrideki Ca++ kanal ve endoplazmik retikulumdaki ATP’ye ba ml Ca++

kanal , hücre içindeki Ca++ düzeyini dengede tutmaktad r. Hipoksi-iskemi

durumunda intrasellüler depolardan sal n m ve plazma membran ndan geçi in art

veya d ar ya sal n m n azalmas nedeniyle sitozolik serbest Ca++ konsantrasyonu

artmaktad r (34). -ntrasellüler serbest Ca++ konsantrasyonunun patolojik olarak

artmas , hücreye toksin etkisi yapmakta; nöronal fonksiyonlarda y k c bozukluklarla sonuçlanan bir dizi reaksiyona sebep olmaktad r. Bu reaksiyonlar lipaz, proteaz, endonükleaz, fosfolipaz C aktivasyonu, ksantin ve prostoglandinlerin üzerinden

(20)

serbest radikallerin olu umudur. Sonuç olarak mitokondride oksidadif fosforilasyon ve buna ba l olarak enerji yap m gerçekle emedi i için mitokondriyal membranda iyon gradienti bozulmakta ve hücre depolarize konuma gelmektedir. Bu durum glutamat n sinaptik aral a sal nmas na sebep olmaktad r. AMPA, KA ve NMDA gibi glutamat reseptörlerinin uyar lmas yla da hücre içine fazla miktarda Na+ve Ca++

giri i olmaktad r. Hücre içinde artan serbest Ca++, plazma membran n n bozulmas na

ve hücre ölümüne neden olmaktad r (12,35).

NFLAMATUAR HÜCRELER VE MED ATÖRLER

-skemik beyin hasar nda karaci erden akut faz reaktanlar sal n m yla sistemik akut faz yan t olu maktad r. Lökositlerin mobilize olmas , serum glukokortikoid ve sitokin düzeylerinin artmas , beyinde inflamatuar yan t ba latmaktad r (36). Sistemik sirkülasyonda lökositlerin say s n n artmas n takiben nöral parankimde lokal olarak proinflamatuar sitokinlerin ve kemotaktik moleküllerin üretimi gerçekle mektedir (37). Eri kin beyninde hipoksik-iskemiden 4 ile 6 saat sonra nötrofil migrasyonu olmas na kar l k yenido an beyninde hipoksik-iskemiden 42 saat sonra nötrofil migrasyonu olmaktad r. -skemik dokuda nötrofillerden sonra lenfosit say s n n artt gösterilmi tir (38,39). Lökositler adezyon moleküllerinin yard m yla vasküler endotelyuma yap rlar. Ekstrasellüler matriks, glia, nöronlar ve mikrovasküler yap dan olu an nörovasküler ünitede inflamatuar de i iklikler ve mediatörlerin sal n m ba lamaktad r. Bu mediatörlerin içinde sitokinler, kemokinler, reaktif oksijen türevleri, ara idonik asit metabolitleri yer almaktad r (40). Hipoksik iskemide enerji yetmezli i ve kan ak m n n bozulmas kalsiyumun hücre içinde birikimi ile sonuçlan r. Kalsiyum, gliserofosfolipidleri hidrolize eden fosfolipaz A2‘nin aktive olmas na ve ara idonik asit metabolitlerinin sal n m na neden olmaktad r. Siklooksijenaz ve lipooksijenaz enzim kompleksleri ile ara idonik asit metabolize olmakta; prostaglandin (PG) ve lökotrien (LT) olu maktad r. PG’ler ve LT’ler, serbest radikallerin üretimini ve inflamasyonu art rarak beyin zedelenmesine katk da bulunmaktad rlar (41).

SKEM VE H POKS K- SKEM K HÜCRE ÖLÜMÜ

-skemi, dokuyu perfüze eden kan ak m ndaki yetersizli e ba l olarak geli mektedir ve geriye dönü ümlü veya dönü ümsüz hücre hasar na neden

(21)

olmaktad r (42). Hipoksiden farkl olarak, glikoliz için gerekli maddeler de dokuya ula mamaktad r ve bu maddeler tükendi inde anaerobik enerji üretimi durmaktad r. Bu nedenle iskemi, dokularda, hipoksiden daha h zl hücre hasar na yol açmaktad r (43,44). -skemik dokularda kan ak m düzeldi inde SR’ler olu maktad r ve iskemi-reperfüzyon hasar meydana gelmektedir (42). Hayvan çal malar nda 3 çe it iskemi modeli kullan lmaktad r. Bunlar; global iskemi (beynin tüm bölgelerinde iskemi olu turulmas ), fokal iskemi (beynin bir bölgesinde iskemi olu turulmas ) ve hipoksi/iskemi (tek tarafl karotis arteri ba lanmas ve beraberinde hipoksi uygulanmas )’dir (45).

Beyin bölgelerinin iskemiye duyarl l k dereceleri ayn de ildir. Baz bölgeler (hipokampusun CA1 bölgesindeki piramidal hücreler, limbik sistem, serebellumun purkinje hücreleri, korteksin 3. 5. ve 6.tabakalar n n ve striyatumun küçük ve orta büyüklükteki nöronlar ) iskemik hasara daha duyarl d r. Nörotransmiterlerin ve reseptörlerin yap lar na, spesifik anatomik ve sinaptik ba lant lar na ba l olarak nöronlar n iskemiden etkilenme dereceleri de i mektedir (46).

Hücre ölümünün iki çe iti vard r. Bunlardan apopitozis genellikle bir hücrede veya hücre grubunda, plazma zar bütünlü ü bozulmadan, yap sal ve nükleer proteinlerin parçalanmas eklindedir. Aktif bir süreçtir. Di er bir hücre ölüm ekli olan nekroz ise iskemi ve mekanik travma gibi çevresel de i iklerin neden oldu u fizyolojik olmayan, pasif bir süreçtir. Hipoksik iskemi sonras nda her iki proçesin birden ortaya ç kt , insan ve hayvan çal malar nda gösterilmi tir (47-50).

FEN TO N

Non-sedatif antiepileptik bir ilaçt r. Fizyolojik sistem üzerinde çe itli etkileri bulunmaktad r. Sodyum, potasyum ve kalsiyumun membran potansiyelleri üzerinde etkilidir. Norepinefrin, asetilkolin ve GABA gibi nörotransmitterlerin konsantrasyonunu de i tirir. Nöronlarla yap lan hücre kültür çal malar nda

fenitoinin aksiyon potansiyelini bloke etti i gösterilmi tir. Yüksek

konsantrasyonlarda serotonin ve norepinefrin sal n m n inhibe eder, dopamin geri al m n artt r r, monoamin oksidaz aktivitesini inhibe eder. Kalsiyumun hücre membran ndan geçi ini engeller ve bu ekilde kalsiyum ba ml sekretuar i levler

(22)

üzerinde inhibitör etki gösterir. Biyokimyasal süreçler üzerinde bu etkileri tam aç k de ildir; ancak terapötik dozlarda sodyum kanallar n bloke etti i ve tekrarlayan aksiyon potansiyellerini inhibe etti i bilinmektedir. Oral absorbsiyonu tamd r, yar lanma süresi 12 ile 36 saat aras ndad r. Plazma proteinlerine yüksek oranda ba lan r. Üremi veya hipoalbuminemi durumlar nda, klinik bulgularla serbest fenitoin düzeyi aras ndaki korelasyon aç k de ildir. Serebrospinal s v daki konsantrasyonu plazma düzeylerinden ba ms zd r. Beyin, karaci er, kas ve ya hücrelerinin endoplazmik retikulumunda birikir (51). Yüksek dozda kullan ld nda nistagmus, ataksi ve diplopi ortaya ç kabilir, yine yüksek dozda sedatif etkisi vard r. Uzun süreli kullan mda D vitamini metabolizmas n bozarak osteomalaziye neden olabilir (52).

