Echinops orientalis Trautv. BİTKİSİNDEKİ SEKONDER METABOLİTLERİN İZOLASYONU,
YAPI TAYİNİ, ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN İNCELENMESİ
Sakine YILMAZ Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı
Doç. Dr. Ramazan ERENLER
2012 Her hakkı saklıdır
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Echinops orientalis Trautv. BİTKİSİNDEKİ SEKONDER
METABOLİTLERİN İZOLASYONU, YAPI TAYİNİ, ANTİOKSİDAN
AKTİVİTELERİNİN İNCELENMESİ
Sakine YILMAZ
TOKAT
2012
kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan beyan ederim.
i
Echinops orientalis Trautv. BİTKİSİNDEKİ SEKONDER METABOLİTLERİN İZOLASYONU, YAPI TAYİNİ, ANTİOKSİDAN AKTİVİTELERİNİN
İNCELENMESİ
Sakine YILMAZ
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Kimya Anabilim Dalı
Danışman: Doç. Dr. Ramazan ERENLER
Bu çalışmada, Echinops Orientalis Trautv. bitkisindeki sekonder metabolitler izole edildi, yapıları aydınlatıldı ve elde edilen sekonder metabolitlerin antioksidan aktiviteleri incelendi. Bitki, Gaziosmanpaşa Üniversitesi kampüsünden 2010 yılında toplandı ve gölgede kurutuldu. Kurutulan bitkinin yaprakları ve tohumları ayrı ayrı metanol-kloroform (2:1) çözücü sistemi ile ekstrakte edildi. Elde edilen ekstraktlar kolon kromatografisi ile apolar çözücü sistemden polar çözücü sistemine doğru fraksiyonlara ayrıldı. Sekonder metabolitleri ayırma işlemi kolon kromatografisi ile yapıldı. Echinops Orientalis Trautv. bitkisinin yaprak kısmından iki ve tohum kısmından iki olmak üzere dört bileşik izole edildi. İzole edilen bileşiklerin yapıları; tek boyutlu NMR (1H-NMR, 13C-NMR, APT, DEPT-90, DEPT-135), iki boyutlu NMR (HETCOR, HMBC) ve LC/MS-TOF analiz teknikleri ile aydınlatıldı. Ayrıca saflaştırılan bileşiklere ve bitki ekstraktlarına antioksidant aktivite testleri uygulandı. İzole edilen tüm bileşiklerin antioksidan aktiviteleri Folin-Ciocalteu ayıracı ile toplam fenolik madde içeriği, DPPH serbest radikali giderme aktivitesi, ABTS katyon radikali giderme aktivitesi ve indirgeme kapasitesini içeren çeşitli metotlarla test edildi. Elde edilen sonuçlar, BHT, BHA ve trolox standart maddeleriyle mukayese edildi. İzole edilen flavonların katyon radikali giderme aktiviteleri oldukça yüksek gözlendi.
2012, 66 sayfa
Anahtar kelimeler: Echinops Orientalis Trautv., Sekonder metabolit, NMR, Antioksidan aktivite
ii
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF THE SECONDARY METABOLITES FROM THE Echinops orientalis Trautv. PLANT, INVESTIGATION OF
ANTIOXIDANT ACTIVITIES
Sakine YILMAZ Gaziosmanpasa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Ramazan ERENLER
In this study, the secondary metabolites from the Echinops orientalis Trautv. plant were isolated and identified and antioxidant properties of the obtained secondary metabolites were investigated. The plant had been collected from Gaziosmanpaşa University campus in 2010 and was dried in shadow. The dried leaves and seeds were extracted separately with methanol-chlorofom (2:1). Crude extracts of leaves and seeds parts were separated into its fractions by using column chromatography from nonpolar solvent to polar solvent systems. The separation processes of secondary metabolites were carried out by using the column chromatography. Four secondary metabolite compounds from the leaves and seeds of Echinops Orientalis Trautv. plant were isolated. Two compounds were isolated from the leaves and two compouns from the seeds. Structure of isolated compounds were determinated by one dimensional NMR (1H-NMR, 13 C-NMR, APT, DEPT-90, DEPT-135), two dimensional NMR (HETCOR, HMBC) and LC/MS-TOF analysis techniques. Also isolated compounds and plant extracts were applied to antioxidant activity tests. The antioxidant activities of all isolated compounds were tested with the various methods including total phenolic compound contents by Folin-Ciocalteu reagent (FCR), DPPH free radical scavenging activity, ABTS cation radical scavenging activity, and reducing power. The obtained results were compared by using BHT, BHA and trolox as standards. The isolated flavones exhibit the hight cation radical scavenging activities.
2012, 66 pages
Keywords: Echinops Orientalis Trautv., Secondary metabolite, NMR, Antioxidant activity
iii
tecrübesinden yararlanmamı sağlayan, sorularımı sabır ve güler yüzle cevaplayan, ufkumu genişleten, her türlü maddi ve manevi desteğini esirgemeyen danışman hocam Sayın Doç. Dr. Ramazan ERENLER’e,
İzole edilen moleküllerin yapılarının aydınlatılmasında ve LC/MS-TOF analizlerinin yapılmasındaki katkılarından dolayı Çankırı Karatekin Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü Başkanı Prof.Dr. İbrahim Demirtaş’a
Laboratuar çalışmalarımızda yardımcı olan başta Doç. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ olmak üzere Uzman Özkan ŞEN’e, Uzman Hüseyin AKŞİT’e ve Kimya Bölümü hocalarıma,
Antioksidan aktivitelerinin ölçülmesinde emeği geçen Uzman Nusret GENÇ’e ve bitkinin adlandırılmasında yardımcı olan Sivas Cumhuriyet Üniversitesi Biyoloji Bölümü Öğretim Üyesi Yrd. Doç. Dr. Aşkın AKPULAT’a Yüksek lisans çalışmalarım süresince her zaman yanımda olan ve desteğini esirgemeyen arkadaşım Ayşe DEMİR’e teşekkürü borç bilirim.
Sadece yüksek lisans tezim süresince değil hayatımın her anında bana verdikleri destek ve güvenle kendimi iyi hissetmemi sağlayan, hep daha iyisini yapabileceğime inandıran aileme ve nişanlım Ali KARAİPEKLİ’ye sonsuz teşekkür ederim.
Sakine YILMAZ Haziran 2012
iv
ABSTRACT ... ii
ÖNSÖZ ... iii
İÇİNDEKİLER ... iv
SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ ... ..vi
ŞEKİLLER DİZİNİ ... .vii
ÇİZELGELER DİZİNİ ... . ix
1. GİRİŞ ... 1
2. KAYNAK ÖZETLERİ ... 3
2.1. Bitkilerin Tedavi Amaçlı Kullanılması ... 3
2.2. Bitkilerde Bulunan Primer ve Sekonder Metabolitler ... 4
2.2.1. Flavonoidler ... 5
2.2.2. Terpenler ... 7
2.2.3. Steroidler ... 8
2.2.4. Fenoller ... 10
2.2.5. Bitkilerdeki Fenolikler ... 10
2.3. Bitkinin Familyası ve Tanıtımı ... 11
2.3.1. Asteraceae (Papatyagiller) ... 11
2.3.2. Echinops orientalis Trautv. Cinsinin Genel Özellikleri ... 12
2.4. Echinops Türleri Alanında Yapılan Çalışmalar ... 14
2.5. Serbest Radikaller ve Genel Özellikleri ... 16
2.6. Antioksidanlar ... 18
3. MATERYAL VE METOT ... 20
3.1. Bitkisel Materyal ... 20
3.1.1. Bitkinin Toplanması ve Tür Teşhisi ... 20
3.1.2. Bitkinin Kurutulması ve Depolanması ... 20
3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ... 20
3.3. Kullanılan Cihazlar ... 20
v
3.4.3. Kolon Kromatografisi ... 21
3.4.4. İnce Tabaka Kromatografisi (İTK) ... 23
3.5. İzole Edilen Bileşenlerin Yapılarının Tayinleri İçin Uygulanan Analizler ... 24
3.5.1. ¹H-NMR ve ¹³C-NMR Analizleri ... 24
3.6. Antioksidan Aktivite Testleri ... 24
3.6.1. Serbest Radikal (DPPH·) Giderme Aktivitesi ... 25
3.6.2. İndirgeme Gücü Aktivitesi ... 26
3.6.3. ABTS Katyon Radikali Giderme Aktivitesi ... 27
3.6.4. Total Fenolik Bileşik Miktarı Tayini ... 27
4. BULGULAR VE TARTIŞMA ... 29
4.1. İzole Edilen Bileşiklerin Yapı Analizi ... 29
4.1.1. Metil-1H-indol-1-karboksilatın (34-38.fr) Yapı Tayini ... 29
4.1.2. Steroid Bileşiğinin (42.fr) Yapı Tayini ... 33
4.1.3. Flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit]) (128-136.fr) Yapı Tayini ... 38
4.1.4. Flavon (Apigenin-7-O-glikozit) (156-158.fr) Yapı Tayini ... 48
4.2. Antioksidan Aktivite Çalışmaları ... ..54
4.2.1. İndirgenme Gücü Aktivitesi ... ..55
4.2.2. Serbest Radikal (DPPH) Giderme ... 56
4.2.3. ABTSKatyon RadikaliGiderme Aktivitesi Tayini Bulguları ... 57
4.2.4. Toplam Fenolik Bileşik Miktarı Tayini Bulguları ... 59
5. TARTIŞMA ve SONUÇ ... 62
KAYNAKLAR ... 63
vi d Dublet
dd Dubletin dubleti
ddd Dubletin dubletin dubleti
J Etkileşme Sabiti
s Singlet
brs Geniş singlet
t Triplet
