SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ FĐZYOLOJĐ ANABĐLĐM DALI
APELĐNĐN SIÇANLARDA ĐN VĐTRO UTERUS KASILMALARI ÜZERĐNDEKĐ ETKĐSĐNĐN
ARAŞTIRILMASI
YÜKSEK LĐSANS TEZĐ Danışman: Doç. Dr. Selim KUTLU
Zübeyde ERCAN 2011
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans eğitimim boyunca bilimsel ve akademik tecrübesiyle bana daima
yol gösteren danışman hocam Sayın Doç. Dr Selim KUTLU’ya, Fizyoloji Anabilim
Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. Haluk Keleştimur’a, deney aşamasında destek ve
yardımlarını esirgemeyen Fizyoloji Anabilim Dalı Araştırma Görevlisi Dr. Emine
Kaçar’a, akademik yardım ve desteğinden dolayı Biyofizik Anabilim Dalı Öğretim
Üyelerinden Sayın Doç. Dr. Mete Özcan’a, Farmakoloji Anabilim Dalı Öğretim
Üyelerinden Sayın Doç. Dr. Engin Şahna ve bölüm asistanlarına en içten teşekkürlerimi
ĐÇĐNDEKĐLER
TEŞEKKÜR iii
ĐÇĐNDEKĐLER iv
KISALTMALAR LĐSTESĐ vii
1. ÖZET 1 2. ABSTRACT 2 3. GĐRĐŞ 3 3.1. Düz Kaslar 3 3.1.1. Düz Kaslarda Kasılma 4 3.2. Miyometriyum 7
3.2.1. Miyometriyumda Uyarılabilirlik ve Kasılma 7
3.2.1.1. Miyometriyumda Sarkoplazmik Retikulum 8
3.2.2. Miyometriyum Kasılmasının Elektrofizyolojik Özellikleri 10
3.2.2.1. Önderodaklar (Pacemaker) 10
3.2.2.2. Karakteristik Aksiyon Potansiyelleri 10
3.2.3. Miyometriyumda G-protein Sinyal Yolları 11
3.2.3.1. Miyometriyumda Fosfolipaz C 13
3.2.3.2. Miyometriyumda Adenilat Siklaz 14
3.2.4. Miyozin Hafif Zincir Fosforilasyonu, Kasılma ve Gevşeme 14
3.3. Apelin 14
3.3.1. Apelin Biyokimyası ve Metabolizması 15
3.3.2. Apelin Reseptörü 17
3.3.3. Apelinin Fizyolojik Etkileri 19
3.3.3.2. Đmmün Sistem Üzerine Etkileri 20
3.3.3.3. Besin Alımı Üzerine Etkileri 20
3.3.3.4. Apelinin Đnsülin ve Obeziteyle Đlişkisi 21
3.3.3.5. Apelinin Sıvı-Elektrolit Dengesi ve Hipotalamo-Hipofizeyal Eksenle Đlişkisi 22
3.3.3.6. Kardiyovasküler Etkileri 23
3.3.3.7. Apelin ve Solunum Sistemi 24
3.3.3.8. Apelinin Düz Kaslar Üzerine Etkisi 25
3.3.3.9. Apelinin Diğer Etkileri 26
3.3.3.10. Üreme Sistemi ve Apelin 26
AMAÇ 29
4. GEREÇ VE YÖNTEM 30
4.1. Deney Hayvanlarının Bakım ve Beslenmeleri 30
4.2. Deney Hayvanlarının Hazırlanması 31
4.3. Krebs Solüsyonu 31
4.4. Đzole Organ Banyosu 32
4.5. Apelinin Hazırlanması 33
4.6. Deney Protokolü 33
4.7. Đstatistiksel Metot 34
5. BULGULAR 35
5.1. Birinci Protokol Grubu Bulguları 35
5.2. Đkinci Protokol Grubu Bulguları 37
6. TARTIŞMA VE SONUÇ 39
7. KAYNAKLAR 43
KISALTMALAR LĐSTESĐ
SR : Sarkoplazmik Retikulum
IP3 : Đnozitol Trifosfat
DAG : Diaçil Gliserol
PLC : Fosfolipaz C
MHZ : Miyozin Hafif Zincir MHZK : Miyozin Hafif Zincir Kinaz GTP : Guanozin Trifosfat
cAMP : Siklik Adenozin Monofosfat
PKC : Protein Kinaz C
AR : Apelin Reseptörü
ICV : Đntraserebrovasküler
IV : Đntravenöz
ADH : Antidiüretik Hormon
FSH : Follikülü Stimüle Edici Hormon
LH : Luteinleştirici Hormon
L-NAME : Nitrik Oksit Sentez Đnhibitörü
NO : Nitrik Oksit
cGMP : Siklik Guanozin Monofosfat PI3K : Fosfatidil Đnozitol 3 Kinaz
ERK1/2 : Ekstrasellüler Sinyal-Düzenleyici Protein Kinaz
KL : Korpus Luteum
1. ÖZET
Yeni bir hormon olan apelin mide, yağ dokusu, kalp gibi birçok organın yanısıra
özellikle beyinde hipotalamustan sekrete edilmektedir. Endokrin sistem,
kardiyovasküler sistem ve metabolik işlevler gibi birçok vücut fonksiyonunda olası
etkileri henüz araştırılma aşamasında olan apelin için, üreme sistemi de önemli bir hedef
bölgedir. Bu çalışmada apelinin uterus kontraksiyonları üzerindeki olası etkileri
araştırılmıştır.
Çalışmada diöstrus dönemindeki dişi yetişkin Wistar türü (n=12) sıçanlardan
elde edilen miyometriyum şeritleri, içinde Krebs çözeltisi bulunan izole organ
banyosuna yerleştirildi. 1 gr gerim altında spontan kasılmalar gözlendi. Đzometrik
miyometriyum kasılmaları üzerinde 0.01 µM, 0.1 µM, 1 µM ve 10 µM
konsantrasyonlardaki apelinin etkisi araştırıldı. 1 µM ve 10 µM konsantrasyonlarda
uygulanan apelinin kontraksiyonların frekansını anlamlı düzeyde artırdığı görüldü
(p<0.05 ve p<0.001). Sadece 10 µM konsantrasyondaki apelin uygulamasından sonra
kontraksiyonların genliği anlamlı düzeyde arttı (p<0.01). Benzer deney protokolü Ca+2
bulunmayan Krebs çözeltisi kullanılarak tekrarlandı. Bu grupta da 10 µM apelinin
uterus kasılmalarını indüklediği gözlendi.
Bu araştırmanın sonuçları apelinin sıçan uterusunda kontraksiyonları belirgin
olarak indüklediğini göstermektedir. Kalsiyumsuz ortamda da aynı etkinin görülmesi,
apelinin hücre içi depolardan Ca+2 salıverilmesini indükleyerek kontraksiyonları stimüle
ettiğini düşündürmektedir.
2. ABSTRACT
A newly discovered hormone, apelin, is secreted in brain especially in
hypothalamus in addition to stomach, adipose tissue and heart. There are many
investigations regarding the effect of apelin on many body functions such as endocrine
system, cardiovascular system and metabolic processes. But there are guide limited
researchs including the effect of apelin on reproductive functions. Therefore, we looked
into the effect of apelin on myometrial contractions in dioestrus rat.
Myometrial strips were removed from adult female Wistar rats (on dioestrus)
following decapitation and placed in a jacketed organ bath containing Krebs solution,
and isometric contractions were evaluated in this study. After equilibration, spontaneous
contractions were recorded and the effects of bath application of increasing
concentrations of 0.01µM, 0.1µM, 1µM ve 10µM apelin on the amplitude and frequency
(number of contraction-relaxation cycles/ 10-min) of contractions were evaluated by
10min intervals. One Way ANOVA was used for statistical analysis. Apelin
significantly increased frequency of contractions at 1µM and 10µM concentrations
(p<0.05 and p<0.001, respectively). Apelin also increased the peak amplitude of
concentrations at only 10µM concentration (p<0.01). The other experimental protocol
was repeated by using Ca+2 free Krebs solution. Apelin (10µM) was induced
contractions in this group, as well.
The results of this study show that apelin induces myometrial contractions in rat.
It can conclude that apelin stimulates myometrial contractions by inducing Ca+2 release
from intracellular stores, because apelin has same effect in calcium free medium.
3. GĐRĐŞ 3.1. Düz Kaslar
Vücudun yaklaşık % 40’ı iskelet kası, % 10’u düz kas ve kalp kasıdır (1, 2). Düz
kaslar mikroskobik olarak görünür çizgilenmelerinin olmayışı nedeniyle iskelet kası ve
kalp kasından ayrılırlar (3, 4, 5, 6).
Düz kas hücreleri tek çekirdeklidirler ve iskelet kaslarına göre çok küçük
olmakla birlikte, boyları 20-500 mikrometre, çapları ise 1–5 mikrometre kadardır (1, 6).
Düz kaslarda Ca+2 için depo görevi gören bir hücre içi sarkoplazmik retikulum
(SR) membran ağı vardır. Düz kasın SR’sindeki Ca+2 kanalları, Ca+2 aktiveli Ca+2 kanalı
olan riyanodin reseptörü (RYR) ve inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3)-kapılı Ca+2 kanalları
olmak üzere 2 tiptir. RYR tipik olarak hücre içi Ca+2‘nın artmasıyla aktive olur. IP3
kapılı Ca+2 kanalı ise, bazı hormonal faktörlerin etkisiyle açığa çıkan IP3 tarafından
aktive edilir (7, 8, 9).