H POKAMPAL FORMASYON

Hipokampal formasyon; ‘hipokampus’, ‘gyrus dentatus’, ‘subikulum’, ‘presubikulum’, ‘parasubikulum’, ‘area entorhinalis’den olu maktad r (53).

H POKAMPUS

Filogenetik olarak beynin en eski bölümlerinden biri olan hipokampus, lateral ventrikülün arka boynuz taban boyunca uzanan, yakla k 5-8 cm uzunlu unda bir gri cevher tabakas d r. Koronal kesitlerde ‘C’ harfi eklinde görülür ve ‘C’ harfinin konveks yüzü ventrikül bo lu una, konkav yüzü ise hemisferin alt yüzüne do ru yönelmi tir. ‘Cornu Ammonis’in ba harflerini temsilen CA olarak da ifade edilebilen hipokampus, hücre yap s ndaki de i ikliklerden dolay CA1, CA2, CA3 ve CA4 gibi farkl alanlara bölünmü tür. Bunlardan CA1 ‘subikulum’a, CA4 ise ‘gyrus dentatus’a en yak n olan aland r (54).

Histolojik olarak; hipokampus, çe itli tabakalardan olu maktad r; bunlar ventriküler yüzeyden ba layarak derine do ru u ekilde s ralanmaktad r:

1-Alveus: Subikulum ve hipokampusa ait piramidal hücre aksonlar n içerir. 2-Stratum oriens: Esas olarak piramidal hücrelerin bazal dendritleri ile internöronlar n yerle ti i tabakad r.

3-Stratum piramidalis: Hipokampusa esas ekli buradaki piramidal hücrelerin dizilimi vermektedir.

(23)

4-Stratum lusidum: CA1 ve CA2‘de bulunmaz, CA3 alan ndaki piramidal hücrelerle ba lant y sa layan lifleri içerir.

5- Stratum radiyatum 6- Stratum lakunosum 7- Stratum molekulare

Hipokampusta uyar lar n al nmas afferent yollarla, uyar lar n iletilmesi efferent yollarla sa lanmaktad r (55). ‘Area entorhinalis’den gelen duyular hipokampusa ileten ba l ca afferent yollar: ‘Perforant yollar’, ‘Mossy lifleri’, ‘Schaffer kollateralleri’ ve ‘alvear lifler’ dir. En önemli efferent yol ise forniks’dir

(56).Hipokampusun yap s karma kt r. Beyinde bir çok bölge ile ba lant l olmas ,

fonksiyonlar n n aç klanmas n güçle tirmektedir. Emosyonel davran lar m z

yöneten limbik sisteme dahil bir yap d r; uyar lmas yla bir çok endokrin ve davran sal de i ikliklerin ortaya ç kt gözlenmi tir. Limbik sistemle ili kili olarak görme, i itme, dokunma, iç organ duyular n al r ve davran sal sonucun geli imine katk da bulunur. K sa süreli haf za üzerine etkilidir, sa hipokampus görsel, sol hipokampus sözel haf za ile ilgili fonksiyonlarda daha fazla aktivite göstermektedir (57,58).

(24)

ekil 5: Hipokampal formasyonun ba lant lar

SIÇANLARDA H POKAMPUS

S çanlar, deneysel çal malarda en s k kullan lan, birçok farmakolojik deneylerde ve kanser ara t rmalar nda in-vivo model olu turulan hayvan türlerindendir. S çanlar n do umdan sonraki 15 gün içerisinde beyin ve vücut a rl klar orant l olarak artar ancak daha sonraki dönemde beyin a rl , vücut a rl na göre daha yava bir h zda artmaya devam eder. Ortalama vücut a rl klar ile ortalama beyin a rl klar aras nda bir ili ki yoktur. Wistar Albino Cinsi S çanlar orta derecede do urgan ve enfeksiyonlara oldukça dirençli bir türdür (59).

Bütün memelilerde hipokampusun yap sal organizasyonu birbirinin benzeridir. S çanlarda hipokampal formasyon dört basit kortikal bölgeyi kapsar (Nekil 5).

(25)

2-Hipokampus,

3-Subikular kompleks ve 4-Endorhinal korteks’dir.

Hipokampus ; uzun eksen boyunca k vr lm ‘C’ harfi eklindedir ve temporal lobun ventrokaudalinde uzan r. Dört alt bölümden biri olan CA4, polimorfik hücrelerden olu ur ve ‘gyrus dentatus’un hilusuna uyan bölgedir. Piramidal hücre tabakas hacim olarak birbirine yak n büyüklükte iki bölüm (CA1 ve CA3) ‘dür. Bu iki bölgenin aras ndaki geçi bölgesine CA2 denir. Gyrus dentatusa ve hilusa yak n olarak uzanan bölge, piramidal nöronlar n hücre gövdelerini içerir. Subiculum, kendine kom u hipokampustan daha az yo un piramidal hücre içerir (60).

(26)

3. GEREÇ VE YÖNTEM

Deneysel çal maya ba lamadan önce Pamukkale Üniversitesi T bbi Etik Kurulu’ndan Etik Kurul onay al nd ve 01.04.2006- 01.05.2007 tarihleri aras nda çal ld . Yenido an s çanlar n kullan ld bu çal ma; deney hayvanlar çal ma eti i kurallar na uygun sekilde, Pamukkale Üniversitesi T p Fakültesi Deney Hayvanlar Laboratuvar ’nda yap ld . Histolojik çal malar Anatomi Anabilim Dal Laboratuar ’nda ve Patoloji Anabilim Dal Laboratuar ’nda gerçekle tirildi.

Her iki cinsten, toplam 24 adet Wistar yenido an s çan, Pamukkale Üniversitesi Deney Hayvanlar Birimi yard m yla seçilerek rastgele 4 gruba ayr ld . S çanlar n bak m , alt plastik kapl , üstü tel olan özel kafeslerin içinde yap ld . Yenido an s çanlar; çal ma öncesi ve sonras nda, annelerinin yan nda tutuldu, ayr ca çal ma süreci de dahil olmak üzere oda s s nda (22±2 °C), %50±5 nem ortam nda, 12’ er saatlik ayd nl k-karanl k siklusu bulunan bir ortamda takip edildi. Bu çal mada; term insan yenido an beynine benzerlik gösteren 9-12gr a rl nda onüç günlük s çanlar ve Levine’in modifiye hayvan modeli kullan ld . Bu modelin yard m yla; miad nda do mu , hipoksik iskemik ensefalopatili yenido anlar n beyin hasar na histopatolojik aç dan benzeyen, tek tarafl beyin hasar olu turuldu (61,62).