Kısaltmalar Açıklama
ABTS 2,2-azino-bis-3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid APT Attached Proton Test
BHA Bütillenmiş Hidroksi Anisol BHT Bütillenmiş Hidroksi Toluen
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer COSY Correlated Spectroscopy
DPPH 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil İTK İnce Tabaka Kromatografi NMR Nükleer Manyetik Rezonans TCA Trikloroasetik asit
UV-VIS Ultraviyole-Görünür Bölge HETCOR Heteronuclear Corralation
LC/MS -TOF Liquid Chromatography Mass Spectrometry Time-of-Flight TCA Trikloroasetik asit
FCR Folin-Ciocalteu reaktifi GAE Gallik Asite Eşdeğer
vii
Şekil 2.2. Bazı flavonoid bileşiklerin iskelet yapıları ... .6
Şekil 2.3. İzopren birimleri ... .7
Şekil 2.4. Steroid iskeleti ... .8
Şekil 2.5. β-Sterol (17) ve Ergosterol (18)... .9
Şekil 2.6. Sterol iskeleti ... 10
Şekil 2.7. Fenolik bileşiklerin sınıflandırılması ... 11
Şekil 2.8. Papatyagiller familyasından 12 alt tür ... 12
Şekil 2.9. Echinops orientalis Trautv. bitkisi ... 13
Şekil 2.10. Echinops ritro L. bitki türünden izole edilen seskitrepen bileşiklerin yapısı ... 14
Şekil 2.11. Echinopines A ve B bileşiklerinin yapısı ... 15
Şekil 2.12. Echinops latifolius bitkisinden izole edilen tiyofenlerin yapıları ... 15
Şekil 2.13. Antioksidanların sınıflandırılması ... 19
Şekil 3.1. Kolon kromatografisinden elde edilen fraksiyonların İTK görünümü ... 24
Şekil 3.2. Fenol (a), DPPH radikal formu (b), Fenoksi radikali (c), DPPH nötr formu (d) ... 25
Şekil 3.3. İndirgeme gücü aktivitesi deneyinde gerçekleşen ilk reaksiyon ... 26
Şekil 3.4. İndirgeme gücü aktivitesi deneyinde gerçekleşen ikinci reaksiyon ... 26
Şekil 4.1. Echinops orientalis Trautv.’dan izole edilen metil-1H-indol-1-karboksilat molekülü ... 29 Şekil 4.2. Metil-1H-indol-1-karboksilat’ın 400 MHz 1 H-NMR spektrumu ... 30 Şekil 4.3. Metil-1H-indol-1-karboksilat’ın 13 C, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları ... 31
Şekil 4.4. Metil-1H-indol-1-karboksilat’ın HETCOR NMR spektrumu ... 32
Şekil 4.5. Metil-1H-indol-1-karboksilat’ın LC/MS-TOF spektrumu ... 33
Şekil 4.6. Echinops orientalis Trautv.’dan izole edilen steroid bileşiği ... 34
Şekil 4.7. Steroid bileşiğinin 400 MHz 1 H-NMR spektrumu ... 34
Şekil 4.8. Steroid bileşiğinin APT, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları... 35
Şekil 4.9. Steroid bileşiğinin HETCOR NMR spektrumu ... 37
viii
Şekil 4.13. Flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit])’un 13
C-NMR spektrumu ... 41 Şekil 4.14. Flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit])’un DEPT-90, APT ve DEPT-135 spektrumları ... 42 Şekil 4.15. Flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit])’un HETCOR NMR Spektrumu ... 45 Şekil 4.16. Flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit])’un HMBC NMR spektrumu ... 46 Şekil 4.17. Flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit])’un Coesy 90
NMR spektrumu ... 47 Şekil 4.18. Flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit])’un LC/MS-TOF spektrumu ... 47 Şekil 4.19. Echinops orientalis Trautv.’den izole edilen flavon(Apigenin-7-O-glikozit) molekülü ... 48 Şekil 4.20. Flavon (Apigenin-7-O-glikozit)’un 400 MHz 1
H-NMR spektrumu ... 49 Şekil 4.21. Flavon (Apigenin-7-O-glikozit)’un 400 MHz 13
C-NMR spektrumu ... 50 Şekil 4.22. Flavon (Apigenin-7-O-glikozit)’un DEPT-90, APT ve DEPT-135
spektrumları ... 51 Şekil 4.23. Flavon (Apigenin-7-O-glikozit)’un HETCOR NMR spektrumu ... 54 Şekil 4.24. Flavon (Apigenin-7-O-glikozit)’un LC/MS-TOF spektrumu ... 54 Şekil 4.25. Echinops orientalis Trautv. bitkisinin tohum, yaprak ve gövde
kısımlarının ham ekstreleri ve kolon kromatografisi ile elde edilen
fraksiyonların Fe+3’ü Fe+2’ye indirgeme kapasitesi ... ..55 Şekil 4.26. Echinops orientalis Trautv. bitki ekstraktlarının ve kolon kromatografisi ile elde edilen fraksiyonların DPPH radikali giderme aktivite % si ... 57 Şekil 4.27. Echinops orientalis Trautv. bitki ekstrelerinin ve kolon kromatografisi ile elde edilen fraksiyonların serbest katyon radikali giderme aktivitelerinin birer standart antioksidan olan BHA, BHT ve trolox ile karşılaştırması ... 59 Şekil 4.28. Standart bir fenolik bileşik olan ve aynı zamanda kuvvetli antioksidan olan gallik asitin açık yapısı ... 59 Şekil 4.29. Toplam fenolik bileşik miktarı tayini için hazırlanan standart grafik ... 60 Şekil 4.30. Echinops orientalis Trautv. bitkisinin tohum, yaprak ve gövde
kısımlarından elde edilen metanol ekstrelerinin kg başına bulunan
ix
Çizelge 2.1. Terpenlerin sınıflandırılması ... 8 Çizelge 2.2. En sık karşılaşılan serbest radikaller ve serbest radikal üreten türlerin bazı özellikleri ... 17 Çizelge 3.1. Bitkinin yaprak kısmının metanol-kloroform (2:1) ekstresine yapılan kolon kromatografisi işlemleri ... 22 Çizelge 3.2. Bitkinin tohum kısmının metanol-kloroform (2:1) ekstresine yapılan kolon kromatografisi işlemleri ... 23 Çizelge 4.1. Metil-1H-indol-1-karboksilat’ın 1H-NMR ve 13C-NMR verileri
(400 MHz, DMSO-d6) ... 31
Çizelge 4.2. Steroid bileşiğinin 1H-NMR ve 13C-NMR verileri (400 MHz,
DMSO-d6) ... 36
Çizelge 4.3.Flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit])’un 1H-NMR ve 13C NMR verileri (400 MHz, DMSO-d6) ... 43
Çizelge 4.4. Flavon (Apigenin-7-O-glikozit)’un 1H-NMR ve 13C-NMR verileri (400 MHz, DMSO-d6) ... 52
1. GİRİŞ
Bitkilerin ilaç, yiyecek ve kozmetik amaçlı kullanımı insanın varlığıyla başlamış günümüze kadar süregelmiştir. Hastalıkların varlığı ve bunların tedavi edilmesi amacıyla bu geçen zaman içerisinde bitkilerin kullanımı, her bir bitkiye ait özellikler keşfedilerek geliştirilmiştir.
Dünya üzerinde 750.000 ile 1.000.000 arasında bitki türü olduğu tahmin edilmekte ve bunların 500 bin kadarı tanımlanmış olup her yıl 2000 kadar yeni bitkinin tanımlanması yapılmaktadır. Günümüzde 20000 den fazla bitki alternatif tedavi amaçlı kullanılmaktadır. Bu nedenle hastalıklara karşı ilaç veya etken madde keşfi için tıbbi bitkilere ve bu bitkilerden çeşitli maddelerin izole edilerek insanlığın hizmetine sunma çalışmaları da son derece önem kazanmıştır (Çalışkan, 2006).
Modern bilimlerin gelişmesiyle birlikte biyoloji, farmakoloji, kimya, toksikoloji gibi birimlerin disiplinler arası çalışmalarıyla, şifalı bitki olarak kullanılan birçok bitkinin, yapısında bulunan doğal bileşiklerin, kimyasal yapıları aydınlatılmakta ve izole edilen bileşiklerin biyolojik aktiviteleri saptanabilmektedir (Dülger ve ark., 1999; Tadeg ve ark., 2005). Bitkiler üzerinde yapılan araştırmalarda bitkilerin, ekosistemle olan ilişkisinde, savunma, korunma, ortama uyum, hayatta kalma ve nesillerini devam ettirme gibi önemli olaylarda çeşitli avantajlar sağlayan, sekonder metabolit olarak tanımlanan oldukça karmaşık mekanizmaların ürünleri olan kimyasal maddeler içerdikleri saptanmıştır (Bourgaud ve ark., 2001).
Bugüne kadar yaklaşık 100.000 sekonder metabolit bitkilerden izole edilerek tanımlanmıştır ve her yıl bu sayıya 4.000 kadar yeni bileşik eklenmektedir (Verpoorte, 1999). Bunlar arasında bitkiyi, patojenlere karşı koruyan antibakteriyel, antifungal, antiviral maddeler (fitoaleksinler), çimlenmeyi önleyici maddeler, doğal yaşamda rekabet gücünü (allelopati) artıran ve toksik maddeler; UV ışınlar, tuzluluk, kuraklık gibi zararlı çevresel etmenlerin neden olduğu stres koşullarında direnç arttırıcı metabolitler; zararlı hayvanlar ve otlara karşı korunmayı sağlayan insektisit, herbisitler; tozlaşma ve tohum dağılımını sağlamak üzere hayvanları cezbedecek renkli ve güzel
kokulu metabolitler bulunmaktadır (Charwood, 1990). Bitkilerin yapılarında bulunan sekonder metabolitlerin çoğu bir bitki cinsine ve hatta bazen tek bir bitki türüne özgüdür, diğer bitkiler tarafından üretilmezler (Ramachandra, 2002; Gül, 2011).