SR’ye elektriksel bağlantı sağlayan iskelet kasındaki T tübülleri düz kas
hücrelerinde bulunmaz. Bunun yerine düz kasın sarkolemmasında ‘kaveol’ olarak
adlandırılan cepler, uzunlamasına sıralanmıştır. Kaveollar hücrelerin yüzey/hacim
oranını artırırlar (7, 10, 11).
Düz kaslar genellikle tek birimli ve çok birimli düz kaslar olmak üzere iki
fonksiyonel kategoriye ayrılır. Tek birimli düz kaslarda, düz kas hücreleri elektriksel
olarak birbirleriyle bağlantılıdır. Bu bağlantı hücreler arasındaki düşük dirençli ‘gap
junction’ adı verilen yarık bağlantılarla sağlanır ve sinsityal fonksiyona sahiptir. Böylece bir hücrenin elektriksel uyarılmasını komşu düz kas hücrelerinin uyarılması
takip eder. Bu tip kaslar ince bağırsak, üreter, uterus gibi içi boşluklu organ
Çok birimli düz kaslar ise ayrı ayrı birimlerden oluşmuşlardır, yarık bağlantılar
birkaç tane veya yoktur. Her bir lif diğerinden bağımsız olarak çalışır ve temel olarak
sinir sinyalleri ile kontrol edilir. Gözün siliyer ve iris kası ile derideki piloerektör kaslar
çok birimli düz kaslardandır (1, 4, 13).
Düz kaslar sinir sinyalleri, hormonlar, pace-maker aktivite, ilaçlar, kasın
gerilmesi gibi pek çok sinyal tipiyle uyarılabilirler (4, 7).
3.1.1. Düz Kaslarda Kasılma
Düz kaslarda hücre dışı Ca+2 konsantrasyonu 10-3 M, hücre içi ise 10-7 M’dır (1).
Bu durum hem hücre içi ile hücre dışı arasında, hem de SR ile miyoplazma arasında çok
yüksek bir Ca+2 gradiyenti oluşturur. Bu fark, Ca+2’nın hücre zarı ile SR zarından geçişi
için bir kuvvet oluşturarak Ca+2’nın protein yapılı kanallar aracılığıyla geçişine yol açar.
Bu kanallar, çoğunlukla kapalıdır ve voltaj, mekanik uyarı ya da ligand bağlanması ile
aktive olarak Ca+2 geçirgenliği sağlarlar (14). Sarkolemma hücre dışı sıvıdan Ca+2 giriş
çıkışını düzenler. Düz kas kasılmasında hücre dışı Ca+2 önemlidir. Bu yüzden
miyoplazmik Ca+2 konsantrasyonu yalnızca SR ile değil, aynı zamanda sarkolemmal
aktiviteyle de düzenlenir (8, 15).
Hücrenin uyarılması, SR’deki Ca2+ kanallarının açılmasına yol açar ve
miyoplazmik Ca2+ konsantrasyonu hızla artar. Bu salıverilme, ikinci haberci IP3’ün
SR’deki reseptörlerine bağlanmasıyla gerçekleşir. IP3, hücre dışında bulunan
agonistlerin ilgili reseptöre bağlanması sonucu, G proteini aracılığıyla aktivasyon
gösteren fosfolipaz C (PLC) enzimi tarafından oluşturulur. PLC bir membran fosfolipidi
olan fosfatidilinozitol bifosfatı, IP3 ve diaçil gliserole (DAG) hidrolize eder. Daha sonra
IP3, SR’ye diffüze olarak IP3-kapılı Ca+2 kanallarını açar, bu da kalsiyumun SR’den
SR’deki diğer bir kanal olan RYR’lerin aktivasyonu öncelikle voltaj bağımlı
Ca+2 kanallarından hücre içine giren Ca+2 ile gerçekleşir. Miyoplazmik kalsiyumun
lokalize yükselmesiyle kısa süreli RYR açılmaları meydana gelir. Bu spontan, lokalize
miyoplazmik Ca+2 konsantrasyon artışları, ‘Ca+2 kıvılcımları’ olarak adlandırılan kısa
parlak flaşlar oluştururlar (20, 21). Bu kıvılcımların frekansındaki artma
sarkolemmadaki büyük iletkenliğe sahip Ca+2 kapılı K+ kanalını aktive ederek düz kasta
hiperpolarizasyona yol açar. Bu hiperpolarizasyon daha sonra hücre içi Ca+2
konsantrasyonunu azaltır ve gevşeme meydana gelir (7, 21, 22, 23).
Hücrede miyoplazmadan Ca+2‘nın uzaklaştırılması üç yolla gerçekleşir:
1. SR membranındaki Ca+2-ATPaz (SERCA) pompaları aracılığıyla SR’ye Ca+2
alımının artması.
2. Hücre membranındaki Ca+2 -ATPaz (PMCA) yardımıyla Ca+2 ‘nın hücre dışına
atılması (24).
3. Diğer ikisine oranla daha az olmak üzere Na+-Ca+2 değiştirici yardımıyla olmaktadır
(24).
SERCA pompaları SR lümeni ile miyoplazma arasında yaklaşık olarak 10.000
katlık bir Ca+2 gradiyenti oluştururlar ve bunu sürdürürler (25). Pompalar ATP
hidrolizinden elde ettiği enerjiyle Ca+2’yı miyoplazmadan SR içine alır. Ca+2, SR içine
pompalandıktan sonra kalretikülin ve kalsekestrin gibi proteinlerce tamponlanır. Bu
proteinlere büyük miktarlarda Ca+2 bağlanır. Böylece SR’de tamponlanan Ca+2
deposundaki Ca+2 konsantrasyonu yaklaşık olarak 10–15 mM’a ulaşır (26). Hücreden
Ca+2 çıkışı SERCA tarafından SR’de Ca+2 depolanmasıyla yarışır ve böylece SR’de Ca2+
Đskelet kası ve kalp kasında olduğu gibi Ca+2, kasılmanın başlangıcında en
önemli rolü oynar. Düz kasın kasılması hücre içi kalsiyumun artışıyla meydana gelir.
Đskelet kasındaki SR, kasılmada gerekli olan Ca+2’nın kaynağı iken, düz kaslarda Ca+2
iyonlarının hemen hepsi aksiyon potansiyeli veya diğer uyarılar sonucunda ekstraselüler
sıvıdan kas hücresine girer (1, 29, 30). Bu geçiş öncelikli olarak voltaj bağımlı Ca+2
kanalları aracılığıyla gerçekleşir. Bu kanalların aktivitesi depolarizasyon derecesine
bağlıdır. Daha büyük bir depolarizasyon, hücreye daha fazla Ca+2 girişine ve daha güçlü
bir kasılmaya yol açar (13).
Hücre içi Ca+2 artışı, miyozindeki düzenleyici hafif zinciri (MHZ) fosforile
ederek daha sonra aktinle etkileşmesine ve böylece kuvvet oluşumuna yol açan bir Ca+2
-kalmoduline bağımlı protein kinazı aktive eder. Kalmoduline 4 Ca+2 molekülü bağlanır.
Bu Ca+2-kalmodulin kompleksi MHZ’Đ fosforile eden miyozin hafif zincir kinazı
(MHZK) aktive eder. Miyozin çapraz köprülerin fosforilasyonuyla miyozin başları
aktine bağlanır ve çapraz köprü, ince filamanı kalın filamanın merkezine doğru çekerek
dişli çark etkisi oluştur ve kuvvet meydana gelir. Bu sırada miyozin başından adenozin
difosfat ve Pi serbestleşerek ATP’nin bağlanmasına izin verir. ATP, miyozinin aktine
affinitesini azaltarak miyozinin aktinden ayrılmasını sağlar. Yeni bağlanan ATP’nin
enerjisi, başı yeniden siklusa hazır hale getirmek için kullanılır. Böylece çapraz köprü
bir diğer kasılma siklusu için hazırdır. Miyozin çapraz köprüsü fosforile kaldığı sürece
çapraz köprü siklusu devam eder. Çapraz köprü siklusu miyoplazmik Ca+2
konsantrasyonu azalıncaya kadar her siklus için bir ATP’nin hidroliziyle devam eder
Ca+2 konsantrasyonundaki azalmayla birlikte MHZK inaktif duruma geçer ve
çapraz köprüler, miyozin fosfataz enzimi tarafından defosforile edilir ve kasılma durur
(7).
3.2. Miyometriyum
Fetüsün içinde yaşam bulduğu bir ortam olan uterus, tunika seroza
(perimetriyum), tunika muskularis (miyometriyum) ve tunika mukoza (endometriyum)
olarak adlandırılan üç tabakadan meydana gelmiştir. Perimetriyumu periton oluşturur.
Miyometriyum, uterus duvarının en kalın katmanını meydana getirir. Buradaki düz kas
hücreleri iç tarafta sirküler yönlü, dış tarafta ise longitudinal seyirlidir. Endometriyum,
düz bir örtü şeklinde dış tarafındaki kas tabakasına yapışık durumdadır (7, 34, 35).
Miyometriyum spontan fazik kasılma üretebilen bir düz kastır. Miyometriyal
kasılmalar nöral ya da hormonal bir uyarı olmaksızın gerçekleşebilen miyojenik
özelliktedir (36). Gebelik boyunca miyometriyal aktivite, zayıf koordine olmayan
kasılmalar (Braxton-Hicks kasılmaları) ile karakterizedir. Gebeliğin sonunda
miyometriyum doğum ve kasılmalar için uyarılara hazırdır (37, 38). Bu uyaranlar lokal,
maternal, mekanik veya fetal kaynaklı olabilir (39). Doğum sırasındaki koordineli
uterus kasılmalarının gelişmesi, uyarılmaya hazır durumdaki miyometriyumda yüksek
frekans ve genlikteki kontraksiyonlarla ortaya çıkar (7, 39, 40).