Çal ma gruplar :

1.grup: Cerrahi stres olu turulan ve sadece boynun sol taraf na insizyon aç l p kapat lan grup, ( 6 adet yenido an s çan)

2.grup: Hipoksi iskemi sonras intraperitoneal (i.p.) salin (% 0.9 NaCl) uygulanan grup, ( 6 adet yenido an s çan)

Tedavi grubu fenitoin 1 (TG-F1): Hipoksi iskemi sonras 20mg/kg i.p. fenitoin (Phenytoin Antijen) uygulanan grup, ( 6 adet yenido an s çan)

Tedavi grubu fenitoin 2 (TG-F2):Hipoksi iskemi sonras 30mg/kg i.p. fenitoin (Phenytoin Antijen) uygulanan grup, ( 6 adet yenido an s çan) eklinde olu turuldu.

(27)

H POKS - SKEM MODEL

Anestezi uygulanan s çanlar (20mg/kg/doz ketamin i.p.(Ketalar)) ameliyat masas üzerine al nd . S çanlar s rtüstü olarak yat r ld . Dört ekstremite toplu i ne yard m yla tahta levha üzerine sabitlendi ve boyun hiperektansiyonda olacak ekilde pozisyon verildi. Antiseptik solüsyonla ile temizlenen boyun bölgesine, vertikal olarak ve orta hatta 0,5-1 cm’lik cilt, cilt alt insizyonu yap ld . -nsizyon hatt ndan boynun sol taraf na girilerek incelenen dokuda, sol a.carotis communis yeri bulundu ve 5/0 ipek ile ba land . - lem sonras kar taraf kas grubunda seyirme ve a.carotis communiste ba lanmadan önceki pulsasyonun, ba lanmadan sonra kayboldu u gözlendi. Cerrahi i lem s ras nda a.carotis communiste y rt lma veya kopma olan deneklerle, kanama veya anesteziye ba l komplikasyon geli en denekler çal maya dahil edilmedi. S çanlar n vücut s s 36,5-37 °C tutularak hipotermiden korundu. Alt adet s çanda aç lan insizyon hatt , a.carotis communis ba lanmadan kapat ld ve bu grup 1.grup olarak ayr ld . -nsizyon yeri dikildikten sonra beslenmeleri için 2 saat annelerinin yan na b rak ld . Ard ndan 1.grup hariç di er gruplara ait yenido an s çanlar, hipoksi kabinine al nd . Burada hayvanlara nemlendirilmi %92 nitrojen ve %8 oksijen kar m , 1,5 saat süre ile solutuldu (63,64).

LAÇ VE SERUM F ZYOLOJ K VER LMES

Birinci grup d ndaki denekler hipoksi kabininden ç kar ld ve 5 dakika normal atmosfer havas nda b rak ld . Bunu takiben 2.grup s çanlara 0,1 ml serum fizyolojik,

TG-F1 grubuna 20mg fenitoin (Phenytoin Antijen-ampul) (0,1ml serum fizyolojik

içinde 20 mg/kg), TG-F2 grubuna 30mg fenitoin (Phenytoin Antijen-ampul) (0,1ml serum fizyolojik içinde 30 mg/kg) i.p. olarak uyguland .

DOKUNUN HAZIRLANMASI

Yenido an s çanlar hipoksi-iskemi modeli olu turulduktan sonraki 8. günde dekapitasyon ile sakrifiye edildi. Bu i lem anestezi dozunda ketamin i.p. olarak uyguland ktan sonra yap ld . Ç kar lan beyin dokular Patoloji Anabilim Dal Laboratuar ’nda -15C°’ye ayarlanm olan kriyostat cihaz na konuldu. Kriyostat cihaz nda dondurulan beyin dokular ndan 150 mikrometre kal nl nda horizontal

kesitler al nd . Lamlar üzerine al nan kesitler ayn laboratuar artlar nda

(28)

KES TLER N BOYANMASI

Kesitler s rayla %96-90-80 ve 70’lik alkol içeren kaplarda 10 dakika bekletildi. Bu i lemden sonra suda y kanan preparatlar Hematoksilen’de 2,5-3 dakika bekletildi ve tekrar suda y kand . Asit-alkol solüsyonuna dald r l p ç kart lmas n n ard ndan amonyak solüsyonunda 1-2 dakika bekletildi. Tekrar suda y kand ve Eosin solüsyonu içinde 3-5 saniye b rak ld ktan sonra yukar da belirtilen alkol solüsyonlar ndan tekrar geçirildi. Bu i lemi takiben ksilol içine al nan preparatlar 30 dakika bekletildikten sonra entellanla kapat ld . Kesitler k mikroskobu alt nda 4, 10, 20, 40 ve 100’lük büyütmeler kullan larak incelendi. Kesitlerde tüm beyin dokusu görülerek sa veya sol hemisfer ay r m yap ld .

STEREOLOJ K YÖNTEMLER

Gerçekte üç boyutlu olan biyolojik yap lar mikroskopta iki boyutlu kesit görüntüleri verirler. Bu iki boyutlu olarak gözlenen yap veya cisimlerin üç boyutlu özelliklerini ortaya ç karmak için geli tirilmi bir bilim dal olan stereoloji, ilk kez 1961 y l nda Elias taraf ndan kullan lm , 1984 y l nda Sterio taraf ndan etkin ve tarafs z metotlar n tarif edilmesiyle yeni bir anlay a kavu mu tur (64,65). Bir yap n n veya organ n hacim, yüzey alan gibi de erlerinin hesaplanmas , yap içerisinde bulunan farkl bile enlerin birbirlerine göre hacim, uzunluk, alan v.b. yo unluklar n n bulunmas , bir yap daki toplam tanecik say s n n ortaya ç kar lmas gibi çal malar stereolojinin önemli konular n olu turmaktad r. Biyolojik yap lara ili kin bu tip say sal verilerin elde edilmesinde kullan labilecek bir çok yöntemin olmas bu yöntemler aras nda en uygun ve güvenilir olan n n seçilmesini gerektirmektedir. Önemli olan biyolojik yap larda herhangi bir niceli i hesaplar veya ölçerken, yap dan tarafs z, yani gerçek de erden sistematik bir sapma göstermeyen sonuçlar n elde edilmesini sa layacak bir yöntemin seçilmesidir. Stereolojik yöntemlerin en önemli özellikleri etkin, tarafs z ve kesin olmalar d r. Bu yöntemlerle beyindeki toplam nöron say s , sinaps yo unlu u veya toplam beyin hacmi ölçülebildi i gibi, örne in böbrekte korteks-medulla oran , toplam glomerül say s , vücuttaki damarlar n toplam uzunluklar , ince ba rsaklar n toplam yüzey alanlar vb. gibi hesaplamalar da yap labilir (65). Stereolojik yöntemler ilgilenilen yap n n sistematik-tekdüze-rastgele olarak elde edilmi örnekleri üzerinde ölçümler yaparak, o yap daki söz konusu say sal niceli in belli ve istatiksel olarak kabul edilebilir bir

(29)

hata pay dahilinde hesaplanmas na dayanmaktad r. Makroskopik bir yap n n paralel kesitlere ayr lmas , bu kesitlerin mikroskopta incelenmesi, ilgilenilen doku bile enlerinin taranmas , mikroskoptaki görüntü alanlar nda ard k görüntülerin kar la t r lmas , kesit kal nl n n ölçülmesi gibi basamaklar n dikkatli ve kurallara uygun gerçekle tirilmesiyle güvenilir sonuçlara ula lmaktad r. Stereolojik yöntemlerin kuramsal, pratik ve sade olu u birçok yeni yöntemin h zla literatüre kat lmas n ve bu yöntemlerin morfometrik çal malarda ‘alt n standart’ olmas n sa lamaktad r (66).