Çok büyük yapısal çeşitliliğe sahip olan sekonder metabolitler, bitkide sekonder metabolizma yollarının ara ürünlerinden, özel yollarla üretilmektedirler. Sekonder metabolitler üzerinde yapılan araştırmalarda bu bileşiklerin bitkiler tarafından çok az miktarlarda üretildiğide belirlenmiştir. Buna karşılık doğal gıda ve ilaç ham maddeleri (farmasötikler, gıda katkı maddeleri, tatlandırıcılar, boyalar, koku vericiler, yapıştırıcılar, insektisitler, pestisitler vb.) bulmak üzere bu metabolitler üzerinde yapılan araştırmalar gün geçtikçe artmakta ve bunun sonucunda da ekonomik olarak önem kazanmaktadırlar (Başer, 1990; Baytop, 1999;Ahıskalıoğlu, 2007).
Yapılan bu çalışmanın amacı; Echinops orientalis Trautv. bitkisindeki sekonder metabolitlerin izole edilip, yapıları aydınlatıldıktan sonra aktioksidan aktivite özelliklerini ortaya çıkarmaktır.
2. KAYNAK ÖZETLERİ
2.1. Bitkilerin Tedavi Amaçlı Kullanılması
Geleneksel ve tıbbi amaçlı bitkilerin kullanımı olarak adlandırılan etnobotanik hakkındaki yazılı bildiler M.Ö. 3000’li yıllara kadar eski Mısır, Hitit, Grek ve Roma dönemlerinde papirus ve diğer kaynaklardan tespit edilmiştir (Yen ve Chen, 1995). Anadolu’da insanlar yontma taş devrinden beri bitkilerden tedavi amaçla yararlanmış olup Anadolu’da yaklaşık 200 yıl süren Selçuklu döneminde kullanılan bitkisel droglar ve ilaçlar hakkında özgün araştırmalar bulunmaktadır. Bu alandaki en önemli kaynaklar Dineveri, Ebu Reyhan Buruni, ve İbn Baytar’ın eserleridir. Ayrıca 9. yüzyılda Yakup bin İshak El Kindi tarafından yazılan uçucu yağ taşıyan droglar önemli eserlerdendir. Osmanlılar döneminde tibbi bitkileri konu alan dersler Sultan 2. Mahmut zamanında 1839 yılında Mekteb-i Tibbiye-i Şahane döneminde tıp ve eczacılıkta okutulmaktaydı.
Bitkisel, hayvansal veya madensel olan ve eczacılık, kimya ve boya endüstrisinde kullanılan etkin maddeler daha çok drog olarak adlandırılırlar. Bitkisel kökenli droglar çok eski devirlerden beri hastalıklara karşı kullanılırken bitkilerde bulunan etkin bileşikler ve etki mekanizmaları hakkındaki bilgiler XIX. yüzyılın ortasından sonra araştırılmaya başlandı. Bitkilerdeki hastalıkları tedavi edici özellik taşıyan etken maddeler bitkilerin, çiçek, yaprak, tohum, meyve, kök, gövde, kabuk gibi bölümlerinde bulunabilir. Bazı bitkilerin belirli kısımları kullanılırken bazılarının tümünden yararlanılır. Örneğin ıhlamur ve papatyanın sadece çiçekleri kullanılırken nane ve kekiğin tümü kullanılmaktadır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) yaklaşık 4 milyar insanın bitkisel tıbbı kullandığını bildirmektedir. Bitkisel ilaçlar daha çok bitki çayı, ham tabletler ve konsantreler olarak kullanılmaktadır. Bitkisel ilaçların kullanımı daha çok uzak doğuda, Hindistan, Çin ve Japonya da yaygın olmakla birlikte Avrupa da bitkisel ilaçları araştırma ve destekleme dernekleri “European Societies Cooperation of Phtotherapy (ESCOP) birliği mevcuttur. Dünyada son yıllarda bitkisel amaçlı yapılan çalışmaların yayımlandığı bilimsel dergilerin sayısı da hızla artmaktadır (Baytop, 1999; Baytop, 2001; Ahıskalıoğlu, 2007).
2.2. Bitkilerde Bulunan Primer ve Sekonder Metabolitler
Sekonder ve pirimer metabolitler bitkilerde bulunan doğal bileşiklerdir. Primer metabolitler; lipitler (trigliserit, fosfolipit), karbonhidratlar (nişasta, selüloz vb.), proteinler, mineraller (tuzlar, anyonlar, katyonlar vb.) ve hormonlar gibi yapısal büyüme, gelişme ve çoğalmalar için gerekli olan metabolitlerdir.
Sekonder metabolitler ise bitkilerin çevreyle adaptasyonunu sağlamak, koruma, taşınma üreme gibi faaliyetlerden sorumlu olan organik moleküllerdir. Bitkilerde bulunan sekonder metabolitler fitosteroller, terpenler, terpenoidler, alkaloidler, fenolikler ve flavonoidlerdir. Günümüzde birçok sektörde hammadde olarak kullanılan sekonder metabolitler bitkinin temel yaşamsal işlevleriyle doğrudan ilişkisi olmamasına karşılık en az primer metabolitler kadar önemlidir.
Önceleri herhangi bir işlevi olmayan atık maddeler olarak kabul edilen sekonder metabolitlerin, bitki bünyesinde önemli roller taşıdığının belirlenmesinden sonra, söz konusu bileşiklere verilen önem gün geçtikçe artmıştır. Bu maddelerin bitkideki önemli görevleri şunlardır;
1. Kuraklık, tuzluluk, UV ışınları vs. gibi değişik çevre faktörlerinin oluşturduğu stres ortamına karşı koyma.
2. Herbivorlara (böcek, sürüngen vb.) karşı savunma. 3. Mikroorganizmalara (bakteri, mantar vb.) karşı savunma.
4. Bazı metabolik ve daha gelişmiş ekolojik işlevler. (örn: Tohum dağılımını sağlamak için hayvanları ve diğer taşıyıcıları cezbettirme gibi)
Sekonder metabolitlerin bitki bünyesindeki işlevlerinin oldukça karmaşık olması, araştırıcıların bu bileşikler üzerinde yoğunlaşmasına neden olmuştur. Bu alanda yapılan çalışmalar, hem bu bileşiklerin elde edilme metotlarının geliştirilmesine, hem de etki mekanizmalarının belirlenmesine yönelik olarak sürdürülmektedir. Özellikle sekonder metabolitler içinde yer alan fenolik bileşikler ile tokoferollerin, insan sağlığı üzerindeki olumlu etkilerinin belirlenmesi ile bu yönde yapılan çalışmaların son yıllarda büyük bir
önem kazandığı görülmektedir (Bourgaud ve ark., 2001; Sökmen ve Gürel, 2001; Zarate ve ark., 2003).
2.2.1. Flavonoidler
Genellikle sarı renkli olmaları nedeniyle, latince sarı anlamına gelen flavus sözcüğünden türetilerek flavonoid adını alan bileşiklerdir. Flavonoid bileşikleri, flavon (2-fenilkromon)’un bitkiler aleminde yaygın olarak bulunan türevleridirler. Bunlardan OH içerenlere flavonoller, 2,çift bağı indirgenmiş olanlara flavanlar, fenil grubu 3-yerinde olanlara izoflavonlar denilmektedir. Genellikle bu bileşikler sarı renkli bitkisel pigmentlerdir.
Flavonoid kromon türevi maddelerdir. Kromon; benzo-γ-pirondur (Ayhan, 2008) (Şekil 2.1.). Doğal olarak birçok flavonoid bulunmaktadır. Bu flavonoid, fenil grubunun kromon halkasında bulunan hidroksil gruplarının sayısı ve konumu, ayrıca metil eterlerinin bulunması ile birbirinden ayrılmaktadır. Bitkilerde birçok renkli bileşiği oluşturan bu maddelerin renkleri, hidroksil grubu ve ortamın pH’sına bağlı olarak koyu sarı renk içermektedir.
(a) (b)
Şekil 2.1. Kromon (benzo-γ-piron, (a)) ve 2-fenil benzopiron (b)
Flavonoidler bitkilerin ikincil metabolitleri olup bitkilerin kök, sap, çiçek, polen, meyve ve tohum gibi her bölümünde bulunabilirler. Şekil 2.2.’de Bazı flavonoid bileşiklerin iskelet yapıları verilmiştir.
1 O O A 2 3 4 5 6 7 8 9 10 O O A B 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6'
O O O O O O OH O O OH O O O O O O O O O O O O O O O C H O 1 2 3 Flavonlar İzoflavonlar Flavonoller
Dihidroflavonoller Flavononlar Kalkonlar
Flavanlar Antosiyanidler İzofalvonlar
Biflavanoitler Neoflavonoitler Oronlar Kumaranlar 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
2.2.2. Terpenler
Şekil 2.3.’de gösterilen izopren iskelet birimleri içeren bütün bileşiklere terpenler adı verilir. Terpenlerin izoprenle ilişkisini belirtmek amacıyla izoprenoidler de denmektedir. Terpenler iki ya da daha çok izopren birimi içerebilirler. Molekülleri açık zincir ya da halkalı olabilir. Çift bağlar, hidroksil grupları, karbonil grupları ve daha başka işlevsel grup içerebilirler. C ve H den başka elementleri içeren bileşiklere de terpenoid denir. Terpenoidler, bitkiler ve hayvanlarda bulunan doğal bileşiklerin en önemli ve en geniş sınıflarından birisidir. Bitkilerde serbest halde bulunabildikleri gibi, glikozitleri, organik asit esterleri ve bir kısmı da proteinlerle birlikte bulunur.
H2C C CH3 C H CH2 veya izopren 14 15
Şekil 2.3. İzopren birimleri
Terpenler izopren birimlerinin sayısına göre sınıflandırılır. Terpenler fiziksel özelliklerine göre iki grupta incelenirler.
1) Uçucu terpenler: Su buharı destilasyonu ile sürüklenebilen küçük moleküllü monoterpenler ve seskiterpenlerdir.
2) Uçucu olmayan terpenler: Büyük moleküllü seskiterpenler, diterpenler, triterpenler ve politerpenlerdir.