3.2.1. Miyometriyumda Uyarılabilirlik ve Kasılma
Miyometriyumda Ca+2 konsantrasyonu kasılma ve uyarılmada önemli rol oynar.
Miyometriyal hücrelerin sitozolünde serbest Ca+2 düşük (<10-7 M), hücre dışı sıvıda ve
SR’de yüksek konsantrasyonda (10-3 M) bulunmaktadır. Đstirahatteki serbest Ca+2
düzeyi kasılma esnasında ekstraselüler Ca+2’nın hücre içine girişiyle veya hücre içindeki
Kalsiyumun miyometriyal hücrelere girişinde Ca+2 kanalları önemli rol oynar.
Miyometriyal zarda iki tip Ca2+ kanalı tespit edilmiştir. Bunlar membran voltaj aktiveli
(43, 44) ve hücreye ligand indüklemeli Ca2+ girişine izin veren reseptör aktiveli Ca2+ kanallarıdır (45, 46).
Đnsan miyometriyumunda düşük voltajla aktivasyon gösteren geçici (T-tip) (47,
48) ve yüksek voltajla aktive olan uzun süreli (L-tip) kanallar (49, 50, 51, 52) olmak
üzere voltajla aktive olan Ca+2 kanallarının 2 tipi bulunmuştur. T tip Ca+2 kanal mRNA
ekspresyonu insan miyometriyumunda gösterilmiştir (53). Đnsan ve sıçanlarda kasılma
için gerekli olan Ca+2 akışının en büyük kaynağı L-tipi kanallardır (27, 48, 54, 55). T-tip
kanallar ise spontan Ca+2 geçişini sağlarlar ve kasılmanın frekans ve genliğini artırırlar
(56).
Kalsiyum iyonları miyometriyal hücre yüzey membranından PMCA ve Na+/Ca+2
pompası aracılığıyla hücre dışına atılır. Na+ ve Ca+2 gradiyentleri birlikte, Na+/Ca+2
pompası yoluyla Ca+2 akışını yönlendirerek membran voltajını ayarlarlar. Değiştiriciler
hücre içine 3 Na+ girişini ve hücreden 1 Ca+2 çıkışını sağlarlar. Ca+2 pompalarının Ca+2’a
olan eğilimleri Na+/Ca+2 değiştiricilerden çok daha yüksektir ki bu da Ca+2 pompalarının
Ca+2 çıkışında baskın mekanizma olduğunu gösterir (57, 58). Bununla birlikte gebe
sıçanlarda değiştiricilerle Ca+2’nın transferi Ca+2 konsantrasyonunu % 60 azaltırken,
Ca+2 pompalarıyla bu oran sadece % 30’dur (44).
3.2.1.1. Miyometriyumda Sarkoplazmik Retikulum
Kalsiyumun SR’den salıverilmesi SR membranındaki reseptöre bağlanan IP3’ün
artışıyla başlar. Bu durum oksitosin gibi agonistlerin G protein aracılı reseptörlere
bağlanması ile gerçekleşir. Salıverilen Ca+2 miktarını, IP3, intraselüler Ca+2 ve SR’de
Miyometriyumda kalsiyumun SR’den salıverilmesindeki 2. mekanizma, SR
membranındaki riyanodin reseptör kanalları aracılığıyla Ca+2 indüklemeli Ca+2
salıverilmesidir (46, 57, 59).
Ca+2’nın SR’den salıverilmesinde diğer bir yol ise, SR’deki Ca+2 konsantrasyonu
ve intraselüller Ca+2 konsantrasyonu arasındaki Ca+2 gradiyenti nedeniyle meydana
gelen pasif akıştır (61).
Miyometriyal SR’de Ca+2 depolanması, Ca+2 gradiyentine karşı çalışan SR’deki
SERCA yoluyla olur. Bu mekanizma intraselüler Ca+2 konsantrasyonunu düşürür (46,
57).
SR’den Ca+2‘nın spontan olarak salıverilmesi olarak bilinen Ca+2 kıvılcımları
(62) Ca+2-kapılı K+ kanallarını aktive edip hiperpolarizasyona yol açarak (63) Ca+2
-bağımlı Cl- kanallarının aktivasyonuyla depolarizasyona sebep olur veya diğer sinyal
yolaklarının aktivasyonuyla membran uyarılabilirliğini etkiler (32, 64). Bununla
birlikte, gebe olmayan sıçanlarda Ca+2 kıvılcımları gözlenmemiştir (65). SR’den
Ca+2’nın çıkışı, intraselüler alana Ca+2 girişine yol açar. Bu mekanizma doğum sırasında
uyarılabilmeyi artırır (46, 66).
SERCA pompaları ve riyanodin reseptörleri hücre içinde santral ve periferik
olmak üzere iki ayrı alanda bulunur. Miyometriyal SR; yüzey membranına yakın olan
periferal ya da yüzeysel SR ve hücre merkezine yakın olan santral veya derin SR olmak
üzere iki kısma ayrılır (61). Düz kaslardaki bu alanlar arasında fonksiyonel yönden de
farklılıklar gözlemlenmiştir (67). Yüzeysel SR, depolarizasyon sırasında hücreye Ca+2
girişini sağlarken, derin SR ise kasılma için Ca+2 sağlar. Bu fonksiyonel ayrım insan ve
Kaveol yapıları, lipit yığınları olarak da bilinen yüzey membranındaki
invajinasyonlardır ve periferal SR’ye yakın yerleşimlidir. Ca+2 -kapılı K+ kanalları ve
Na+-Ca+2 değiştiricilerin her ikisi de kaveol içinde bulunurlar ve periferal SR, sitozolden
daha fazla farklı Ca+2 ve Na+ konsantrasyonuna sahip sinyalleşme bölgesidir (57, 61,
66).
3.2.2. Miyometriyum Kasılmasının Elektrofizyolojik Özellikleri 3.2.2.1. Önder odaklar (Pacemaker):
Miyometriyum sinirsel ya da hormonal uyarı olmaksızın kasılabilen bir kastır.
Miyometriyumun spontan kasılmaları spontan bir şekilde depolarize olan ve aksiyon
potansiyelini ateşleyen önderodak hücrelerin depolarizasyonunu takiben başlar.
Önderodaklar anatomik olarak belirgin veya lokalizasyonları sabit değildir ve özelleşen
hücrelerdir (46, 57, 68). Sıçan miyometriyumunda miyozitlerin yaklaşık % 25’i yavaş
dalga veya zirve olmaksızın ortaya çıkan aksiyon potansiyeli şeklinde spontan
elektriksel aktivite gösterir (61). Bir başka çalışmada 18–19 günlük gebe farelerden elde
edilen miyometriyal hücrelerde spontan aktivite gözlenirken, 38–39 haftalık gebe insan
miyometriyumlarında benzer koşullarda spontan kasılma olmadığı belirlenmiştir.
Miyometriyum hücrelerindeki yarık bağlantıların hücrelerarası iletişimde oynadıkları
önemli rol miyometriyal kasılmaların uterin sessizlik dönemindeki zayıf ve senkronize
olmayan halinden doğumdaki güçlü senkronize kasılmalara geçişindeki etkileri yapılan
deneylerde gösterilmiştir (69, 70, 71, 72).
3.2.2.2. Karakteristik Aksiyon Potansiyelleri
Çeşitli türlerin miyometriyumlarında basit dikensi potansiyeller ve kompleks
potansiyeller olmak üzere iki tane belirgin aksiyon potansiyeli formu kaydedilmiştir.
oluşur. L tipi Ca+2 kanalları aracılığıyla yayılan Ca+2 akımı depolarize fazın en büyük
bölümünü oluşturur. Na+ akımının içeri girişiyle hızlı bir inaktivasyon meydana gelir.
Dikensi potansiyeller ‘burst’ olarak adlandırılan gruplarda oluşurlar ve burstlerdeki
artışların sayısı ve frekansı kasılma hızı ve amplitüdünü belirler (24, 57, 58, 73).
Kompleks aksiyon potansiyelleri, dikensi potansiyeli takiben sürekli bir
depolarizasyon platosundan oluşur. Bu devamlı depolarizasyon zayıf K+ ve güçlü Ca+2
iletkenliğinden kaynaklanır. Bu platonun uzunluğu kasılma süresini gösterir (58).
3.2.3. Miyometriyumda G Protein Sinyal Yolları
Miyometriyumda G proteinleri intraselüler sinyalleşmeyle ilişkili olup
miyometriyal kasılma ve gevşemenin düzenlenmesinde önemli rol oynar. Hücre içinde
Ca+2 artışıyla PLC, G protein bağlı plazma membran reseptörlerinin aktivasyonu sonucu
stimüle edilir. Bu mekanizma ayrıca kalsiyum kanalları aracılığıyla kalsiyum girişini de
uyarır. G proteinleri 7 transmembran bölgeye sahip olarak plazma zarındaki hücre
yüzeyi reseptörleri ve efektörleri ile kenetlenerek hücresel sinyal iletisinde önemli roller
üstlenirler. G proteinleri GTP’nin bağlandığı ve hidrolizlendiği bir α altbirim ile bir βγ
kompleksinden oluşmaktadır (74). α-altbirimi guanin nükleotit bağlama bölgesi ile
doğal GTPaz etkinliğinden sorumlu bölgeyi içerir ve ayrıca, G proteinlerinin reseptör ve
efektör ile etkileşimlerinin özgüllüğünü belirler. G proteinlerinin özgünlüğünü
tanımlayan α altbirimleri aminoasit dizilerinin benzerliğine göre Gαs, Gαi/o, Gαq/11 ve
Gα12/13 olmak üzere dört aileye ayrılmıştır ve etkileştikleri efektör moleküllerde
farklılıklar bulunmaktadır (75). Gαi/o ailesinin üyelerinden olan Gαi, adenilat siklazın
baskılanması ile cAMP derişiminde azalmaya neden olan G proteinidir ve Gαi1, Gαi2,
Gαi3 olmak üzere üç tipi bulunmaktadır. PLC’nin oluşturduğu IP3 ve DAG gibi ikinci
düzenlenmesinde iki farklı mekanizma vardır ve bu mekanizmalar boğmaca toksini
inhibisyonuna duyarlılıklarına göre ayırt edilir. PLC β izoformlarının hepsi G
proteinlerinden boğmaca toksinine duyarsız Gαq/11 ailesinin üyeleri ile uyarılabilir.