Stereolojik metotlar n temel ilkelerinden birisi ‘sistematik rastgele örnekleme stratejisi’dir. Klasik rastgele örnekleme herhangi bir s ralama gözetmeksizin her örne in bir öncekinden ba ms z ve tamamen rastgele olarak seçildi i bir yöntemdir. Bunun aksine sistematik rastgele örnekleme rastgele seçilen bir ba lang ç noktas ndan ba lanarak sabit ve önceden belirlenmi aral klarla seçim yapmay içerir. Sistematik olmas , örneklemenin önceden belirlenmi aral klarla yap lmas ; rastgele olmas , bu sistematik örneklemenin belirlenen örnekleme aral içerisindeki rastgele bir say ile ba lamas d r. (67).

OPT K D SEKTÖR VE OPT K PARÇALAMA

Fiziksel disektörün mant ndan yola ç k larak olu turulmu optik disektör metodu stereolojik bir metoddur, oldukça pratik ve etkin bir yöntemdir. Bu yeni yöntem 1986’da Gundersen taraf ndan ortaya konulmu olup ara t r c y fiziksel olarak iki ayr kesitte kar la t rma yapma zahmetinden kurtarmaktad r. Tek bir kal n kesit hacmi içerisinde ard ard na al nan optik kesitlerden faydan larak, seçilen örnekleme alan nda tanecik say m yap lmas na olanak verir. Optik disektör yönteminde al nacak kesit kal nl , say lan en uzun partikülden daha büyük olmal d r. Bu de er genellikle 20 µm ve daha üstü olarak al n r. Kesitlerde disektör say m kurallar n n uygulanmas , yani iki boyutlu say m çerçevesinin üç boyuta sanal olarak aktar lmas yla mikroskop ba nda ya da monitör görüntüsünde partikül say m yap labilir. Partikül say m nda öncelikle kesitin üst yüzeyinden ba lanarak odaklama yap l r. Görüntünün ilk netle ti i yüzey kesitin üst yüzeyi, görüntü netli inin kayboldu u yer kesitin alt yüzeyi olarak belirlenir. -ki yüzey aras ndaki partiküller say larak kaydedilir. Alt ve üst yüzey aras mesafe mikrokator ad verilen bir aletle ölçülebilir, ayn zamanda bu ölçüm kalibre edildi i yöntem ile de yap labilir. Kesit

(30)

yüzeylerindeki artefaktlar ekarte edebilmek için alt ve üst güvenlik ku a denilen mesafede partikül say m yap lmaz. Optik disektör yüksekli i partikül say m n n yap ld bölgedir. Toplam disektör partikül say s , toplam disektör hacmine bölünürse say sal yo unluk elde edilir, say sal yo unluk de eri, yap n n toplam hacmiyle çarp l rsa toplam partikül say s na ula l r (68). Optik parçalama, incelenecek bölge hacminin tek tip sistematik rastgele örnekleme ile elde edilen bir bölümünde, üç boyutlu say m yöntemi ile olan optik disektörle hücre say m d r. Önemli özelli i dokudaki ekil de i ikliklerinden, fiksasyon, takip, gömme, kesit alma, boyama gibi histolojik i lemler nedeniyle olu abilecek büzü me veya i me gibi olaylardan etkilenmemesidir. Doku, kesit ve kesit alan seviyelerinde örnekleme yap l r. Örneklenen bölgelerin, ilgilenilen yap n n kaçta kaç na kar l k geldi inin bilinmesiyle yap n n tamam n n say m yerine küçük bir parças örneklenmi olur. Örneklenen k s mdan elde edilen partikül say s , bu parçan n ana yap ya oranlar ile çarp l rsa toplam partikül say s na ula lm olur (66-69).

Stereolojik yöntemin tarafs z ve do rulu unun yüksek olmas ‘tarafs z say m çerçevesi’ temeline dayanmaktad r. Partikül say s n n say m çerçevelerinden kaynaklanan hatalar nedeniyle farkl ç kmas na ‘kenar etkisi’ denir. Bunu ortadan kald rmak amac yla, etraf nda özel bir emniyet alan olu turulan bir say m çerçevesi kullan lmaktad r. Bu çerçeve birbiriyle kesi en iki kenar kal n ve düz, di er iki kenar ince ve kesikli çizgi ile çerçevelenmi kare veya dikdörtgen eklindedir. Say m s ras nda, sol ve alt kenarlar ile bunlar n uzant lar na de en yap lar dikkate al nmazlar (yasak kenarlar). Yaln zca çerçevenin tamamen içerisinde olan veya sa ve üst kenarlara (serbest kenarlar) de erek k smen çerçeve içerisinde olan yap lar say l r (60,68,72).

Optik parçalama yöntemine göre hücre say s n n hesaplanmas için; kesit örnekleme oran , alan örnekleme oran , kesit kal nl n n ölçümü, kal nl k örnekleme oran ve hata katsay s de eri gerekmektedir.

KES T ÖRNEKLEME ORANI(KeÖO)

Kriyostat -15°C'ye ayarlanarak her s çan beyninden 150 µm kal nl kta

kesitler al nd . Sistematik rastgele örnekleme yöntemi uygulanarak, iki kesitten biri at l p biri al nd ve beyin dokusu bitinceye kadar devam edildi. Kesitler lam üzerine al narak numara verildi, lam ta y c lar na yerle tirilerek boyand , boyanan

(31)

kesitlerde hipokampus alan içerenlerin tümünde say m yap ld . Bu ekilde kesit örnekleme oran ½ oldu (70,71,72).

ALAN ÖRNEKLEME ORANI (AÖO)

Sistematik rastgele örnekleme ile seçilmi olan kesitler, tarafs z say m

çerçevesi içerisinde, mikroskopta belli aral klarla x ve y eksenleri boyunca taran r. Alan örnekleme oran tarafs z say m çerçevesinin, x y ad mlamaya oran olarak hesaplan r (69).