Terpenler uygun kromatografik yöntemlerle saflaştırılırlar. Saflaştırmada genellikle kolon ve preperatif ince tabaka kromatografisi yöntemleri kullanılabildiği gibi pek çok kromatografik yöntemlerde kullanılabilir (Boiteu ve ark., 1964).
Çizelge 2.1. Terpenlerin sınıflandırılması
İzoprensayısı Sınıfı Karbon sayısı
1 Hemiterpenler 5 2 Monoterpenler Seskiterpenler 10 3 15 4 Diterpenler 20 5 Seskiterpenler 25 6 Triterpenler 30 8 Tetraterpenler (Karotenoidler) 40 N Politerpenler (5)n
Diterpenler, dört izopren ünitesinden oluşan 20 karbonlu moleküllerdir. Diterpenler, steroidlerden ve triterpenlerden daha kolay oksitlenir. Bu nedenle diterpenler de kimyasal reaksiyonlarda farklılıklar gözlenir (Akşit, 2008).
2.2.3. Steroidler
Steroid, birbiriyle kaynaşmış dört halkadan oluşmuş karbon iskeletli bir lipittir. Steroitler asetil KoA biosentez yolundan oluşurlar. Farklı steroidler bu halkalara bağlı olan fonksiyonel gruplar bakımından birbirlerinden ayrılırlar.
16 Şekil 2.4. Steroid iskeleti
Bitkiler, hayvanlar ve mantarlarda yüzlerce çeşit steroid tanımlanmıştır. Steroitlerin canlılarda genel olarak en önemli işlevi hormon olmalarıdır. Steroid hormonlar, steroid hormon reseptör proteinlere bağlanarak fizyolojik etkilerini gösterirler. Bu reseptörlere bağlanınca gen transkripsiyonu ve hücre fonksiyonunda değişimlere neden olurlar (Berg ve ark., 2002; Bakla, 2010).
Fitosteroller
Bitkilerde bulunan steroidler fitosterollerdir. Fitosteroller bir grup steroid alkoldür. Beyaz renklidirler, karakteristik kokuları vardır, suda çözünmezler, alkollerde çözünürler. Gıda katkı maddesi olarak, ayrıca tıp ve kozmetiklerde de kullanılırlar. Şekil 2.5.’de başlıca fitosteroller gösterilmiştir.
17 18
Şekil 2.5. β-Sterol (17) ve Ergosterol (18) Şekil 2.6.’da gösterilen karbon 242
olmazsa kampesterol elde edilir. Karbon 241 ve 242 çıkartılırsa kolesterol ortaya çıkar. Karbon 22 ve 23’ten hidrojenler alınırsa stigmasterol (stigma-5,22-dien-3β-ol) elde edilir. Karbon 242 ve Karbon 22 ve 23’ten hidrojenler alınırsa brasikasterol (ergosta-5,22-dien-3β-ol) elde edilir. Brakikasterolden karbon 7 ve 8’deki hidrojenler alınırsa ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) elde edilir. Bitkilerde çeşitli fitosteroller vardır ve hücre zarında yapısal bir rol oynarlar. Bu rol memeli hücrelerinde kolesterolünkine denktir. Toprak bitkilerinde bulunması, tek hücreli yosunlarda ise ender bulunmasından dolayı bir numunede toprak kökenli organik maddelerin varlığının bir işareti olarak kullanılırlar. Bu steroller genelde suda çözünmedikleri için süspansiyondaki ve çökeltideki katı parçacıklarının üzerine çökelirler. Taneciklerin yüzey alanı daha büyük olduğu için çamurda kuma kıyasla daha
fazla fitosterol bulunur. Bu etkinin üstesinden gelmek için organik maddenin kaynağını belirtmek adına her bir sterolün toplam sterole veya kolesterole oranı belirtilir.
19 Şekil 2.6. Sterol iskeleti
Fitosteroller gıda muhtevası veya katkı maddesi olarak bağırsaklarda kolesterol emilmesini azalttıklarından kolestrerol azaltıcı etkiye sahiptirler(Ostlund ve ark., 2003). Fitosteroller bitkisel yağlarda özellikle iğdegillerin yağında, mısır yağı ve soya yağında bulunurlar. Bitki yağından elde edilen bir fitosterol kompleksi olan kampesterol, stigmasterol ve brassikasterol karışımıdır, kolestatin olarak adlandırılır ve bir gıda katkı maddesi olarak satılır. Fitosteroller insanlarda kolesterolu ℅ 15 oranında azaltabilirler (Bakla, 2010).
2.2.4. Fenoller
Fenolik bileşikler bir aromatik halkaya direk olarak bağlı bir veya daha fazla hidroksil grubu içeren bileşiklerdir. Fenoller birçok yönden bir karbon zincirine bağlı hidroksil grubu içeren alifatik yapılı alkollere benzerdir. Ancak fenoksi anyonu kararlı olduğu için, fenoller alifatik alkollere göre daha asidik özelliktedirler.
2.2.5. Bitkilerdeki Fenolikler
Fenolik bileşikler bitki aleminde yaygın bir şekilde dağılım göstermektedir. Bitki dokuları kg başına birkaç grama kadar fenolik bileşik içermektedir. UV ışınları, mikrobiyal enfeksiyonlar ve strese sebep olan kimyasallar gibi dış etkiler onların
sentezini uyarmaktadır. Fenolik bileşiklerin bazı meyveler ile onlardan elde edilen içeceklerde ve tıbbi bitkilerde fazla miktarlarda bulundukları bilinmektedir (Haslam, 1996; Tanaka, 1999). Şekil 2.7.’de bitkilerde bulunan fenolik bileşiklerin sınıflandırılması gösterilmiştir.
Şekil 2.7. Fenolik bileşiklerin sınıflandırılması (Gül, 2011) 2.3. Bitkinin Familyası ve Tanıtımı
2.3.1. Asteraceae (Papatyagiller)
Asteraceae, çiçekli bitkilerin en büyük familyası olarak bilinir. İki çenekliler sınıfından olup genellikle otsu, çok azı çalı, ağaç ve lian şeklindedirler (odunsu sarılıcı bitkiler). Familyanın ismi yıldız şeklinde çiçekleri bulunan bir cins olan Aster türünden gelmektedir. Bu bitkilerin çiçek durumunun kompozit yapısı, taksonomistlerin bu familyayı Compositae olarak anmasına yol açmıştır. Yapraklar basit veya bileşik, stipulsuz, alternat, rozet şeklindedir. Çiçekler baş veya kapitulum durumlarındadır.
Fenolikler
Polifenoller Basit Fenoller
Tanninler Flavonoidler Flavon Kalkon Flavonol Flavonon İsoflavonon Antosiyanidin
Fenolik asitler Diğerleri Kumarinler Stilbenler Lignanlar Hidroksi Sinnamik ve
Hidroksi Benzoik asitler Gallik asit ve
Kateşin/Epikateşin Polimerleri
Şekil 2.8. Papatyagiller familyasından 12 alt tür
Dünyada 1100 cins ve 25000 civarında türle temsil edilen kozmopolit bir familyadır. Türkiye'de 133 cins ve bunlara ait 1156’dan fazla türü bulunmaktadır (Simpson, 2006). 2.3.2. Echinops orientalis Trautv. Cinsinin Genel Özellikleri
Echinops orientalis Trautv. papatyagiller familyasındandır(Şekil 2.9.). Bitki halk arasında Topuz, Topuzbaşı, Dikenbaşı, Gökdiken, Serteş, Kirpidikeni, Kirpibaşı, Eşek dikeni olarak bilinir. Echinops, Yunancada “kirpi görünüşlü” demek olan echinos sözcüğünden gelir. 80-120 cm boylarında, beyazımsı dik ve dalsız gövdeli; tabanda 20 cm’ye ulaşan uzunlukta, yukarıda küçülen, ait yüzleri gümüşi, üstleri koyu yeşil, yüreksi, almaşık dizilişli, dişli ve kıvrık kenarlı, parçalı yaprakları olan; temmuz-eylül aylarında uzun bir sapın ucunda, çelik mavisi, 3 cm çapında kömeç şeklinde tek çiçekler açan, iki, ya da çok yıllık, dikenli, otsu bir bitkidir. Kanatlı meyveleri zehirli (toksik) diye bilinir. Çiçekler dikenli olmalarına rağmen hoş görünüşünden dolayı kesme ve kuru çiçekçiliğe de uygundur. Ayrıca bu devedikeni kadar sert dikenli de değildir. Eğer bütün çiçekler açılır ve kesilirse yaz içinde yeni bir çiçeklenme yaşayabilir. Bitkinin toprak üstü kısımları kışın yok olur. 1500 metreye kadar bol güneşli, kurak ve taşlık alanlarda bulunur. Echinops orientalis Trautv.Türkiye’de başlıca Amasya, Tokat, Ankara, Giresun, Kars, Kahramanmaraş, Erzincan, Bitlis, Adana, Hatay illerinde yetişmektedir.
Şekil 2.9. Echinops orientalis Trautv. bitkisi
Sistematik
Latince Adı : Echinops orientalis Trautv. Alem : Plantae Bölüm : Kapalı Tohumlu Sınıf : Çift Çenekli Altsınıf : Asteridae Takım : Asterales Familya : Asteraceae Cins : Echinops
Tür : Echinops orientalis Trautv.
Genel Takson Bilgisi Ömür : Çok veya İki yıllık Yapı : ot
Çiçeklenme : 6-8
Habitat : stepte, taşlık ve şali yamaçlar, kireçtaşı kayalığı, mağmatik kayalık, nadas tarla, Quercus
Yükseklik : 0-1980 Endemik : Endemik değil Element : İran-Turan
Türkiye dağılımı : G. ve Karasal Anadolu
2.4. Echinops Türleri Alanında Yapılan Çalışmalar
Chaudhuri (1992) tarafından Echinops echinatus üzerinde yapılan çalışmada glikozitler, alkaloidler, triterpenoidler, etil palmitat bileşikleri izole edildi. Ayrıca yapraklarından da alkaloid,7-hydroxy-3-(2-hydroxyethyl)-(3H)-quinazolin-4-one(1) molekülü elde edildi.