PLC β’nın boğmaca toksinine duyarlı düzenlenmesinin Gαi/o ailesinin boğmaca toksine
duyarlı üyelerinin βγ-altbirimleri aracılığı ile gerçekleştiği bilinmektedir. G proteinleri
inaktif durumdayken α-altbirimi, βγ kompleksi ve GDP birbirine bağlıdır. Bu durumda
G proteini hücre dışı reseptörle ya da hücre içi efektör sistemleri ile etkileşim halinde
değildir. Bir sinyal molekülünün G protein kenetli reseptöre bağlanmasıyla reseptör
uyarılır. Uyarılan reseptör, α altbiriminin guanin nükleotit bağlama bölgesinden
GDP’nin serbestlenmesine ve yerine GTP’nin bağlanmasına yol açar. GTP’nin
bağlanması, G proteininde yapısal değişikliğe neden olur ve GTP bağlı α altbirimi,
uyarılmış reseptörden ve βγ’den ayrılır. Sonra, hem α-altbirimi hem de βγ kompleksi
iyon kanalları ya da enzimler gibi efektörlerin aktivitesini düzenlerler (76, 77).
Đnsan miyometriyumunda çeşitli G proteinleri bulunmuştur. Gαs adenil siklaz
aktivitesini uyarır, Gα1-3 izoformları ve Gα0 adenil siklazı inhibe eder, Gαq ve Gα11 PLC
aktivitesini etkiler ve tüm bu proteinler gebe ve gebe olmayan miyometriyumlarda
gösterilmiştir (77, 78). Gα1,Gα3, Gαq,Gα11 proteinleri gebe ve gebe olmayan kadınlarda
benzer seviyelerde iken, gebelerde Gαi2 azalmış ve Gα0 artmıştır. Gαs ekspresyonunun
gebelerdeki büyük orandaki artışı Gαs‘ye bağlı adenil siklaz aktivitesinin artmasına yol
açar. Böylece gebelik boyunca intraselüler cAMP seviyesi artar ve bu da uterin
ŞEKĐL 1: G proteinlerinin özgünlüğünü tanımlayan α-altbirimleri amino asit
dizilerinin benzerliğine göre Gαs, Gαi/o, Gαq/11 ve Gα12/13 olmak üzere dört aileye
ayrılmıştır ve etkileştikleri efektör moleküllerde farklılıklar bulunmaktadır (75).
3.2.3.1. Miyometriyumda Fosfolipaz C
PLC, uygun ligandın membrandaki bulunan agonistlerin reseptöre bağlanması
sonucu G proteini aracılığıyla aktivasyon gösterir. Oksitosin, vazopressin, prostaglandin
F2 alfa (PGF2α) gibi birkaç hormon PLC yolağını kullanan spesifik reseptörlere
bağlanırlar. Uyarılmış reseptörün G proteinini stimülasyonu sırasında dissosasiye olan α
alt birim PLC’yi aktive etmektedir. Daha sonra bu enzim miyometriyum hücre
membranında bulunan fosfatidilinozitol bifosfatın iki ayrı ikinci haberci olan DAG ve
IP3’e parçalanmasını sağlar (45). IP3 sitozolden geçerek SR zarında bulunan IP3’e
duyarlı Ca2+ kanallarına bağlanarak Ca2+ salgılanmasına neden olur. DAG ise protein
kinaz C (PKC) enzimini aktive eder. PKC bazı proteinleri fosforilleyerek hücre
3.2.3.2. Miyometriyumda Adenilat Siklaz
Adenilat siklaz enzimi ATP’den cAMP oluşumunu indüklemektedir. cAMP,
etkisini inaktif protein kinaz A enzimini aktive ederek gösterir. Protein kinaz A, bir
hücresel protein olan MHZK’yı fosforile eder ve bu enzimin kalsiyum kalmodulin
kompleksine olan affinitesini azaltır (45). Böylece miyometriyal gevşemeye yol açar.
Aynı zamanda protein kinaz A, PLC’yi inhibe ederek kalsiyum girişini engeller ve
kalsiyum pompalarının aktivasyonunu inhibe ederek de düz kaslarda gevşemeye yol
açar (45).
3.2.4. Miyozin Hafif Zincir Fosforilasyonu, Kasılma ve Gevşeme
Miyometriyal düz kaslardaki kuvvet üretimi intraselüler Ca+2 konsantrasyonuyla
düzenlenir. Ca+2 konsantrasyonundaki artış Ca+2-kalmodulin kompleksinin
şekillenmesine ve miyozin hafif zincirlerin fosforile olarak aktomiyozin çapraz köprü
formasyonuna yol açar ve kasılma gerçekleşir. Đntraselüler Ca+2 konsantrasyonu
azaldığında, MHZK aktivasyonu durur ve miyozin hafif zincir fosfataz aracılığıyla
MHZ defosforile olarak gevşeme meydana gelir. MHZ’in defosforilasyonu miyozin
ATPaz’ın aktivasyonunu inhibe eder, böylece çapraz köprü siklusu bazal seviyesine
döner (46, 57).
3.3. Apelin
Apelin, orfan reseptör APJ’nin ilk endojen ligandı olarak tanımlanan 36
aminoasitten oluşmuş peptit yapılı bir hormondur (80). Orjinal olarak ilk defa sığır
midesinden izole edilmiştir (81). Bu peptide APJ-reseptör ligandı olmasından dolayı
‘apelin’ adı verilmiştir (80, 82).
Đnsanlarda apelin ekspresyonu ilk olarak kaudat nukleus, hipokampüs, talamus,
dorsomedial nükleuslar ve frontal kortekste belirlenmiştir (83). Daha sonraki
çalışmalarda, apelin mRNA, özellikle spinal kord, korpus kallozum, amigdala,
substansiya nigra, hipofiz bezinin yanısıra böbrekler, kalp, akciğerler, plasenta ve meme
bezleri gibi insan merkezi sinir sistemi ve birçok perifer dokularda gösterilmiştir (84,
85, 86).
3.3.1. Apelinin Biyokimyası ve Metabolizması
Đnsanlarda apelin geni kromozom Xq 25–26,1’de yerleşmiştir (83). Apelin, 77
aminoasitten oluşan bir öncül maddeden derive olmaktadır (87) ve apelin–
12,13,16,17,19 ve 36 gibi birkaç aktif peptit formlarına ayrılır (80, 82, 87). 23 tane
aminoasit bu öncül maddenin C uç kısmında lokalize olmuştur ve C uç kısmı türler
arasında büyük benzerlik göstermektedir (80).
Đlk bulunan apelin peptiti apelin-36 olsa da, daha sonraki çalışmalarda apelinin
daha kısa diğer formları da insan dokularında ve sığır kolostrumunda tespit edilmiştir
(80, 82, 88).
Apelin reseptörünün aktivasyonuna yol açan apelin peptitleri en az 12 C uç
kalıntısına sahiptirler (86, 89, 90). Son 12 C uç aminoasit formu en kısa aktif sıradır,
apelin-11 ve daha kısa peptitler inaktiftirler (90). Apelin 13, apelin reseptörü aktive
etme yeteneğine sahip en kısa aminoasit dizisine sahiptir. Apelin 12 ise çok daha fazla
aktiftir. Bu nedenle preproapelinin 65-77 son kısmı (C-uç) apelinin biyolojik aktivitesi
ve reseptöre bağlanması için büyük önem taşımaktadır (82, 91). Apelinin N uç kısmı ise
ligand reseptör etkileşiminde anahtar rol oynar (86). N uç kısmının aminoasit sırası
LVQPRGPRSGPGPWQGG şeklindedir ve bu diziliş bilinen protein ve peptitlerin
APELĐN-36 H2N- LVQPRGSRNGPGPWQGGRRKFRRQRPRLSHKGPMPF-COOH APELĐN-17 H2N-KFRRQRPRLSHKGPMPF-COOH PYR-APELĐN-13 HN-Pyr-RPRLSHKGPMPF-COOH APELĐN-13 H2N-QRPRLSHKGPMPF-COOH APELĐN-12 H2N-RPRLSHKGPMPF-COOH
TABLO:1 Đnsan apelinin biyoaktif formlarının aminoasit dizisi ve apelin-12 C terminal bölgesi (her bir peptit dizisinde koyu renkli olarak yazılmıştır). Pyr: piroglutamilat.
Apelin peptitlerinin biyolojik aktiviteleri peptit uzunluklarıyla ters orantılıdır.
Apelin-17 apelin-36’dan daha güçlü, apelin 13’den daha zayıf bir etkiye sahiptir (80).
Apelin-13 apelin-17’den 8 kat, apelin-36’dan 60 kat daha etkindir (80).