Çal mam zda Thoma lam mikroskoba konulup bir küçük kare X100 büyütmede belirlendi. Görüntü, mikroskoba monte edilmi video kamera (Sony Exwave HAD Color Video Camera SSc-DC88P) ile bir monitöre (Sony LCD monitorLMD-2010) aktar ld . Bir küçük karenin monitöre yans yan görüntüsü netle tirildikten sonra monitör üzerine asetat ka d yerle tirildi. Asetat ka d na

aktar lan görüntü üzerinde kenar uzunlu u 50µm (0.05 mm) olan bir kare elde edildi

ve bu asetat kalemi ile çizildi. Kesitlerde hipokampus alan X100 büyütme ile incelendi. Kesit görüntüsünde x ekseninde 600 µm aral klarla ve y ekseninde 50 µm aral klarla ad mlama yap ld (72). Böylece bu iki eksendeki ad mlama alan (x, y

ad mlama)= 600 µm x 50 µm = 30 000 µm2 olarak bulundu. Asetat üzerinde elde

edilen bu kare içine kenarlar 10 µm olacak ekilde bir çerçeve çizildi. Serbest ve

yasak kenarlar belirlendi (birbirine dik olan sol ve alt kenar yasak, di er iki kenar serbest olarak kaydedildi). Asetat ka d üzerindeki, çerçeve içeren kare ekli, monitör üzerine yap t r larak tarafs z say m çerçevesini uygulamak için kullan ld . Sol hipokampus CA1, CA2, CA3 stratum piramidale tabakas , x ve y ekseninde yukar da tan mlanan aral klarla tarand . Her ad mlama sonucu monitöre gelen görüntünün tamam nda say m yap lmayarak, sadece ölçüleri önceden tespit edilen tarafs z say m çerçevesinde say m yap ld . Tarafs z say m çerçevesinin kenar

uzunluklar 10 µm, tarafs z say m çerçevesinin alan 100 µm2 olarak bulundu.Buna

göre AÖO 100 µm2/ 30 000µm2= 1/300 olarak hesapland .

KES T KALINLI ININ ÖLÇÜMÜ

Çal mam zda bir lamelin alt ve üst yüzeylerine mavi ve k rm z renkte birer çizgi çizilerek bu lamel bir lam üzerine yap t r ld . Mikroskopta, mikrovida

(32)

döndürülerek lamel üst yüzeyine çizilen k rm z çizgi netle tirildi. Bu durumdaki mikrovida de eri derece olarak kaydedildi ve lamelin üst yüzeyi olarak kabul edildi. Daha sonra mavi çizgiye ula ncaya kadar mikrovida döndürüldü. Mavi çizgi hizas ise lamelin alt yüzeyi olarak kabul edildi ve bu noktadaki de er de derece olarak kaydedildi. K rm z ve mavi çizgiye tekabül eden iki de er aras ndaki fark

hesapland . Mikrovidadaki de erlerin gerçek kar l n bulmak için, lamel

k r ld ktan sonra dik olarak mikroskop alt na yerle tirildi. Daha önceden Thoma

lam kullan larak kalibre edilmi monitör ekran nda lamelin gerçek kal nl

saptand . Bu ölçüm, lamelin gerçek kal nl ile mikrovida döndürülerek bulunan de erlerin kar la t r lmas için yap ld . Böylece mikrovidadaki 1 derecelik hareketin

kaç µm’ye kar l k geldi i bulunmu oldu. Çal mam zda mikrovidadaki 1 derecelik

hareketin 0,5 µm’ye kar l k geldi i belirlendi. I k mikroskobunda, mikroskobun

mikrovidas yard m yla, ilk net görülen görüntü ile son net görülen görüntü aras mesafe ölçülerek kesit kal nl hesaplanabilmektedir (72). Doku kesitleri mikroskopta incelenirken ilk olarak net olarak görülen görüntü ile en son net olarak görülen görüntü ve bunlar n kar l ndaki de erler kaydedildi. -ki görüntü aras mesafe kesit kal nl (t) olarak belirlendi. Tüm kesitlerin kesit kal nl klar ölçüldü, takiben her hayvan için ortalama kesit kal nl (tort) hesapland .

KALINLIK ÖRNEKLEME ORANI (KaÖO)

Kesit kal nl belirlenmesinin ard ndan 5 µm üstten, 5 µm alttan olmak

üzere 10 µm'lik bir güvenlik aral b rak ld . Kesit kal nl ndan güvenlik aral

ç kar larak, her kesit için disektör yüksekli i (h) belirlendi. Ard ndan her hayvan için ortalama disektör (hort) yüksekli i hesapland . Bu de er kullan larak her s çan

için kal nl k örnekleme oran bulundu. Kal nl k örnekleme oran , ortalama disektör yüksekli inin, ortalama kesit kal nl na (tort) oran d r.(KaÖO= hort / tort).

NÖRON SAYIMI

Hipokampus alanlar incelenmek üzere kesitler mikroskop üzerinde X4 büyütmede belirlendi ve sonra lam üzerine bir damla immersiyon ya döküldü ve görüntü X100 büyütmeye getirildi, CA1, CA2, CA3 stratum piramidale tabakas belirlendi. Daha önce tan mlanan ad mlamalara uyularak, "x" ve "y" ekseninde, belirlenen kesit kal nl içerisinde optik disektör say m kurallar na göre say m i lemi

(33)

yap ld . Hipokampus CA1, CA2, CA3 stratum piramidale tabakas nda bulunan, güvenlik ku a d nda kalan, sadece tarafs z say m çerçevesi ve serbest kenarlar içine giren hücrelerin nükleuslar say ld . Her hücrenin tek nükleusu oldu u için nükleus say s ayn zamanda hücre say s olarak kabul edildi (73). Her kesit için say lan nöron say s (Q-) kaydedilerek, bunlar n toplanmas yla her s çan için say lan toplam (hücre say s ) nöron say s ( Q-; toplam disektör partikül say s ) bulundu.

TOPLAM NÖRON SAYISI

Hesaplanan parametreler a a daki formüle uygun olarak yerle tirildi. Her s çan için hipokampus CA1, CA2, CA3 stratum piramidale bölgesindeki toplam nöron say lar hesapland (73).

N(toplam) = ( Q-) x (1/ KeÖO) x (1/ AÖO) x (1/ KaÖO)

Örnekleme plan n n yeterlili i ve çal man n güvenilir olmas , hata katsay lar n n %10’un alt nda olmas yla ili kilidir. Hata katsay s hesaplan rken, her s çan için say lan kesit say s ve her kesit için say lan disektör partikül say lar (Q-) kullan lmaktad r (73). Tablo-1’de 1.grup 4 nolu s çana ait disektör partikül say lar ve hata katsay s n n hesaplanmas nda kullan lan formül gösterilmi tir.

Tablo 1: Birinci grup-4 nolu s çana ait kesitlerdeki disektör partikül say lar ve

hata katsay s bulunmas nda kullan lan parametreler.