Li ve ark., (2010) Echinops ritro L. türü üzerinde yaptıkları çalışamalarda üç tanesi yeni olmak üzere toplam onbir tane seskiterpen yapısındaki bileşikleri izole ettiler. İzole edilen yeni bileşikler: (3α,4α,6α)-3,13-dihydroxyguaia-7(11),10(14)-dieno-12,6-lactone (20), (3α,4α,6α,11β)-3-hydroxyguai-1(10)-eno-12,6-lactone (21), (11α)-11,13-dihydroarglanilic acid methyl ester (22)’dir (Şekil 2.10.).
HO H H HOH2C O O HO H O OH OHH COOMe O OHH O O O O O H H O CH2OH O O HO H H O O OH HO H H O O HO O H H O OH O O OH O HO O OH O O 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Şekil 2.10. Echinops ritro L. bitki türünden izole edilen seskiterpen bileşiklerin yapısı
Dong ve ark., (2007) yaptıkları çalışmada Echinops spinosus bitkisinin köklerinden echinopane olarak adlandırılan iskelete sahip iki yeni seskiterpen olan Echinopines A ve B bileşiklerini izole ettiler (Şekil 2.11.).
OR O H H H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 31 R=H 32 R=CH3 OR O 33 R=H 34 R=CH3
Şekil 2.11. Echinopines A ve B bileşiklerinin yapısı
Wang ve ark., (2006) Echinops latifolius türünün köklerinin etanol ekstraksiyonu ile altı tiyofen bileşiği elde ettiler (Şekil 2.12.). Elde edilen bileşiklerin yapılarını spectral verilere dayanarak belirlediler. İzole edilen tiyofen bileşikleri içerisinde 5-(3-hydroxmethyl-3-isovaleroyloxyprop-1-ynyl)-2,20-bithiophene (40) bileşiğinin yeni bir bileşik olduğunu ve 5-(3-hydroxy-4-isovaleroyloxybut-1-ynyl)-2,20-bithiophene (39) bileşiğinin ise bu bitkiden ilk kez izole edildiğini belirlediler.
S S C C C H CH2 S S S S S C C C C S S S S C C O O S S C C OH O O S S C C OH O O 35 36 37 38 39 40
Singh ve ark., (1988) yaptıkları çalışmada Echinops echinatus Roxb. bitkisinden dört fenolik bileşik (apigenin, apigenin-7-O-glucoside, echinacin, ve echinaticin) izole ettiler. Son iki bileşik ilk kez bu çalışmada izole edildi. Echinacin permethyl ether ve apigenin-5,4′-dimethyl etherin iki türevi sırasıyla echinacin ve apigenin-7-O-glucoside permethylate’ın metilasyonu ile elde edildi. İzole edilen bileşiklere antifungal aktivite testleri uygulandı ve 150 μg mL−1 Echinacin’in Alternaria güvercin bezelye yanıklığına karşı ümit verici olduğu belirlendi.
Rudrappa ve Mohmoud, 2010; Echinops echinatus Roxb. bitkisinin köklerinden elde
edilen ekstraktların DPPH, nitrik oksit ve süperoksit rakidali giderme aktivitelerini incelediler. Echinops echinatus Roxb. kökünün etanol ekstraktlarının standart askorbik aside kıyasla yüksek radikalik aktivite gösterdiğini belirlediler. Gözlenen aktivitenin ekstraktlar içinde bulunan flavanoid ve yüksek fenolik içeriğinden kaynaklanabileceği sonucuna vardılar.
Yukarıda verilen literatür bilgilerine bakıldığında Echinops’un diğer türleri üzerinde birçok çalışma yapılmış olmasına rağmen Echinops orientalis Trautv. türü üzerinde kayda
değer bir çalışma yoktur. Bu bağlamda yapılan bu çalışmada Echinops orientalis Trautv.
bitkisindeki sekonder metabolitler izole edilerek yapıları belirlendi ve elde edilen bileşiklerin antioksidan aktiviteleri incelendi.
2.5. Serbest Radikaller ve Genel Özellikleri
Serbest radikaller, bir veya daha fazla ortaklanmamış elektron içeren atom veya moleküllerdir. Bu atom veya moleküller en dış elektron kabuğundan bir elektron kaybetmiş olduklarından bu elektron açığını kapatabilmek için başka atomların elektronlarını paylaşma eğilimindedirler (Halliwell ve ark., 1992). Serbest radikal oluşturan kaynaklar radyasyon, virüsler, UV ışınları, X-ışınları, ozon kozmik ışınlar, hava kirliliğini yaratan fosil kökenli yakıtların yanma sonundaki ürünleri, sigara dumanı, otomobil egzoz gazları, sanayi atıkları, enfeksiyonlar, stres, hücre metabolizmasının toksik ürünleri, bazı tahrip edici kimyasallar, haşere kontrol ilaçları ve birçok başka etkenlerdir.
Radikal tepkimeleri biyoloji ve tıpta yaşamsal bir öneme sahiptir ve yaşayan her canlıda her an oluşmakta ve kaybolmaktadır. Çünkü radikaller, metabolizmanın normal işleyişi sırasında sürekli olarak üretilmektedir. Moleküler oksijen (O2) kendisi bir diradikaldir.
Temel haldeki moleküler oksijen, oksijen atomlarının her ikisinde de birer çiftleşmemiş elektron bulundurur. Radikaller, oksijen içerip içermediğine göre iki kısımda toplanırlar. Oksijen içeren radikaller serbest oksijen radikalleri (SOR) olarak adlandırılırlar. Biyolojik sistemlerde sıklıkla kullanılan ve serbest oksijen radikalleri Çizelge 2.2.’de verilmektedir (Sies, 1991).
Çizelge 2.2. En sık karşılaşılan serbest radikaller ve serbest radikal üreten türlerin bazı özellikleri (Halliwell, 1994)
Adı Simge Etkisi
Hidrojen radikali H• Bilinen en basit radikal Süperoksit
radikali
O2•- Oksijen metabolizmasının ilk ara ürünü
Hidroksil radikali
OH• En toksik (reaktif) oksijen metaboliti radikali Hidrojen
peroksit
H2O2 Reaktivitesi çok düşük, moleküler hasar yeteneği zayıf
Singlet oksijen 1O2 Yarılanma ömrü kısa, güçlü oksidatif form
Perhidroksi radikali
HO2• Lipidlerde hızlı çözünerek lipid peroksidasyonunu artırır
Peroksil radikali ROO•- Perhidroksile oranla daha zayıf etkili, lipidlere lokalize olur
Triklorometil radikali
CCl3• CCl4 metabolizması ürünü, karaciğerde üretilen bir
radikal
Tiyil radikali RS• Sülfürlü ve çiftlenmemiş elektron içeren türlerin genel adı
Alkoksil radikali RO• Organik peroksitlerin yıkımı ile üretilen oksijen metaboliti
Azot monoksit NO L - argininden in vivo üretilir
2.6. Antioksidanlar
Oldukça aktif moleküller olan radikallerin çoğalması canlı sistemlerde kontrol edilemeyen hasarlara yol açabilirler. Antioksidanlar, serbest radikalleri nötralize ederek oksidasyonunu engelleyen, yavaşlatan, durduran bileşiklerdir. Antioksidanlar, peroksidasyon zincir reaksiyonunu engelleyerek ve/veya reaktif oksijen türlerini toplayarak lipid oksidasyonunu inhibe ederler (Halliwel ve ark., 1992; Halliwell, 1994).
Antioksidan savunma mekanizmaları oldukça çeşitli olup bunlardan bazılarını şöyle özetlemek mümkündür:
1. Radikal metabolit üretiminin önlenmesi,
2. Üretilmiş radikallerin temizlenmesi (detoksifikasyon) 3. Hücre deformasyonunun onarılması
4. Sekonder radikal üreten zincir reaksiyonlarının durdurulması 5. Endojen antioksidan kapasitesinin artırılması.
Antioksidanlar, doğal (endojen kaynaklı) ve eksojen kaynaklı antioksidanlar olmak üzere başlıca 2 gruba ayrılırlar. Doğal antioksidanlar etki mekanizmalarına göre enzimatik ve nonenzimatik olarak da iki sınıfa ayrılır. Şekil 2.13.’de antioksidanların sınıflandırılması verilmektedir.
Şekil 2.13. Antioksidanların sınıflandırılması (Ahıskalıoğlu, 2007)
Vücuttaki fizyolojik aktivitenin doğal ürünü olan serbest radikalleri, organizma doğuştan kazandığı çok hassas bir donanımla oksidan-antioksidan denge olarak tanımlayabilecek bir çizgide tutmaya çalışır. Oksidanlar ve antioksidanlar arasındaki bu dengenin özellikle oksidanlar lehine bozulması membran lipitleri, proteinler ve DNA gibi hücrenin önemli yaşamsal yapılarında bütünlüğün bozulmasına ve canlıda patolojik olayların gelişmesine yol açar.
Antioksidan savunma; radikal metabolit üretiminin önlenmesi, üretilmiş radikallerin temizlenmesi, oluşan hücre deformasyonunun onarılması, sekonder radikal üreten zincir reaksiyonlarının durdurulması ve endojen antioksidan kapasitenin artırılması olarak tanımlanan beş değişik şekilde yürür (Akkuş, 1995; Ahıskalıoğlu, 2007).
3. MATERYAL ve METOT 3.1. Bitkisel Materyal
3.1.1. Bitkinin Toplanması ve Tür Teşhisi
Tez çalışması kapsamında Echinops orientalis Trautv. bitkisi Gaziosmanpaşa Üniversitesi Kampüs çevresinden Ekim 2010 tarihinde toplandı. Tür teşhisi Sivas Cumhuriyet Üniversitesi Biyoloji Bölümü Öğretim Üyesi Yrd. Doç. Dr. Aşkın Akpulat tarafından gerçekleştirildi (No:4580AA).