Apelin 13’ün piroglutamilat formu yapı olarak apelin-13’den daha stabildir ve
çoğunlukla apelinin kısa formu olarak piroglutamilat kullanılmaktadır (88). Bazı
çalışmalarda, apelin-13’ün reseptöre bağlanma eğiliminin apelin-36’dan daha fazla
ŞEKĐL 2: Apelin peptitlerinin sentez ve metabolizması. Biyolojik olarak aktif peptitler gri renkte gösterilmiştir. QC-glutaminil siklaz, ACE2-anjiyotensin dönüştürücü
enzim-2, P-glu-piroglutamilat, Phe-fenilalanin (93).
Apelin metabolizmasının bilinen tek yolu anjiyotensin dönüştürücü enzimdir
(94). Ancak son yıllarda apelin–13 ve apelin–36’nın C uç kısmından fenilalalini ayıran
bu enzimden başka çinko içerikli karboksipeptidaz enzimi de bulunmuştur (91).
Plazmadaki başlıca apelin peptitleri apelin–13 ve daha az olarak apelin-17’dir (93).
Sıçanlarda plazma apelin seviyesi 23 pmol/L iken (26), insanlarda ise 89.8 pq/ml
kadardır (95). Apelinin plazmadaki konsantrasyonu diğer dokulara göre oldukça azdır.
Bu da apelinin dolaşımda bir endokrin faktör olmasının yanında, nörotransmiter olarak
parakrin bir ekiye sahip olabileceğini göstermektedir (87).
3.3.2. Apelin Reseptörü
1992 yılında O’Dowd ve arkadaşları anjiyotensin tip 1 reseptör geniyle oldukça
büyük diziliş benzerliği gösteren bir gen keşfetmişlerdir (81). Bu yeni gen, APJ olarak
isimlendirilerek G protein bağlı reseptör olarak kodlanmıştır (81). APJ, Tatemoto ve
(apelin reseptörü, AR, anjiyotensin 1 benzeri reseptör) orjinal olarak insan genomik
DNA’sından polimeraz zincir reaksiyonu yoluyla izole edilmiştir (81). 380 aminoasitten
oluşan bu reseptörün geni 11. kromozomun q12.1 kısmında yerleşmiştir (81). Bu
reseptör için Đnsan Genom Örgütü APLNR sembolünü onaylamıştır. Bu reseptör,
AGTRL1, APJ, APJR ve FLJ90771 gibi birkaç isme de sahiptir (96). APJ fare, sıçan,
maymun, inek, zebra ve kurbağa gibi diğer birkaç türde de tanımlanmıştır (96).
APJ ekspresyonu, sıçanlarda hemen hemen tüm perifer dokularda gösterilmiştir
ancak kalp ve akciğerlerde en yüksek oranda bulunmuştur (82). Daha düşük seviyede
sıçan böbrek, hipofiz bezi ve iskelet kasında (97) ve ayrıca endokardiyal ve endotelyal
hücrelerde eksprese edilmektedir (86, 98, 99, 100). Sıçan beyninde özellikle
hipotalamusun supraoptik ve paraventriküler nükleuslarda, hipofiz ön lobunda, epifiz
bezi, olfaktor sistem nükleuslarında ve hipofiz ara lobda da ekspresyonu gösterilmiştir
(101). Đnsanlarda ise APJ mRNA; karaciğer, mide, pankreas, vasküler endotelyal ve düz
kas hücreleri, plasenta, adipoz doku, akciğerler, kalp, timus, prostat, testis, ovaryum,
dalak, barsaklar ve beyin olmak üzere birçok merkezi ve perifer dokularda bulunmuştur
(73, 83, 86, 97, 98, 99). Ayrıca büyük çaplı kan damarlarında otoradyografiyle apelin
bağlı bölümlerin varlığı belirlenmiştir (102). Beyinde APJ ekspresyonu, beyaz
maddenin glial hücrelerinde (103), serebral korteks, epifiz bezi, hipofiz bezi,
hipokampüs, piriform korteks, dentat girus, lateral olfaktor traktus nükleusları, dorsal
rafe nükleuslarında ve hipotalamusta (86, 99, 103) gösterilmekle birlikte beyindeki en
yoğun ekspresyon bölgeleri hipotalamustaki paraventriküler ve supraoptik nükleuslar
Fare apelin reseptörü 377 aminoasitten oluşmuştur ve insan apelin reseptörüyle
% 91 diziliş benzerliği vardır. Sıçan apelin reseptörü ise 377 aminoasitten oluşmuştur ve
insan reseptörüyle % 89 diziliş benzerliği vardır (96).
APJ ile Angiotensin II (AT2) reseptör arasında önemli yapısal benzerlik
(aminoasit dizilişi yönüyle % 30–40 benzerlik gösterir) olmasına rağmen AT2, APJ ile
etkileşime girmemektedir. Her iki reseptör arasında tüm aminoasit dizisinde 115
aminoasit (% 30) (104) ve transmembran bölgede 86 aminoasit (% 54) aynıdır (81),
aynı zamanda doku ekspresyonunda yüksek oranda benzerlik vardır (86). Bu
benzerliklere rağmen AT2, apelin reseptörüne bağlanmadığı gibi, apelin de AT1
reseptöre bağlanmamaktadır (83, 105).
3.3.3. Apelinin Fizyolojik Etkileri
Yeni bir hormon olmasına rağmen apelinin organ ve sistemler üzerindeki
etkilerini konu alan birçok çalışma gerçekleştirilmiştir. Peptidin etki alanları genel
olarak, metabolizma, kardiyovasküler sistem, hipotalamo-hipofizyal sistem ve üreme
sistemidir.
3.3.3.1. Gastrointestinal Sistem Üzerine Etkileri
Kemirgenlerin gastrointestinal traktuslarında apelin ve APJ bulunmuştur (106,
107, 108). Apelin ekspresyonu, en yüksek düzeyde mide fundusunda ve daha az olarak
barsaklarda gösterilmiştir. Duodenum ve kolona kıyasla ileumda daha yüksek miktarda
eksprese edilir (107).
Apelin in vitro ortamda, mide hücre proliferasyonunu artırır. Apelin–13
kemirgen intestinal dokudan kolesistokinin sekresyonunu stimüle eder (107). Apelin–13
ve APJ, gastrik entero-kromafin benzeri hücrelerde de eksprese edilir ve gastrik asit
3.3.3.2. Đmmün Sistem Üzerine Etkileri
APJ insan (HIV) ve maymun immün yetmezlik virüslerinin hedef hücre içine
girişinde bir koreseptör olarak işlev görmektedir (110, 111). Benzer şekilde APJ’nin,
HIV tarafından membrana tutunma ve hücreye giriş için kullanıldığı gösterilmiştir (99,
110, 112). Apelin peptitleri HIV’in APJ eksprese eden beyindeki NP-2/CD4 hücrelerine
girişini inhibe etmektedir (113, 114, 115). Apelin peptitlerinin bu inhibitör etkisi
moleküler büyüklükleriyle ilgilidir (113, 116). Apelin–36 en yüksek inhibitör etkiyi
gösterirken onu sırasıyla apelin-17, apelin-13 ve apelin-12 izlemektedir. Apelin
reseptörüne bağlanmayan apelin-11’in ise herhangi bir etkisi yoktur (58). Son olarak
HIV ile enfekte olmuş dokulardaki apelin ekspresyonu normal dokulara göre daha az
bulunmuştur (113).
Apelin immün sinyalleşmede etkilidir ve insanlarda hücre serilerinde T
hücrelerinin kolinerjik aktivitesini etkiler. Đn vitro, apelin-36 fare dalak hücrelerinde
CD3 aktivasyonuyla kısmen sitokin üretimini baskılayarak (88, 117) fare ovaryum
hücreleri üzerinde kemotaksik aktivite gösterir (82).
3.3.3.3. Besin Alımı Üzerine Etkileri
Apelin-13’ün piroglutamilat formunun intraserebrovasküler (ĐCV) uygulanması,
sadece aç hayvanlarda ve doz bağımlı olarak besin alımını anlamlı düzeyde artırır (118).
Bir başka çalışmada ise hormonun ĐCV uygulanması hem aç hem de tok hayvanlarda
besin alımını azaltmıştır (119). O’Shea ve arkadaşları apelin-13’ün ĐCV uygulandığında
gündüz besin alımını stimüle ettiğini gece ise baskıladığını göstermişlerdir (120).
Apelin 13 hem intravenöz (ĐV) hem de intraperitoneal uygulandığında besin
3.3.3.4. Apelinin Đnsülin ve Obeziteyle Đlişkisi
Apelin mRNA ve proteini insan ve fare yağdoku hücrelerinde bulunmuştur (122).
Büyük miktarda beyaz adipoz dokudan, daha az miktarda kahverengi adipoz dokudan
eksprese edilmektedir (122).
Đnsülin yağ dokuda apelin sentezini stimüle eder (122, 123, 124) ve plazma
apelin seviyesi hiperinsülinemi ve insülin direnciyle ilişkili olarak obezitede önemli
düzeyde artış gösterir (93). Plazma apelin konsantrasyonu obez farelerde zayıf farelere
göre 2–4 kat daha yüksektir (122, 123). Bununla birlikte, obez hayvan modellerinde
apelin ekspresyonundaki artışın en büyük belirleyicisi yağ dokudan çok insülin
seviyesidir (122). Hiperinsülinemik obez farelerde hem adipozitlerdeki apelin sentezi
hem de plazmada apelin seviyesi oldukça yükselmiştir (122).