Kesit No Q- Q- x Q- Q-x (Q-+1) Q-x (Q-+2) 1 50 2500 1600 1900 2 32 1024 1216 1312 3 38 1444 1558 1330 4 41 1681 1435 1148 5 35 1225 980 1225 6 28 784 980 924 7 35 1225 1155 1435 8 33 1089 1353 9 41 1681 Toplam ] Q-=333 A=12653 B=10277 C=9274

Q-: Kesite ait disektör partikül say s , Q-: Toplam disektör partikül say s , Q -+1: Bir sonraki kesite ait disektör partikül say s , Q-+2: -ki sonraki kesite ait disektör partikül say s , HK: hata katsay s

(34)

HK = [(3A+C-4B)/12] / Q-(65)

Buna göre 1.grup-4 nolu s çana ait hata kat say s 0,019 bulundu.

STAT ST KSEL YÖNTEMLER

-statistik analiz “SPSS for Windows” istatistik program n n 10.0 versiyonu kullan larak yap ld . Gruplar n ortalama toplam nöron say lar aras ndaki farkl l k

‘Kruskal-Wallis’ testi ile de erlendirilirken, gruplar n kendi aralar ndaki

(35)

4. BULGULAR

SIÇANLARIN HÜCRE SAYIM SONUÇLARI VE KULLANILAN PARAMETRELER

Hipoksi iskemi olu turulmayan ve sadece cerrahi i lem uygulanan birinci grubun, toplam nöron say s , en yüksek 302604, en dü ük 242100 olarak say lm t r. Nöron say lar Nekil-6’da kar la t rmal olarak gösterilmi tir.

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000

1.s çan 2.s çan 3.s çan 4.s çan 5.s çan 6.s çan

ekil-6: Birinci gruptaki s çanlar n nöron say lar

Alt adet hayvandan olu an, 1.gruptaki s çanlar n, postnatal 13. günde bak lan vücut a rl klar , sol hipokampal CA1, CA2, CA3 alanlar ndaki toplam nöron say lar ve toplam nöron say s hesaplanmas için gereken parametreler Tablo-2’de gösterilmi tir.

(36)

Tablo-2: Birinci grup s çanlar n vücut a rl klar , sol hipokampal CA1, CA2,

CA3 stratum piramidale alanlar ndaki toplam nöron say lar ve kullan lan

parametreler SIÇANLAR PARAMATRELER ______________________________________________________________________________________ 1 2 3 4 5 6 Vücut a rl 9,7 11,2 10,6 12,2 12,5 10,8 Qc 275 269 300 333 334 278 1/KaÖO 1,54 1,50 1,49 1,48 1,51 1,49 tort 28,26 29,0 30,3 30,6 29,5 30,4 hort 18,26 19,0 20,3 20,6 19,5 20,4 HK 0,014 0,014 0,019 0,019 0,015 0,023 1/AÖO 300 300 300 300 300 300 n 254100 242100 268200 295704 302604 248532

Vücut a rl : Gram, Disektör say s : Qc, Ortalama kesit kal nl : tort (dm), 1/Kal nl k örnekleme

oran : 1/KaÖO, Disektör yüksekli i: hort (dm), Hata katsay s : HK, 1/Alan örnekleme oran : 1/AÖO,

n: Toplam nöron say s

Hipoksi-iskemi modeli olu turulup, serum fizyolojik verilen 2.grubun toplam nöron say s en yüksek 118800 , en dü ük 86070 olarak say lm t r. Nöron say lar Nekil-7’da kar la t rmal olarak gösterilmi tir.

(37)

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000

1.s çan 2.s çan 3.s çan 4.s çan 5.s çan 6.s çan

ekil-7: -kinci gruptaki s çanlar n nöron say lar

Alt adet hayvandan olu an, 2.gruptaki s çanlar n, postnatal 13. günde bak lan vücut a rl klar , sol hipokampal CA1, CA2, CA3 alanlar ndaki toplam nöron say lar ve toplam nöron say s hesaplanmas için gereken parametreler Tablo-3’de gösterilmi tir.

(38)

Tablo-3: -kinci grup s çanlar n vücut a rl klar , sol hipokampal CA1,

CA2, CA3 stratum piramidale alanlar ndaki toplam nöron say lar ve kullan lan parametreler SIÇANLAR PARAMATRELER _____________________________________________________________________________________ 1 2 3 4 5 6 Vücut a rl 10,8 11,8 10,7 9,1 9,2 12,7 Qc 127 121 132 130 99 95 1/KaÖO 1,49 1,49 1,51 1,50 1,50 1,51 tort 30,4 30,2 29,4 29,9 30,0 29,6 hort 20,4 20,2 19,4 19,9 20,0 19,6 HK 0,022 0,017 0,015 0,013 0,014 0,013 1/AÖO 300 300 300 300 300 300 n 113538 108174 118800 117000 89100 86070

Hipoksi-iskemi modeli olu turulup 20mg/kg fenitoin verilen, tedavi grubu fenitoin-1(TG-F1)’in toplam nöron say s en yüksek 259296, en dü ük 188784 olarak say lm t r. Nöron say lar Nekil-8’de kar la t rmal olarak gösterilmi tir.

(39)

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000

ekil-8: TG-F1 grubundaki s çanlar n nöron say lar

Alt adet hayvandan olu an, TG-F1 grubundaki s çanlar n, postnatal 13. günde bak lan vücut a rl klar , sol hipokampal CA1, CA2, CA3 alanlar ndaki toplam nöron say lar ve toplam nöron say s hesaplanmas için gereken parametreler Tablo- 4’de gösterilmi tir.

Tablo-4: TG-F1 grubu s çanlar n vücut a rl klar , sol hipokampal CA1,

(40)

Hipoksi-iskemi modeli olu turulup 30mg/kg fenitoin verilen, tedavi grubu fenitoin-2 (TG-F2)’in toplam nöron say s en yüksek 268176, en dü ük 213120 olarak say lm t r. Nöron say lar Nekil-9’de kar la t rmal olarak gösterilmi tir.

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000

ekil-9: TG-F2 grubundaki s çanlar n nöron say lar

Alt adet hayvandan olu an, TG-F2 grubundaki s çanlar n, postnatal 13. günde bak lan vücut a rl klar , sol hipokampal CA1, CA2, CA3 alanlar ndaki toplam nöron say lar ve toplam nöron say s hesaplanmas için gereken parametreler Tablo- 5’de gösterilmi tir.

(41)

Tablo-5: TG-F2 grubu s çanlar n vücut a rl klar , sol hipokampal CA1,

GRUPLARIN H POKAMPAL ALANLARDAK TOPLAM NÖRON SAYILARI ORTALAMALARI

Birinci grupta toplam nöron say s ortalamas 268540 ± 25322, 2.grupta toplam nöron say s ortalamas 105447 ± 14334, TG-F1 grubunda toplam nöron say s ortalamas 236869 ± 25085, TG-F2 grubunda toplam nöron say s ortalamas ise 240352 ± 23475 olarak saptanm t r. Gruplar n toplam nöron say s ortalamalar

ekil-10’da gösterilmi tir.

Bu çal ma gruplar aras ndaki toplam nöron say s ortalamalar nda istatistiksel olarak anlaml bir farkl l n oldu unu göstermi tir (p=0,002).