3.1.2. Bitkinin Kurutulması ve Depolanması
Echinops orientalis Trautv. bitkisi gövde, kök, yaprak ve tohum olarak ayrılıp ince ince kıyıldı. Oluşan bitki parçaları baskısız kağıtların üstüne serpiştirilerek gölgeli, havadar ve sıcak bir yerde kurumaya bırakıldı.
3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler
Çözücüler: Kloroform, diklorometan, etilasetat, metanol, etanol, heksan, DMSO. Deneysel çalışmalarda kullanılan çözücüler literatürdeki destilleme prosedürlerine göre destillendikten sonra kullanıldı.
Reaktifler: DPPH, FeCl3, ferrozin (Sigma), K3Fe(CN)6, TCA, KH2PO4, Na2CO3,
Folin-Ciocalteu Reaktifi (Sigma-Aldrich), BHA, BHT, Vitamin E, Gallik asit (Merck), Amonyum seryum sülfat (Sigma).
Dolgu maddeleri; Silika jel (Merck 60-230 mesh), Alimüna ince tabaka kromatografi (İTK) tabakları (20x20) (Merck).
Belirteçler: Serik sülfat (12 g amonyum seryum(IV) sülfat + 50 mL derişik sülfürik asit + 450 mL su şeklinde hazırlandı).
3.3. Kullanılan Cihazlar
1
H-NMR (Bruker 400 MHz Spektrometre), 13C-NMR (Bruker 100 MHz Spektrometre) LC/MS-TOF (Agilent 6210 Time of Flight LC/MS), UV spekrometresi (PerkinElmer LS 55 spectrophotometer), Döner buharlaştırıcı (IKA), Manyetik karıştırıcı (IKA) Vakum pompası, UV lambası (Camag)
3.4. Metot
3.4.1. Echinops orientalis Trautv.Bitkisinin Yaprak ve Tohum Kısmının Özütlenme (Ekstraksiyonu) İşlemi
Kurutulmuş bitkinin yaprak kısmı metanol-kloroform (2/1) karışımında 5 gün oda sıcaklığında bekletildi. Beşinci günün sonunda adi süzgeç kağıdı yardımıyla bitki kalıntıları süzülerek, kalıntılar tekrar aynı çözücü karışımında 5 gün süreyle tekrar ekstraksiyona bırakıldı. 6 kez ekstraksiyon işleminden sonra ekstraktlar birleştirilerek çözücü döner buharlaştırıcı yardımıyla uzaklaştırıldı. Tohum kısmının ekstraksiyonu için de aynı işlemler yapıldı.
3.4.2. Bitki Özütlerini Ayırma ve Saflaştırma İşlemi 3.4.3. Kolon Kromatografisi
Echinops orientalis Trautv. bitkisinden elde edilen moleküllerin izolasyonu ve yapı tayininde ve gerekirse de izole edilen bileşenlerin antioksidan aktivite testlerinde kullanılması ve bazı spektroskopik analizlerde numune tahribatından dolayı bu çalışmada mümkün olan en yüksek miktarda ham ekstrakt ile ayırma saflaştırma işlemine başlandı. Bundan dolayı, 110 cm uzunluğunda 3.5 cm çapında ve 50 cm uzunluğunda 4 cm çapında vakum pompası destekli özel yapım cam kolonlar kullanıldı. Kolonların alt kısmına pamuk konduktan sonra hekzan ile bulamaç haline getirilmiş silikajel yavaş yavaş dolduruldu. Her ilaveden sonra silika jelin çökmesi beklendi ve çözücü alt kısımdan alındı. Bu şekilde kolonun 2/3 ünden fazlası dolduruldu. Bu işlemlerden sonra kolonlara ham ekstraklar ilave edildi. Bunun üzerine ham ekstrakların dağılmasını engellemek amacıyla bir miktar silikajel ilave edildi ve kolon kromatografisi işlemlerine başlandı.
Düşük polariteli çözücü sistemi ile başlanarak ve belli oranlarda polarite yükseltilerek en yüksek polarite ile ayırma işlemleri tamamlandı. Fraksiyonlar 25 mL’lik hacimlerle toplanarak İTK kontrollü olarak birleştirildi. Birleştirilen fraksiyonlar kristallenmeye bırakılarak saflaştırıldı.
Kolon kromatografisi işlemi süresince hekzan çözücüsünden başlanarak sırasıyla hekzan-diklorometan, diklorometan, diklorometan-etil asetat, etil asetat, etil
asetat-metanol gradienti kullanılarak çözücü polaritesi sürekli olarak artırıldı. Fraksiyonlar derişimine bağlı olarak 250mL-400mL olarak toplandı. Kolon kromatografileri kolondan metanol geçirilerek sonlandırıldı.
Kolon kromatografisinde elde edilen fraksiyonlar Rf (yürüme hızı) değerlerine göre birleştirildi. Çizelge 3.1. ve Çizelge 3.2.’de birleştirilen fraksiyonlar çözücü sistemleri ve fraksiyonlara uygulanan işlemler toplu halde verilmektedir.
Çizelge 3.1. Bitkinin yaprak kısmının metanol-kloroform (2:1) ekstresine yapılan kolon kromatografisi işlemleri
Fraksiyonlar Uygulanan Çözücü Sistemi Yapılan İşlemler
1–15 Diklorometan - 16-47 Diklorometan-etilasetat(9:1) - 48-59 Diklorometan-etilasetat(8:2) - 60-73 Diklorometan-etilasetat (7:3) - 74-110 Diklorometan-etilasetat (1:1) - 111-127 Etil asetat -
128-136 Etil asetat Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı.
137-140 Etil asetat -
141-155 Etil asetat-metanol (9.5:0.5) -
156-158 Etil asetat-metanol (8:2) Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı.
159-175 Etil asetat-metanol (7:3) -
176-197 Etil asetat-metanol (1:1) -
Çizelge 3.2. Bitkinin tohum kısmının metanol-kloroform (2:1) ekstresine yapılan kolon kromatografisi işlemleri
Fraksiyonlar Uygulanan Çözücü Sistemi Yapılan İşlemler
1–2 Diklorometan - 3-5 Diklorometan-etilasetat(9:1) - 6-10 Diklorometan-etilasetat(8:2) - 11-15 Diklorometan-etilasetat(7:3) - 16-22 Diklorometan-etilasetat(6:4) - 23-28 Diklorometan-etilasetat (1:1) - 29-33 Diklorometan-etilasetat (4:6) -
34-38 Etil asetat Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı.
39-41 Etil asetat -
42 Etil asetat Antioksidan Aktivite Testleri uygulandı.
43-57 Etil asetat - 58-73 Etil asetat-metanol (9:1) - 74 Etil asetat-metanol (8:2) - 75 Etil asetat-metanol (8:2) - 76-83 Etil asetat-metanol (8:2) - 84-92 Etil asetat-metanol (7:3) - 93-97 Etil asetat-metanol (6:4) - 98-107 Etil asetat-metanol (1:1) - 108-112 Etil asetat-metanol (4:6) - 113-120 Etil asetat-metanol (3:7) - 121-138 Metanol -
3.4.4. İnce Tabaka Kromatografisi (İTK)
Kolon kromatografisi deneyi sonucunda 220 adet fraksiyon toplandı ve elde edilen fraksiyonlar İTK işlemine tabi tutuldu. Çözücü sistemlerinde yürütülen İTK plakalarındaki spotlar UV ışığında incelendi. UV ışığında görülemeyen spotlar ise plakalardaki maddeler ile kompleks oluşturarak görünür hale getirilmek için plakalara
serik sülfat belirteci püskürtüldü ve plakalar hafif ısıtılarak renkleri gözlemlendi (Şekil 3.1.).
Şekil 3.1. Kolon kromatografisinden elde edilen fraksiyonların İTK görünümü
İTK incelenerek Rf (yürüme hızı) değerine göre aynı madde içeren fraksiyonlar birleştirildi. Birleştirilen fraksiyonlar kristallenmeye bırakılarak saflaştırıldı.
3.5. İzole Edilen Bileşenlerin Yapılarının Tayinleri İçin Uygulanan Analizler 3.5.1. 1H-NMR ve 13C-NMR Analizleri
Kolon kromatografisi ve ekstraksiyon ile saflaştırılan ve saflığı İTK ile teyit edilen maddelerin kimyasal yapılarının aydınlatılması için bir ve iki boyutlu NMR tekniklerinden yararlanıldı. Bu amaçla fakültemiz bünyesinde bulunan Bruker marka 400 MHz cihazı kullanıldı. Ayrıca saflaştırılan maddelerin molekül kütlelerini belirlemek için LC/MS-TOF analiz tekniğinden yararlanıldı ve söz konusu analizler Çankırı Karatekin Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü’ndeki LC/MS-TOF cihazı kullanılarak yapıldı.
3.6. Antioksidan Aktivite Testleri
Bitki türevli yenilebilir/yenilemez ürünler büyük oranda antioksidan özelliğe sahip fenolik bileşikler (örneğin; fenolik asitler, flavanoidler, antosiyaninler, taninler, lignanlar ve kateşinler) içerir. Bu bileşiklerin antioksidan özellikleri temelde onların hidrojen atomu vericisi veya indirgeme ajanı olarak davranmalarından dolayı
indirgeyebilme yeteneklerinden kaynaklanır. Bu doğal antioksidanlar; serbest radikal toplayıcısı, zincir kırıcı, proantioksidant metal iyonlarını kompleksleştiri olarak davranır. Meyvelerin, sebzelerin ve diğer bitki türevli ürünlerin antioksidan aktivitesini bir tek testle kesin olarak tespit etmek zordur. Doğal kaynaklı ürünlerin antioksidan aktivitesini değerlendirmek için birçok test önerilmiştir. Doğal ürünlerin antioksidan aktivitesinin belirlenmesi için en azından iki test uygulanmalıdır (Tüfekçi, 2010).
Antioksidan aktivite çalışmalarında; toplam fenolik madde, total indirgeme gücü, serbest radikal giderme (DPPH testi) aktivitesi ve ABTS katyon radikali giderme aktivitesi testleri yapıldı.