Apelinin insülin sekresyonu üzerinde belirgin inhibe edici etkisi belirlenmiştir
(100). Đn vivo ve in vitro apelin–36, glikozla indüklenmiş insülin sekresyonunu stimüle
etmektedir (100).
Yağ dokudaki apelin ekspresyonu açlıkta güçlü bir şekilde inhibe olur ve
yemekten sonra plazma insülin ve apelin seviyesinin artmasına paralel yağ doku apelin
mRNA düzeyleri hızla normale döner (122).
Yağ dokudan apelin ekspresyonu yağ hücrelerinin hipertrofi derecesini yansıtır
(84). Apelin yağ dokunun damarlanmasına yol açar (125).
Apelin, yağ dokuda normal ve insülin dirençli kemirgenlerde glikoz kullanımını
artırarak plazma glikoz seviyesini düşürür (126). Obez ve insülin dirençli farelerde
apelin insülin duyarlı dokularda glikoz alımını artırır (126).
Plazma apelin seviyesi, tip 2 diyabetli hastalarda sağlıklı kontrol grubuna göre
bulgulara zıt sonuçlar elde edilmiştir (129). Apelinin bu hastalarda bazal ve glikoz
uygulandıktan 2 saat sonraki plazma seviyesi yükselmiştir ve glikoz toleransı da
azalmıştır (129). Ayrıca deneysel olarak diyabet oluşturulmuş farelerde apelin
ekspresyonu azalmıştır (122). Đnsülinin tersine, glikozun apelin sentezi üzerinde
herhangi bir etkisi yoktur (122, 124).
Apelinin, insan ve kemirgen pankreas dokularında baskın olarak alfa ve beta
hücrelerde ekspresyonu gösterilmekle beraber apelin pankreasta ve yağ dokuda
glikokortikoidlerce negatif yönde regüle edilir (124). Plazma apelini insanlarda vücut
kitle indeksiyle pozitif korelasyona sahiptir (130).
3.3.3.5. Apelinin Sıvı-Elektrolit Dengesi ve Hipotalamo-Hipofizeyal Eksenle Đlişkisi
Apelin ve APJ, hipotalamusta vazopressin ve oksitosinin sentezlendiği
supraoptik ve paraventriküler çekirdeklerde bol miktarda eksprese edilir (97, 101, 131,
132, 133). Normal hidrate sıçanlarda apelinin santral ve periferal uygulanması su
alımını artırmaktadır (83, 91, 118).
Đzole sıçan hipotalamik doku örneklerinde, apelin antidiüretik hormon
salınımını stimüle eder (118). Buna zıt olarak bir başka çalışmada, apelinin farelerde
ICV uygulandığında vazopressinerjik nöronların aktivitesini ve vazopressin salınımını
inhibe ettiği gösterilmiştir (132) diürezisi artırır (97, 134, 135) su alımına yol açarak dehidratasyonu azaltır (118, 132). Dehidratasyon, apelin (135) ve APJ (136)
ekspresyonunu artırır ve ADH ekspresyonunu azaltır (135).
Apelinin ĐCV uygulanması plazma adrenokortikotropik hormon ve kortizolü
artırır, prolaktin, follikül stimüle edici hormon (FSH), luteinizan hormon (LH) ve tiroid
yoktur. Đn vitro, apelin–13 hipotalamik doku örneklerinden kortikotropik hormon ve
arjinin vazopressin salınımını stimüle eder, fakat nöropeptit Y üzerinde herhangi bir
etkisi yoktur (118). Apelin-17’nin in vitro olarak perfüzyon sistemiyle ön hipofize
uygulanması bazal adrenokortikotropik hormon sekresyonunu anlamlı düzeyde artırır
(137).
3.3.3.6. Kardiyovasküler Etkileri
Apelin kardiyovasküler sistemde güçlü vazodilatatör ve pozitif inotropik etkiye
sahiptir. Apelinin güçlü doz bağımlı inotropik etkisi, sıçanlarda (138, 139, 140) ve
farelerde in vivo olarak gösterilmiştir (141, 142). Đn vitro çalışmalarda da apelinin güçlü
pozitif inotropik etkisi direk olarak sıçan (142, 143, 144) ve insan (145) kalp
dokusunda belirlenmiştir.
Apelinin inotropik etkisi PKC ve PLC aktivitesinin sonucudur. Đzole sıçan
kalbinde PLC’nin blokajı apelinin pozitif inotropik etkisini % 68 oranında azaltır.
Benzer sonuç PKC’nin blokajıyla da elde edilmiştir (142). PLC DAG yoluyla PKC’yi
aktive eder.
Apelin sıçan kardiyak miyozitlerde kalsiyum geçişinin amplitüdünü PKC’den
bağımsız olarak artırırken, SERCA ve Na+/Ca+2 pompasının aktivitesini PKC bağımlı
olarak artırır, ancak SERCA üzerindeki etkisi daha azdır. Böylece SERCA ile içeri
alınan kalsiyum miktarı pompa ile dışarı atılan kalsiyum miktarından daha az
olduğundan SR’deki Ca+2 içeriği azalır. Ayrıca apelin riyanodin reseptör aktivasyonunu
da artırarak daha fazla kalsiyum salıverilmesini sağlar ve bu etki ise PKC’den
bağımsızdır (146). Na+/Ca+2 ve Na+/H+ pompaları, PKC, PLC apelinin pozitif inotropik
Apelinin pozitif inotropik etkisinin hızlı bir artışla geçici olduğunu gösteren
çalışmaların (144) yanısıra yavaş bir şekilde artarak sürekli bir inotropik cevaba yol
açtığını gösteren çalışmalar da mevcuttur (139, 142, 147).
Kemirgenlerde eksojen apelin uygulaması nitrik oksit (NO) bağımlı
mekanizmayla hızlı bir şekilde kan basıncında ve ortalama kapiller basınçta düşüşe yol
açar, güçlü vazodilatör ve venodilatör etki gösterir (83, 91, 132, 148, 149, 150, 151, 152,
153).
Apelinin periferal uygulanmasına zıt olarak ĐCV uygulanması uyanık sıçanlarda
ortalama arteryel basınçta doz bağımlı artışa yol açar (152). Apelinin kan basıncının
düzenlenmesindeki santral etkisi, periferal etkisinden daha büyüktür (152, 154).
Apelin in vitro, insan safen vende (102, 105) ve mamarian arterde (145) vasküler
düz kas üzerine direk etkiyle vazokonstriksiyona sebep olur.
Apelin ve APJ’nin insanlarda kalp yetmezliğinin patofizyolojisinde rolü vardır
(95, 104) ve NO bağımlı mekanizma yoluyla kardiyovasküler hastalıklarda koruyucu
etki gösterebilir (140, 150, 155, 156, 157).
Apelin-APJ ekseni, kalbin kasılma gücünü artırarak başlangıçta kompansatuar
olarak işlev görerek erken dönemde sentezi artar (104, 138, 139, 158), fakat daha sonra
kalp yetmezliğinin son döneminde sentezi azalmaya başlar (104, 159, 160, 161).
3.3.3.7. Apelin ve Solunum Sistemi
Apelin solunum fizyolojisinde önemli bir role sahiptir. Sıçan akciğerlerinde
yüksek miktarlarda apelin ve APJ mRNA ekspresyonu gösterilmiştir (82, 87).
Apelin-13’ün traktus solitaryusa mikroenjeksiyonu apneyle sonuçlanmıştır (154). Plazma
apelini kronik parankimal akciğer hastalığında azalmıştır (162). Kronik hipoksik
konsantrasyonu azalmıştır ancak pulmoner doku kitlesinin artması sonucu toplam
pulmoner apelin içeriği aynı kalmıştır (163).
Pulmoner apelin içeriği hipoksiyle değişmez ve plazma apelin seviyesiyle
aralarında bir korelasyon yoktur. Apelin normoksik sıçan arterinde vazokonstrüktör
tonusu düzenler ve bu etkisi hipokside görülmemiştir (163).
3.3.3.8. Apelinin Düz Kaslar Üzerine Etkisi
Apelin ve APJ, düz kas hücrelerinde eksprese edilir (85, 89, 102). Apelin in vitro
ve in vivo, düz kas hücrelerinde doz bağımlı olarak MHZ’in fosforilasyonuna yol açar
(164). Apelin, sıçan miyozitlerinde Ca+2 geçişinin amplitüdünü artırır ve elektriksel
stimülasyon boyunca SR’deki Ca+2 içeriğini azaltır. Apelinin bu etkisi üzerinde
PKC’nin önemli bir katkısı vardır. SR’deki kalsiyum içeriğinin azalması PKC bağımlı
mekanizmayla olurken, Ca+2 geçişinin artması ise PKC’den bağımsızdır (147).
Sıçan torasik aortadan izole edilen vasküler düz kaslarda apelin, PI3K (fosfatidil
inositol 3 kinaz)/Akt-ERK1/2 sinyal yolaklarını aktive ederek hücre proliferasyonunu
doz ve zaman bağımlı olarak stimüle eder. Apelin APJ’ye bağlandığında PI3K’nın
fosforilasyonuna yol açar o da Akt (hücre proliferasyonu, migrasyonu ve apoptoza karşı
koruma için gerekli bir enzim) ve onun sinyal molekülü olan ERK1/2’ yi (ekstraselüler
sinyal düzenleyici protein kinaz) aktive eder, siklin D1 sentezlenir ve bu döngü hücre
proliferasyonuna yol açar (165, 166). Bir başka çalışmada apelin fare osteoblastik
hücrelerde JNK (hücre proliferasyonunda ve apopitozda önemli rolü olan bir enzim) ve
PI3-K/Akt yolağını kullanarak proliferasyonu stimüle ettiği ve apopitozu baskıladığı
gösterilmiştir (131).