-kinci grubun toplam nöron say s ortalamas , 1. grubun toplam nöron say s na ortalamas na göre istatistiksel olarak anlaml ölçüde dü ük bulunmu tur (p=0,002).

TG-F1 grubundaki toplam nöron say s ortalamas , 2.gruba göre anlaml biçimde yüksek bulunmu tur (p=0,004).

(42)

TG-F2 grubundaki toplam nöron say s ortalamas , 2.gruba göre anlaml biçimde yüksek bulunmu tur (p=0,002).

Birinci grup ve her iki fenitoin grubunun toplam nöron say s ortalamalar aras nda istatistiksel olarak anlaml bir fark n olmad görülmü tür (p<0.05).

Her iki fenitoin tedavisi verilen grubun toplam nöron say lar ortalamalar aras nda istatistiksel olarak anlaml bir fark n olmad görülmü tür (p<0.05) (Tablo

6). Deney gruplar ndan birer s çana ait, farkl mikroskop büyütmelerinde

hipokampus görüntüleri Nekil-11’de gösterilmi tir.

ekil-10: Gruplar n toplam nöron say s ortalamalar

Tablo-6: ‘Mann-Whitney U’ testi kullan larak ikili kar la t r lan gruplar n

istatistiksel p de erleri

kili KarDElaDtErlan Gruplar p DeGerleri

1.grup / 2.grup 0,002

*

1.grup / TG-F1 0,065 1.grup / TG-F2 0,132 2.grup / TG-F1 0,004

*

2.grup / TG-F2 0,002

*

TG-F1/ TG-F2 0,818

*

Anlaml l k düzeyi (p<0.05) olarak kabul edildi.

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 1.grup 2.grup TG-F1 TG-F2

(43)

Grup 1 Grup 2 TG-F1 TG-F2 GD CA3 CA2 CA1 CA2 CA1 CA3 CA3 CA3 CA3 CA3 CA3 CA3 CA3 CA3

ekil-11: Deney gruplar(ndan birer s(çana ait farkl( mikroskop büyütmelerinde hipokampus görüntüleri (soldan sa4a s(ras(yla X4, X10, X40,X100). GD: Gyrus dentatus, CA1-CA2-CA3: Hipokampusa ait stratum pyramidale’nin alt tabakalar(.

(44)

5. TARTI MA

Perinatal hipoksik iskemik ensefalopatinin tedavi yakla m nda genel prensip, yeterli ventilasyonun ve serebvasküler perfüzyonun sürdürülmesidir. Hastalar n asid- baz dengesinin korunmas , yeterli s v , elektrolit ve kalori deste inin sa lanmas , tansiyon arteriyel ve kan glikoz düzeylerinin normal s n rlarda tutulmas gerekmektedir. Tedavinin di er basamaklar içinde, nöbet ve serebral ödem gibi komplikasyonlar n tedavisi bulunmaktad r (74,25). Hipoksik iskemik beyin hasar , olay n ba lang c ndan reperfüzyon sonras iyile me periyoduna kadar devam eder. Terapötik pencere dönemi ise hasardan sonra ba layan ve birkaç saat ile günler aras nda de i en bir dönemdir. Terapötik pencere dönemi içinde uygulanmas gereken nöroprotektif tedavi basama ise hala tart mal d r ve bu tedaviyle ilgili çal malar devam etmektedir (74-77). Çal mam zda, fenitoinin terapötik pencere dönemi içinde, nöroprotektif etkisi ara t r ld .

Serbest oksijen radikalleri olu umunu engelleyen ilaçlar hayvan çal malar nda incelenmi tir. Bu ilaçlar n içerisinde yer alan allopürinol ve oksipürinol ksantin oksidaz inhibe ederek ksantin üretimini engeller. Hipoksik iskemik beyin hasar olu turulmu immatür ratlara, resusitasyondan sonraki erken iyile me faz nda verilen allopürinolün ve oksipürinolün nöron koruyucu etksinin oldu u görülmü tür. Asfiktik infantlarda yap lan bir çal mada, kontrol grubu ile k yasland nda allopürinolün kanda serbest oksijen radikal konsantrasyonunu azaltt bulunmu tur (78,25). Fenitoinin serbest oksijen radikalleri üzerine direkt etkisi gösterilememi tir; ancak çal mam zda matür yenido an ratlarda fenitoinin nöron kayb n önledi i gösterildi. Bu etkinin fenitoinin serbest ya asitlerin olu umunu azaltarak serbest radikal olu umunu indirekt yoldan engellemesiyle ili kili olabilece i dü ünülmektedir. Lazaroid non-glikokortikoid bir ilaçt r ve demir ba ml lipid peroksidasyonunu önler. Bu ilac n yeti kin ve immatür hipoksik-iskemik hayvan modellerinde nöroprotektif etkisinin oldu u görülmü tür (25). Nelatör etkili bir ilaç olan desferroksaminin hipoksi-iskemi hayvan modellerinde serbest demirden hidroksil radikali olu umunu önledi i, beyin hasar n azaltt gösterilmi tir (79). Antioksidan ajanlar n (vitamin C,E) ve hipoterminin hipoksik-iskemik hayvan

(45)

Hipoterminin koruyucu etkisinin bulunmas kombine tedavilerin önünü açm t r. Nitrik oksit sentez inhibitörleri, monosialogangliosidler, büyüme faktörleri, hücre içi kalsiyum tamponlar ve apopitozis inhibitörleri için yap lm hipoksik-iskemik hayvan çal malar n n sonuçlar tart mal d r (74).

Serebral iskemi sonucu hücre ölümünde en çok ara t r lan nörotransmitter glutamatt r. Santral sinir sisteminde miktar en yüksek olan eksitatör nörotransmitter olup, iskemi s ras nda sal n m artmaktad r. Uyar lan glutamat reseptörleri hücrede nekroz veya apopitozise neden olmaktad r (80). Yenido an hayvan çal malar nda nöroprotektif etkili oldu u gösterilen magnezyum bir NMDA reseptör antagonisti olup; kalsiyumun hücre içine geçi ini ve glutamat n etkilerini bloke etmektedir. Yenido an ratlarda NMDA’n n serebral injeksiyonundan 15 dakika sonra verilen MgSO4’ n beyin hasar n azaltt bulunmu tur (74,81). Perinatal hipoksik iskemik ensefalopatide nöbet s k görülür. Yenido an döneminde fenobarbital tedavisine yan t vermeyen veya status geli en hastalara fenitoin tedavisi uygulanmaktad r.

Çal mam zda, antikonvülzan etkisinin yan nda nöroprotektif etkisinin

kan tlanmas n n, H-E’li hastalar için bir avantaj olaca n dü ünerek, fenitoin ilac n tercih ettik. Fenitoin ile nöron kültür çal malar yap lm ve sodyum kanallar n bloke ederek glutamat sal n m n azaltt bulunmu tur (82). Nöron kültür çal malar in vivo çal malar kadar de erli de ildir ve canl organizmadaki ilaç etkilerini yans tamaz. Bu çal ma in vivo bir çal mad r. Fenitoinin eksitatör nörotoksisitesi üzerinde etkili bir ilaç olmas sebebiyle planlanm bu çal mada; s çanlarda hipoksi-iskemi modelinde, nöron kayb n önledi i bulunmu tur. Bu etkinin glutamat sal n m n azaltarak gerçekle ti ini dü ünmekteyiz.