3.6.1. Serbest Radikal (DPPH·) Giderme Aktivitesi
Bitki ekstraktlarının ve elde edilen moleküllerin serbest radikal giderme aktivitesi Blois metoduyla 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH.) kullanılarak ölçüldü. Bu metot, koyu menekşe renkli olan DPPH çözeltisinin, sistem içindeki herhangi bir molekül tarafından elektron transferi olduğunda rengin açılması ve bu renk değişikliğinin UV spektrofotometre ile ölçülmesi esasına dayanır. Renk ne kadar açılır ve çözeltinin absorbansı ne kadar düşük çıkarsa serbest radikali giderme gücü o oranda artar diye yorumlanabilir.
Z• + AH = ZH + A• tepkimesinde Z•, DPPH molekülünü, AH ise elektron donörü olan molekülü temsil eder. Tepkime sonunda oluşan ZH (Difenilpikrilhidrazin) molekülü oluşur ki bu molekül artık bir serbest radikal değildir.
İlk olarak 0,25 mM’lık DPPH’nin etanol çözeltisinden 1mL alındı ve üzerine farklı derişimlerdeki (20, 40, 80 ve 160 µL) stok çözeltileri eklenerek hacim etanol ile 4 mL’ye tamamlandı. Çözeltiler vortekslenerek karanlıkta 30 dk. inkübe edildi. DPPH radikal formunun maksimum absorpsiyon gösterdiği dalga boyu olan 517 nm’de çözeltilerin absorbansları ölçüldü. Spektroskopik ölçümler (PerkinElmer LS 55 model spektrometre) UV cihazı ile yapıldı ve analitlerin serbest radikal giderme aktivitesi aşağıdaki formül ile hesaplandı.
% SRG= [(Akontrol-Anumune)/Akontrol]x100
Akontrol= (Etanol + DPPH) absorbansı
Anumune= (Etanol + DPPH + Ekstrakt) absorbansı
Sonuçlar diğer aktivite testlerinde olduğu gibi % aktivite olarak hesaplandı. 3.6.2. İndirgeme Gücü Aktivitesi
İndirgeme gücü aktivitesi K3[Fe(CN)6 bileşiğindeki Fe3+ iyonunun numunedeki
moleküller ile tepkimeye girerek Fe(CN)64- anyonundaki Fe2+ ye indirgenmesi temeline
dayanmaktadır.
K3[Fe(CN)6] + numune Fe(CN)6
4-Şekil 3.3. İndirgeme gücü aktivitesi deneyinde gerçekleşen ilk reaksiyon
Oluşan Fe(CN)64- anyonu sonradan eklenen FeCl3 bileşiğindeki Fe3+ iyonu ile renkli
Fe4[Fe(CN)6]3 kompleksini oluşturur ve UV’de 700 nm’de bu renkli kompleksin
absorbansı ölçülmektedir.
FeCl3 +Fe(CN)64- Fe4[Fe(CN)6]
Şekil 3.4. İndirgeme gücü aktivitesi deneyinde gerçekleşen ikinci reaksiyon
Dolayısıyla çözeltideki saf madde veya maddeler ne kadar güçlü antioksidant ise Fe3+
iyonu o kadar Fe2+ye indirgenir ve böylece oluşan renkli kompleksin konsantrasyonu daha yüksek olacağı için 700 nm’de okunan absorbans değeri daha büyük olur.
İndirgeme gücü aktivitesi için daha önce hazırlanan stok çözeltilerinden 20, 40, 80 ve 160 µL tüplere alındı ve toplam hacim fosfat tamponu (pH= 6,6 0,2 M) ile 1,25 mL’ ye tamamlandı. Üzerine %1’lik 1,25 mL K3[Fe(CN)6 eklendi. Karışım 50 oC 30 dk inkübe
edildi. Bu süre sonunda karışıma %10’luk 1,25 mL TCA (Trikloroasetik asit), % 0,1’lik 0,25 mL FeCl3. 6H2O ilave edildi ve karışımlar vortekslenerek homojenize edildi. Elde
edilen karışımlar 700 nm’de maksimum absorpsiyon gösteren Fe4[Fe(CN)6]3
kompleksinin absorbansları ölçüldü ve sonuçlar bu ölçülen absorbans değerlerine göre değerlendirildi.
3.6.3. ABTS Katyon Radikali Giderme Aktivitesi
Bir erlen içerisinde (alüminyum folyoya sarılmış) 2 mM ABTS çözeltisi hazırlandı. Daha sonra ABTS çözeltisi içerisine 2,45 mM sodyum persülfat çözeltisi ilave edildi ve oda sıcaklığında 6 saat bekletildi. Çözeltinin 734 nm de absorbans değeri 0,750 ± 0,025 olacak şekilde fosfat tamponu ile seyreltme yapıldı. Dört farklı derişimde (20, 40, 80 ve 160 µL) hazırlanan numune çözeltileri deney tüplerine ilave edilerek tampon çözelti ile 3 mL’ye tamamlandı. Deney tüplerine 1 mL ABTS çözeltisi eklenerek vorteks yapıldı ve 30 dakika beklemeye bırakıldı. Daha sonra çözeltilerin 734 nm de absorbans değerleri okundu.
3.6.4. Total Fenolik Bileşik Miktarı Tayini
Bitkinin metanol-kloroform ekstraktlarındaki toplam çözünebilen fenolik maddeler Folin-Ciocalteu reaktifi (FCR) ile tayin edildi (Singleton ve Rossi, 1965). FCR, fosfotungustik (H3PW12O40) ve fosfomolibdik (H3PMo12O40) asitlerin karışımı olup
fenol oksidasyonu sırasında bu oksitler mavi renkli bileşiklere indirgenir. Bu renk değişimi polifenolik bileşik miktarı ile orantılı olup 760 nm’de spektofotometrede takip edilir. Polifenol miktarı genellikle gallik asit veya kateşol ekivalenti olarak ifade edilir.
Bitkinin 100-1000 μg/mL konsantrasyonlarında hazırlanan metanol-kloroform ekstraktlarından 0,1 mL alındı. Destile su ile hacimler 4,6 mL’ye tamamlandıktan sonra 0,1 mL FCR eklendi. 3 dakika sonra 0,3 mL % 2’lik Na2CO3çözeltisi katılarak oda
Değişik konsantrasyonlarda (50mg/50mL) hazırlanan gallik asit çözeltilerine FCR ile toplam fenolik madde tayini uygulandı. Bitki ekstraktlarında bulunan toplam fenolik bileşiklerin konsantrasyonları gallik asitten hazırlanan standart çözeltilerin kalibrasyon eğrilerinden elde edilen grafik denklemlerinden gallik asite eşdeğer (μg GAE/g ekstrakt) olarak hesaplandı.
4. BULGULAR ve TARTIŞMA
4.1. İzole Edilen Bileşiklerin Yapı Analizi
4.1.1. Metil-1H-indol-1-karboksilatın (34-38.fr) Yapı Tayini
Echinops orientalis Trautv. bitkisinin tohum kısmının metanol-kloroform (2:1) ekstresine yapılan kolon kromatografisi işlemleri esnasında %100 etil asetat fazında elde edilen ilk bileşik 34-38 nolu fraksiyon aralığında gelen metil-1H-indol-1-karboksilat’tır. 34-38 nolu fraksiyonlar TLC kontrolü ile birleştirildikten sonra toplanam fraksiyonların çözücüsü, 40 °C’de döner buharlaştırıcıda uzaklaştırıldı. Elde edilen çökelek yapı tayini amacıyla DMSO-d6 ile çözülerek 1H, 13C, 90,
DEPT-135, APT ve HETCOR spektrumları kaydedildi. Elde edilen NMR spektrumları Şekil 4.2.-4.4.’de ve spektrumlardan elde edilen datalar Çizelge 4.1.’de verilmiştir.
N OCH3 O 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 41
Şekil 4.1. Echinops orientalis Trautv.’dan izole edilen metil-1H-indol-1-karboksilat molekülü
Şekil 4.2.’de verilen metil-1H-indol-1-karboksilat bileşiğinin 1
H NMR spektrumu incelendiğinde toplam 6 tane aromatik ve metoksi protonlarının olduğu belirlenmiştir. Ayrıca azot atomuyla uzaysal olarak etkileşen protonların daha aşağı alanda rezonans olduğu ve etkileşme sabitlerinin diğer protonlardan daha büyük olduğu görüldü.
Şekil 4.2. Metil-1H-indol-1-karboksilat’ın 400 MHz 1 H NMR spektrumu 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 3.811 6.038 6.057 7.374 7.382 7.400 7.419 7.637 7.659 7.686 7.722 7.726 7.740 7.743 7.761 7.765 7.965 7.984 8.172 8.176 8.192 8.196 3.00 0.95 1.07 0.94 1.15 1.11 1.01
sakine tohum kolon 34-38
7.6 7.8 8.0
Şekil 4.3. Metil-1H-indol-1-karboksilat’ın 13
C, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları Çizelge 4.1. Metil-1H-indol-1-karboksilat’ın 1H-NMR ve 13C-NMR verileri (400 MHz,
DMSO-d6) C/H DEPT(90-135) δC ppm (Hz) δH ppm (Hz) Eşleşme sabitleri (J) HMBC 2 CH 2. 145,48 7,98 d J= 7,5 Hz 3 CH 3. 109,07 7,09 d J = 7,5 Hz H2 4 CH 4. 117,12 7,65 d J = 8,53 Hz H6 5 CH 5. 132,47 7,74 H7 6 CH 6. 123,80 7,40 ddd H4 7 CH 7. 125,98 8,18 dd J = 8 Hz J = 1,8 Hz H3, H4 8 C 8. 141,04 H2, H7 9 C 9. 126,96 H3, H5 10 C 10. 176,86 H2 11 CH3 11. 40,46 3,71
Şekil 4.3. incelendiğinde 13
C-NMR spektrumlarında olduğu halde DEPT-90 ve DEPT- 135 spektrumunda görülmeyen diğer pikler yapıdaki kuarterner karbon atomlarına aittir ve bu veriler ile yapıda 3 tane kuarterner atom olduğu tespit edildi. Bileşikte 176,86 ppm’de ki 10 nolu karbonil karbonu olup 8 ve 9 nolu diğer kuarterner karbonları sırasıyla 141,04 ve 126,96 ppm’de gözlendi. Daha elektronegatif azot atomuna komşu olan 2 ve 8 nolu karbonlarda sırasıyla 145,48 ve 141,04 ppm’de sinyal verdi. Ayrıca karbonil grubuna komşu metoksi karbonun 13C-NMR spektrumunda dötero DMSO pikinin altında kaldığı ancak DEPT-135 NMR spektrumundan 40,46 ppm’de sinyali gözlendi.