Apelin, insan umbilikal arter düz kas hücrelerinde yapılan çalışmada serum
etkisini PI3-K/Akt sinyal yolakları aracılığıyla APJ reseptörlerini kullanarak
gerçekleştirir. Apelin bu yolakları aktive ederek hücresel gelişimin devamını sağlar
(167). Apelinin, aynı yolağı kullanarak insan osteoblast hücrelerinde de apoptozu
baskıladığı gösterilmiştir (167).
3.3.3.9. Apelinin Diğer Etkileri
Đnsan umbilikal ven endotel hücrelerinde embriyonik formasyon sırasında apelin
reseptörlerinin ekspresyonu gözlemlenmiştir (98). Apelin, ERK ve Akt fosforilasyonuna
yol açar ve in vitro bu endotel hücrelerin proliferasyonunu sağlar. Apelin gözde vitröze
enjekte edildiğinde retinal vasküler ağdaki endotel hücreleri artırır (168).
Apelin osteoblastlarda eksprese edilerek bu hücrelerde proliferasyonu stimüle
eder (167, 169). Nöronlarda apopitozu inhibe eder (170).
3.3.3.10. Üreme Sistemi ve Apelin
Sığır over folliküllerinde granüloza hücrelerinin farklı gelişim safhalarında
apelin mRNA ekspresyonu bulunmamakla birlikte APJ ekspresyonu, östrojen-inaktif
dominant folliküllerin granüloza hücrelerinde diğer folliküllere kıyasla anlamlı düzeyde
artmıştır. Apelin mRNA östrojen-inaktif dominant folliküllerin teka hücrelerinde
diğerlerine kıyasla anlamlı düzeyde artış gösterir. APJ mRNA ekspresyonu ise
preovulator folliküllerin teka hücrelerinde küçük folliküllere göre artmıştır (171, 172).
FSH, in vitro kültür granüloza hücrelerinde APJ ekspresyonunu inhibe eder. LH,
teka hücrelerinde apelin ve APJ mRNA ekspresyonunu stimüle eder. Progesteron,
granüloza hücrelerinde APJ ekspresyonunu stimüle eder (172).
Apelin ve APJ’nin intraluteal arterlerin düz kaslarında lokalizasyonu
gösterilmiştir. Apelin mRNA erken (1–7 gün) ve orta (8-12 gün) luteal safhalarda
olarak hamilelik dönemindekinden daha fazladır (171). APJ mRNA ise, erken luteal
fazda artar, en yüksek seviyesine orta luteal fazda ulaşır (171). Luteal fazın sonunda
APJ ve apelin düşmeye başlar ve KL’nin gerilemesiyle aşırı bir düşüş gösterirler (171).
Apelin, vasküler endotelyal büyüme faktörü ve fibroblast büyüme faktörü gibi
anjiyojenik faktörlerle birlikte KL’de anjiyojenik etki gösterir (174). Bu etkiyle
kapillerin proliferasyonunu sağlar, preovulator follikülün seçiminde rol alır, besin ve
öncül maddelerin artmasına yol açar ve böylece dominant follikülün büyümesini sağlar
(171).
Sığır KL’sinde PGF2α luteolize yol açar ve apelin ve APJ ekspresyonunu artırır.
Ayrıca bu etki sadece orta KL’de 0,5–2 saat içinde görülür. PGF2α’nin apelin ve APJ
ekspresyonunu 0,5–2 saat süresince artırması, luteal kan akımındaki artış zamanıyla
tamamen uyumludur. PGF2α enjeksiyonundan 4 saat sonra vazokonstriksiyona bağlı
olarak luteal kan akışında bariz bir düşüş meydana gelir, apelin ve APJ ekspresyonu da
aynı şekilde azalır (175).
Apelin-APJ sistemi sığır KL’sinin düz kas hücrelerinde lokalizedir ve
eNOS-NO sistemi yoluyla etkisini gösterir. Apelin düz kas hücrelerinde Ca+2 miktarını artırır,
eNOS kalmoduline Ca+2 bağımlı olarak bağlanır kısa süre içinde NO sekrete edilir (175).
NO üretimiyle vazodilatasyon meydana gelir, sonrasında kan basıncı düşer böylece
apelin eNOS-NO sinyal yolaklarının modülasyonuyla luteal kan akışı üzerinde
düzenleyici rol oynar (173).
Apelin insan plasentasında 1. ve 3. trimesterde bulunmuştur (176). Normal
plasentada apelin ekspresyonu plasental villuslarda, sitotrofoblast ve
sityotrofoblastlarda gebeliğin 1. trimesterinden 3. Trimesterine kadarki dönemde azalış
sitotrofoblastların sitoplazmalarında artar. Buna zıt olarak, preeklampsili gebelerde
(106), plasental villuslardaki endotelyal hücrelerde kısmi artışla beraber, tüm plasental
bölümlerde hem apelin hem de APJ ekspresyonu çok güçlü bir şekilde artmıştır (176).
Apelin–36 ve apelin mRNA hipertansif gebelerde normal gebelere kıyasla daha
düşük bulunmuştur (177). Gestasyonel diyabetes mellitusu ve normal glikoz toleransı
olan gebelerde subkutanöz adipoz doku, visseral adipoz doku ve plasental dokularda
apelin ve APJ ekspresyonunda anlamlı bir fark yoktur (64).
Maternal apelin konsantrasyonu normal sıçanlarda gebeliğin son haftasında
yaklaşık olarak % 50 oranında düşüş gösterir. Bunun sebebi fetoplasental dokunun
eliminasyonunun artışıdır (178).
Đnsanlarda maternal apelin konsantrasyonu, fetal, 1 günlük ve 4 günlük
neonatallerdeki düzeyiyle kıyaslandığında anlamlı düzeyde daha düşük bulunmuştur.
Fetal 1 günlük apelin konsantrasyonu ise 4 günlük konsantrasyonuna göre düşüktür.
Umbilikal plazma örneğinde apelin konsantrasyonunun belirgin derecede yüksek olması
apelinin intrauterin gelişimdeki rolünü düşündürmektedir. Doğum sonrası 1. gün
dolaşımdaki apelinin hızlı bir şekilde düşmesi plasentanın ayrılmasının sonucudur. 4.
gündeki artışı ise ölü uterusta giderek artan anjiyogenezden kaynaklanmaktadır. Ayrıca
apelin konsantrasyonu ile doğum ağırlığı, cinsiyet ve doğum sayısı arasında herhangi
bir ilişki bulunamamıştır (179).
Apelin mRNA çeşitli dokularda tespit edilmekle beraber en yüksek düzeydeki
ekspresyonu gebe sıçanların meme bezlerinde bulunmuştur (88). Emziren sıçanların
meme bezlerinde de apelin yüksek oranda eksprese edilir (88). Hamilelik boyunca
meme bezlerinin gelişimine paralel olarak apelin mRNA düzeyi giderek artar,
da meme bezlerinde apelin düzeyi hala yüksektir ve 21 gün içinde seviyesi giderek
düşerek bazal düzeye iner (88). Apelin sığır, sıçan ve insan sütünde bulunmuştur (88).
Sığır kolostrumunda apelinin büyük miktarlarda (14–93 pmol/ml) sekresyonu
gösterilmiştir (88). Ayrıca laktasyondaki sıçan sütündeki apelin peptit içeriği ~ 300-600
ng/ml gibi oldukça büyük miktarda bulunmuştur (107). Bu bulgulara rağmen apelinin
gebelik ve doğum süreçlerindeki rolü belirsizdir. Uterus kontrksiyonları üzerinde
apelinin nasıl bir etkiye sahip olduğu bilinmemektedir.
Amaç: Bu tez çalışmasında apelinin in vitro sıçan uterus şeritlerindeki kontraksiyonlar üzerindeki olası etkisinin araştırılması amaçlanmıştır.
4. GEREÇ VE YÖNTEM 4.1. Deney Hayvanlarının Bakım ve Beslenmeleri
Çalışmada Fırat Üniversitesi Deneysel Araştırmalar Merkezi’nden temin edilen,
200-250 g ağırlığında 12 adet Wistar cinsi intak dişi sıçan kullanıldı.
Sıçanlar 12 saat aydınlık, 12 saat karanlık ortamda, 210C oda sıcaklığında,
plastik kafeslerde tutuldu. Cam şişelerdeki çeşme suyuyla ve Elazığ Yem Fabrikası’nda
hazırlanan pelet halindeki özel sıçan yemleriyle beslendi (Tablo 2).
Buğday 150 Mısır 100 Arpa 270 Kepek 80 Soya 294 Balık Unu 80 Tuz 6 *Kavimix VM 23-Z 2 Methionin 2 **DCP 16 *1 gramında: 4800 IU A, 960 IU D3, 12 mg E, 0.8 mg K3, 0.8 mg B1, 2.4 mg B2,
1.2 mg B6, 0.006 mg B12 vitaminleri, 16 mg Nikotin amid, 3.2 mg Cal. D. Panth.,
0.32 mg Folik asid, 0.02 mg D-Biotin, 50 mg Cholin Chloride, 20 mg Zinc Bacitracin, 32 mg Mn, 16 mg Fe, 24 mg Zn, 2 mg Cu, 0.8 mg I, 0.2 mg Co, 0.06 mg Se, 4 mg Antioksidan ve 200 mg Ca.
**% 18 fosfor, %25 kalsiyum, %0.2 flor’dan oluşur.
4.2. Deney Hayvanlarının Hazırlanması
Sıçanlardaki cinsel döngü 4–5 gün sürmekte ve 4 ayrı periyotta sınıflanmaktadır:
proöstrus, östrus, metöstrus ve diöstrus. Proöstrus 12–14 saat, östrus 25–27 saat,
metöstrus 6–8 saat ve diöstrus 55–57 saat sürmektedir.