Deneysel çal malarda; H-E’de, intrasellüler kalsiyum art n n nöronal zedelenmeyi artt rd gösterilmi tir, bununla ili kili olarak kalsiyum kanal blokerlerinin etkisi çal lm t r. Hipoksi-iskemi öncesi verilen flunarizinin yenido an ve fetal hayvanlarda koruyucu etkisi bulunmu tur (81).

-yon kanal modülatörü olan bir di er ilaç grubu antiepileptiklerdir. -skemi ile epilepsinin olu umunda sinaptik kaskat ve intrasellüler bulgular birbirine benzemektedir. Bu benzerlik; antiepileptiklerin, iskemi hayvan modellerinde

(46)

gösterilmi nöroprotektif etkilerini aç klamaktad r (83-85). Etki mekanizmalar na göre kalsiyum geri al m n inhibe edenler, NMDA glutamat reseptör inhibitörleri, GABA (Gamma- amino butirik asit)’erjik sistem üzerinden etkili olanlar ve sodyum geri al m n inhibe edenler (voltaj ba ml sodyum kanal inhibitörleri) olmak üzere 4 gruba ayr l rlar. Lamotrijin, N tipi kalsiyum kanal n ve sodyum kanal n bloke ederek etki gösteren bir antiepileptiktir. Orta serebral arter oklüzyonu yap lan rat modellerinde nöroprotektif etkisi rapor edilmi tir. Global iskemi olu turulan çöl hayvanlar nda reperfüzyondan hemen sonra verilen lamotrijinin, hipokampal CA1 nöron kayb n önledi i ve kognitif defisitten korudu u bulunmu tur (86). -skemiden 30 dakika önce ve sonra lamotrijin verilerek yap lan ba ka bir çal mada, mikrodiyaliz yöntemle glutamat ölçülmü , her iki grupta da glutamat sal n m n n azald bulunmu tur (87). Bu çal malar sadece iskemi modellerinde yap lm t r ve eri kin ratlarda çal lm t r. Çal mam zda, fenitoinin etkisi, hipoksi-iskemi modelinde ve yenido an s çanlarda ara t r ld . Çal mam z n sonuçlar nöron kayb n n önlenmesi aç s ndan lamotrijine benzer bulundu ve fenitoinin bu benzer etkisinin lamotrijin gibi glutamat sal n m n azaltarak gerçekle ti ini dü ünmekteyiz.

Voltaj ba ml sodyum kanallar üzerinden etki gösteren di er antiepileptik ajanlar karbamazepin, valproik asit, topiramat, zonisamid ve fenitoindir. Topiramat n fenitoinle kar la t r ld global iskemi hayvan modelinde, hipokampal iskemik nöronal hasar aç s ndan, topiramatla ortaya ç kan bulgular n, fenitoinle ortaya ç kan bulgulara benzedi i görülmü tür. Bu sonuç; topiramat n farkl etki mekanizmalar na

ra men, nöroprotektif etkisinin, sodyum kanallar üzerinden gerçekle ti ini

dü ündürmektedir (88). Sodyum kanallar üzerinden etkisi bilinen fenitoin, bu çal mada farkl olarak, global iskemi yerine hipoksi-iskemi modelinde ve yenido an s çanlarda çal ld . Hipoksi-iskemi sonras nda etkisi incelenen fenitoinin, hipokampal nöron koruyucu etkisi, bahsedilen çal ma sonuçlar na benzer bulundu.

Hipoksiye ba l nöronal hasarda voltaj ba ml sodyum kanallar önemli rol oynamaktad r. Altta yatan mekanizma henüz tam olarak aç klanamamakla beraber voltaj ba ml sodyum kanallar bloke edildi inde, hücre içi/d iyon dengesinin ve intrasellüler enerji düzeylerinin korundu u dü ünülmektedir. -n vitro çal malarda tetrodoksinin, fenitoinin ve lidokainin doz ba ml nöroprotektif etkilerinin oldu u

(47)

gösterilmi tir (89). Ba ka bir rat hücre kültürü çal mas nda tetrodoksinin, lidokainin ve fenitoinin nöron hasar n önledikleri, ayn zamanda glutamat sal n m n da azaltt klar bulunmu tur (90). Penumbra iskemik bölge etraf ndaki aland r ve bu alanda iskemik hasara u ram hücreler bulunur. Preklinik çal malarla, fenitoinin, penumbral bölgede, yayg n elektriksel depolarizasyonu (voltaj ba ml sodyum kanallar üzerinden) inhibe ederek, iskemi sonras glutamat sal n m n azaltt n gösterilmi tir (91).

Kinouchi ve arkada lar n n yapt bir çal mada wistar ratlara global iskemi modeli uygulanm ve fenitoinin etkisi ara t r lm t r. Bir gruba iskemiden 30 dakika önce 10mg/kg fenitoin intravenöz verilmi ve tedavi verilmeyen gruplarla, serbest ya asiti, laktat, nükleozid trifosfat düzeyleri aç s ndan kar la t r lm t r. Fenitoin ile tedavi edilen grupta, kontrol gruplara göre nükleozid trifosfat düzeyi daha yüksek, laktat ve serbest ya asit düzeyi daha dü ük bulunmu tur (92). Bu çal ma eri kin ratlarda yap lm t r, sadece iskemi modeli çal lm t r ve laboratuvar testleriyle sonuca var lm t r. Çal mam zda ise yenido an s çanlar kullan ld . Hipoksi-iskemi modelinde ve iskemi sonras nda ilaç etkisini ara t r ld . Laboratuvar de erlerinden ba ms z olarak, daha kantitatif de erlendirme yöntemiyle hipokampal nöron say lar n hesapland . Sonuçta iskemi sonras nda koruyucu etkisini gösterdi imiz çal ma sonuçlar m z n yukar daki çal mayla benzer ancak bahsedilen farkl l klarla da daha güvenilir oldu unu dü ünmekteyiz.

Imaizumi ve arkada lar global iskemi olu turulan rat modelinde fenitoinin Na(+)-K(+)-ATPaz aktivitesi üzerine olan etkisini ara t rm lard r. Çal mada; iskemi sonras fenitoin verilen grupta, Na(+)-K(+)-ATPaz aktivitesinin artt gösterilmi tir (93). Çal mam zda Na(+)-K(+)-ATPaz aktivitesi de erlendirilmedi. Ancak fenitoin için gösterdi imiz nöroprotektif etkinin, fenitoinin di er etki mekanizmalar na ek olarak, enerji kullan m n azaltmas ile ili kili olabilece i kan s nday z.

Fosfenitoin; fenitoinin disodyum fosfat ester formudur, antikonvülzan özellikleri fenitoine benzemektedir. Chan ve arkada lar ; yeti kin ve erkek ratlarda global iskemi modeli olu turmu lar ve iskemiden 5 dakika sonra 30mg/kg i.m.