Sonuç olarak Şekil 4.3.’de verilen 13
C-NMR, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları incelenerek 3 tane C, 6 tane CH ve 1 tane CH3 olmak üzere bileşiğin 10 karbonlu
olduğu tespit edilmiştir ve bu öngörülen yapıyı doğrulamaktadır.
Şekil 4.4. Metil-1H-indol-1-karboksilat’ın HETCOR NMR spektrumu
Şekil 4.4.’de verilen metil-1H-indol-1-karboksilat bileşiğinin HETCOR spektrumunda bileşikteki proton karbon eşleşmeleri tespit edilmektedir. Spektrum incelendiğinde 145,48, 109,07, 117,12, 132,47, 123,80 ve 125,98 ppm’de gözlenen protonlara sahip 2,
3, 4, 5, 6 ve 7 nolu karbonların sırasıyla 7,98, 7,09, 7,65, 7,74, 7,40, 8,18 ppm’deki protonlarla korele olduğu görüldü ve 141,04 ve 126,96 ppm’deki proton korelasyonu olmayan karbonların kuarterner karbon olduğu belirlendi. Ayrıca 40,46 ppm’deki metoksi karbonunun 3,71 ppm’deki protonlarla korele olmakta bu da öngörülen yapıyı doğrulamaktadır. Ayrıca LC/MS-TOF spektrumunda gözlenen molekül ağırlığı yapı ile uyum içindedir (Şekil 4.5.).
Şekil 4.5. Metil-1H-indol-1-karboksilat’ın LC/MS-TOF spektrumu
[M-H] 173,0543 C10H9 O2N % 95 eşleşme
[M] 174.0543
4.1.2. Steroid Bileşiğinin (42.fr) Yapı Tayini
Kolon kromatografisi işleminde %100 etil asetat çözücüsünde gelen 42 nolu fraksiyon İTK kontrolü ile birleştirildikten sonra toplanan fraksiyonların çözücüsü, 40 °C’de döner buharlaştırıcıda uzaklaştırıldı Kristal kısmı metanol ile süzgeç kağıdından geçirilerek yıkandı ve daha sonra döner buharlaştırıcıda çözücüsü iyice uzaklaştırıldı. Elde edilen kristal, yapı tayini için DMSO-d6 ile çözünerek 1H, 13C, 90,
O O HO OH HO OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 4' 5' 6' 42
Şekil 4.6. Echinops orientalis Trautv.’dan izole edilen steroid bileşiği
Şekil 4.7. Steroid bileşiğinin 400 MHz 1
H NMR spektrumu 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 0.656 0.675 0.791 0.809 0.827 0.843 0.898 0.914 0.935 0.961 0.992 1.008 1.079 1.104 1.143 1.162 1.179 1.197 1.210 1.230 1.247 1.264 1.281 1.328 1.352 1.388 1.418 1.472 1.503 1.790 1.813 1.947 1.995 2.360 2.509 2.897 2.917 3.015 3.037 3.055 3.068 3.103 3.125 3.173 3.352 3.388 3.428 3.468 3.635 3.662 3.822 4.024 4.042 4.213 4.233 4.904 5.335 13.56 14.71 5.91 5.08 9.19 5.11 5.01 4.57 4.32 12.50 2.18 1.48 4.08 1.12 1.35 1.45 1.37 1.35 1.00
sakine tohum kolon 42 fr
O O HO OH HO OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1' 2' 3' 4' 5' 6'
Şekil 4.7.’de steroid bileşiğine ait 1
H-NMR spektrumu incelendiğinde, anomerik karbona bağlı anomerik proton ( 1H ) δ
H = 4,22 ppm’ de dublet olarak sinyali gözlendi.
Yapıda aromatik halkanın olmamasına rağmen 3 tane çift bağın olduğu gözlendi. C3 konumunda bağlı olan protonu (H3) δH = 4,93 ppm’de pentede rezonans olduğu
belirlendi. δH = 0,5-1 ppm arasında rezonans olan singlet pikleri moleküldeki metil
gruplarının varlığını belirtmektedir.
Şekil 4.8. Steroid bileşiğin APT, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları
Moleküle ait APT, DEPT-135 ve DEPT-90 spektrumlarından elde edilen veriler moleküldeki 3 adet kuarterner karbon (APT’de pozitif DEPT-135 ve DEPT-90 spektrumlarında sinyal yok), 6 adet –CH3 karbonu (APT’ de negatif, DEPT-135’de
varlığı tespit edildi. δc = 140,94 ppm deki C5 kuarterner karbon atomunu göstermek üzere yapıda toplam 35 tane karbon atomu olduğu tespit edildi.
Çizelge 4.2. Steroid bileşiğinin 1H NMR ve 13C NMR verileri (400 MHz, DMSO-d6)
C/H DEPT(90-135), APT δC (ppm) δH (ppm) 1 CH2 37,37 1,81 2 CH2 31,81 1,91 3 CH 79,00 4,93 4 CH2 39,97 1,97 5 C 140,90 6 CH 121,68 5,34 7 CH2 24,31 1,63 8 CH 31,87 1,55 9 CH 50,10 0,91 10 C 36,66 11 CH 125,99 8,19 12 CH 132,57 7,78 13 C 42,33 14 CH 56,75 0,99 15 CH2 23,09 1,24 16 CH2 29,73 1,51 17 CH 55,89 1,06 18 CH3 12,12 0,63 19 CH3 19,54 0,96 20 CH 35,95 1,34 21 CH3 19,4 0,80 22 CH 123,92 7,41 23 CH 109,10 6,06 24 CH 45,63 0,93 25 CH2 29,19 1,79 26 CH3 19,59 0,81 27 CH 19,58 0,95 28 CH3 20,19 0,81 29 CH3 12,25 0,83 1' CH 101,25 4,22 2' CH 73,95 3,41 3' CH 77,41 3,35 4' CH 70,59 3,41 5' CH 77,25 3,35 6' CH2 61,58 4,16
Şekil 4.9. Steroid bileşiğinin HETCOR NMR spektrumu
Şekil 4.9.’da steroid bileşiğinin HETCOR spektrumunda bileşikteki karbon proton etkileşmeleri tespit edilmektedir. Spektrum incelendiğinde (Şekil 4.9) moleküle bağlı olan şeker grubuna ait C1 anomerik karbonunun (δc = 101,25 ppm) 4,22 ppm’deki anomerik protonla korele olduğu görülmektedir. Molekülde yer alan vinilik C6 karbonunun (δc = 121,67 ppm) 5,37 ppm’deki H6 protonu ile etkileşimi tespit edilmektedir. Şekil 4.9.’da 3,35 ile 4,22 ppm arasındaki şeker halkalarındaki 6 tane protonun, 61,58 ile 101,25 ppm arasındaki 6 tane karbon atomuyla etkileşimi görülmektedir. LC/MS-TOF spektrumundan elde edilen molekül ağırlığı yapı ile uyum içerisindedir (Şekil 4.10.).
Şekil 4.10. Steroid molekülünün LC/MS-TOF spektrumu
[M-H] 572,4136 C35H56O6 % 96 eşleşme
[M] 573,4136
4.1.3. Flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p-kumaroil)--D-glukozit]) (128-136.fr) Yapı Tayini
Vakum kromatografisinde %100 etil asetat çözücüsünde gelen 128-136 nolu fraksiyonların, İTK’da yürütülüp serik sülfat belirteci ile 100-120 ºC’de sarı renk oluşturduğu gözlendi. Saflık kontrolü İTK ile yapıldı. Kristal kısmı metanol ile süzgeç kağıdından geçirilerek yıkandı ve daha sonra döner buharlaştırıcıda çözücüsü iyice uzaklaştırıldı. Elde edilen kristal, yapı tayini için DMSO-d6 ile çözünerek 1H, 13C,
DEPT-90, DEPT-135, APT, HETCOR, HMBC, COESY 90 NMR spektrumları kaydedildi.
43
Şekil 4.11. Echinops orientalis Trautv.’dan izole edilen flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p- kumaroil)--D-glukozit]) (128-136.fr) O O O O OH OH O OH HO HO OH H H H O 2 3 4 5 6 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 9 10 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' 6''' 7''' 8''' 9'''
Şekil 4.12. Flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit])’un 1 H-NMR spektrumu 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 3.818 3.836 3.859 4.451 4.481 5.156 5.174 6.312 6.352 6.476 6.481 6.656 6.678 6.809 6.815 6.839 6.910 6.932 7.356 7.378 7.475 7.514 7.934 7.956 12.981 1.70 16.54 1.11 1.11 1.08 2.40 1.11 1.07 0.99 2.07 2.15 2.16 1.94 1.14 2.00 1.16 0.88 1.03 7.0 7.5 ppm 5.6 5.4 5.2 ppm
Şekil 4.13. Flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p-kumaroil)- -D-glukozit])’un 13 C-NMR spektrumu 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm 63.883 65.388 70.409 73.390 74.272 74.570 76.688 95.133 99.920 103.463 105.825 114.159 116.103 116.434 121.419 125.329 128.976 130.529 145.378 157.347 160.240 161.604 161.832 163.149 164.700 166.898 182.427
Şekil 4.14. Flavon (Apigenin-7-O-[6"-(p-kumaroil)--D-glukozit])’un DEPT-90, APT ve DEPT-135 spektrumları