Deneylerin hazırlık aşamasında sıçanların östrus siklusları günlük olarak sabah
08.00–09.00 saatleri arasında vajinal simirle takip edildi. Sıçanlardan alınan simir
örnekleri mikroskop altında incelenerek diöstrus dönemindeki hayvanlar tespit edildi ve
sadece diöstrus grubundaki hayvanlar çalışma için kullanıldı.
4.3. Krebs Solusyonu
Krebs çözeltisi in vivo ortamdaki fizyolojik şartları in vitro ortamda da belli
ölçülerde sağlayan bir çözeltidir. Đçeriği itibariyle uterus düz kas hücrelerinin
kasılabilirlik özelliklerini optimal düzeyde in vitro olarak sürdürebilmelerine imkan
sağlamaktadır.
Krebs içeriği mM/L olarak aşağıdaki konsantrasyonlarda hazırlanmış olup pH’ı
7.4’e ayarlanmıştır: NaCl : 118 KCl : 4,7 MgSO 4 : 1,2 Glikoz : 11,5 CaCl 2 : 2,4 KH 2PO4 : 1,18 NaHCO 3 : 15,8 EDTA : 0,016
4.4. Đzole Organ Banyosu
Çift çeperli yapıya sahip olan izole organ banyosu sistemi (MAY IOBS 99),
stant, depo, amplifikatör, hazneler, termostatlı dolaşım pompası, O2-CO2 karışım tüpü
(HABAŞ), kayıt ünitesi ile sıvı ve gaz taşıma aparatlarından oluşmaktadır.
Termostatlı dolaşım pompası, içerisinde bulunan distile suyu istenen sıcaklığa
ayarlayarak izole organ banyosunun çift çeperli bütün bölümlerinde sirküle ederek
ısınmasını sağlayan bir cihazdır. Mevcut sistemde cihaz 370C sıcaklığa ayarlanmıştır.
Deneylerde 5 ml hacimde 2 adet hazne kullanılmıştır. Hazneler de tüm sistem
gibi çift çeperli yapıdadır ve haznelerin dış çeperinde termosirkülatörde ısıtılmış distile
su sirküle olmaktadır. Đç çeperde ise Krebs çözeltisi yer alır. Miyometriyum şeritlerinin
yerleştirildiği iç çeperde bütün deneysel uygulamalar gerçekleştirilmektedir. Bütün
deney boyunca haznenin alt bölgesindeki girişten % 95 O2ve % 5 CO2 karışımıyla
haznedeki Krebs çözeltisi sürekli olarak gazlandırılmıştır.
Đzometrik güç dönüştürücü, haznelerdeki düz kas şeritlerinde oluşan izometrik
kasılmalardan kaynaklanan fiziksel kuvvetleri algılayarak, bunları elektriksel sinyallere
çevirmektedir. Bu sinyaller eşzamanlı olarak amplifikatöre ulaşır. Amplifiye edilen
elektriksel sinyaller orijinal trasedekilerle uyumlu frekans ve genlik parametreleri olarak
kayıt ünitesine iletilmektedir.
Veri kayıt ve analiz sistemi bilgisayar ve yazılım programından oluşmaktadır.
Kayıt ünitesinde, organ banyosundaki kas şeritlerinin kasılmalarının oluşturduğu genlik
ve frekans parametreleri eşzamanlı olarak kaydedilmektedir. Bu kayıtlar daha sonra
analiz edilerek, her bir kas şeridinde ilaç uygulamalarından önce ve sonraki sürelerde
4.5. Apelinin Hazırlanması
Çalışmada sentetik apelin 13 (Sigma Chem Com, St Louis, ABD) kullanıldı.
Hormonun 1 µg’lık flakonu içine Krebs çözeltisi eklendi ve vortekste karıştırılarak
çözdürüldü. Aynı işlem kalsiyumsuz Krebs çözeltisi kullanılarak diğer bir apelin
flakonunda tekrarlandı. Apelin çözeltileri küçük plastik ependorf tüplere ayrılarak organ
banyosuna uygulanana kadar -20 oC’de saklandı.
4.6. Deney Protokolü
Deneylerde diöstrus dönemindeki hayvanlardan elde edilen uterus şeritleri
kullanıldı. 12 hayvandan çıkarılan şeritlere 2 ayrı protokol şeklinde apelin uygulamaları
yapıldı. 1. protokolde normal Krebs çözeltisinde oluşan kasılmalar üzerindeki apelin
etkisi test edildi. 2. protokolde ise kalsiyumsuz Krebs çözeltisi kullanılarak apelin
uygulaması tekrarlandı.
Her iki protokol grubundaki hayvanlar hergün sabah aynı saatlerde dekapite
edildi (08:00-10.00). Dekapite edilen sıçanların karın bölgeleri açılarak uterusları hızlı
bir şekilde çıkarıldı. Uterus dokuları alınan örnekler, içerisinde Krebs çözeltisi bulunan
petri kaplarına alındı. Bu uteruslardan 1.2 cm uzunlukta, 2 mm genişlikte ve 1 mm
kalınlıkta küçük longitudinal miyometriyum kesitleri hazırlandı. Kesitler izole organ
banyosundaki cam hazneler içerisindeki düzeneğe 1 gr gerim uygulanarak yerleştirildi
ve izometrik kasılmalar kaydedildi. Bu gerim düzeyi bütün deney periyodunda sabit
olarak kaldı.
Birinci protokolde yaklaşık olarak yarım saatlik bir uyum periyodunu takiben
spontan kasılma gösteren miyometriyum kesitleri için, spontan kasılmalar azaldıktan
sonra 10 dk kontrol kayıtları yapıldı ve sonrasında organ banyosundaki konsantrasyonu
uygulandı. Đkinci protokolde ise miyometriyum kesitleri yerleştirildikten 30 dk sonra
ortam, Ca+2 bulunmayan Krebs çözeltisi ile değiştirildi ve hemen sonrasında spontan
kasılmaların tamamen bittiği gözlendi. 10 dk’lık kontrol kaydından sonra 10 µM apelin
tek doz olarak uygulandı ve sonraki 10 dk’lık süre de kaydedildi. Kasılmaların frekans
(10 dakikadaki kasılma sayısı) ve genlik (gr) parametreleri aritmetik ortalama (AO) ±
standart hata (SH) değerleri olarak belirlendi.
4.7. Đstatistiksel Metot
Bütün değerler; ortalama ± standard sapma (AO ± SS) olarak belirlendi. Đstatistiksel
analizler ve grafikler sırasıyla; SPSS 12.0 ve Sigma Plot 10.0 programları kullanılarak
yapıldı. Đstatistiksel değerlendirme tek yönlü varyans analizi kullanılarak hesaplandı.
Tek yönlü varyans analizinin Post-Hoc hesaplaması için de Tukey testi kullanıldı. Tüm
BULGULAR
4.3. Birinci Protokol Grubu Bulguları
Miyometriyum kesitleri Krebs solusyonu içeren organ banyosu haznesine
yerleştirildikten sonra, gerime bağlı olarak oluşan spontan kontraksiyonlar uzun bir süre
takip edildi. Olası etkisini belirlemek amacıyla 10 µM konsantrasyon oluşturacak
şekilde deneme amaçlı olarak hazneye apelin uygulandı. Uygulamayı takiben
kasılmaların frekans ve genliğinde belirgin artış ortaya çıktı. Bu uygulama aynı şartlarda
tekrarlandı ve aynı sonuç gözlendi. Bu bulgular sonucunda apelinin uterus kasılmaları
üzerinde uyarıcı etkiye sahip olduğu görüldü. Apelinin etki ettiği konsantrasyonu
belirlemek için hormon, 0.01 µM, 0.1 µM, 1 µM ve 10 µM konsantrasyonlarda
kümülatif olarak uygulandı. Uygulamalardan önce kasılma frekansının 1-2 kasılmaya
kadar azalması beklendi. 10 dk’lık kontrol kayıtlarından sonra apelin dozları hazneye
eklendi (Resim 1).
Kontrol grubunda kontraksiyonların frekansı 1.14±0.14 (n=6) olarak belirlendi.
Apelin uygulandıktan sonra frekans değerleri sırasıyla 1.00±0.07 (n=6), 1.00±0.08
(n=6), 2.57±0.30 ve 4.14±0.70 (n=6) olarak hesaplandı. 1 µM ve 10 µM
konsantrasyonlarda uygulanan apelinin kontraksiyonların frekansını anlamlı düzeyde
artırdığı (p<0.05 ve p<0.001), diğer 2 dozun ise frekans üzerinde etkili olmadığı görüldü
(Grafik 1).
Kontraksiyonların genlikleri kontrol grubunda 1.47±0.05 (n=6) şeklindeydi.
Apelinin kümülatif olarak uygulanmasından sonraki genlik değerleri ise sırasıyla
1.45±0.06 (n=6), 1.50±0.05 (n=6), 1.73±0.06 (n=6) ve 1.91±0.10 (n=6) olarak
ortaya çıktı (p<0.01). Diğer konsantrasyonlardaki apelin uygulaması istatistiksel olarak
belirgin bir artışa yol açmadı (Grafik 2).
Resim 1: 1. Protokol grubuna örnek olarak 5. uterus şeriti orijinal trase: Spontan miyometriyum kasılmaları üzerinde 0.01 µM, 0.1 µM, 1µM ve 10 µM konsantrasyonlarda apelinin etkisi.
F re k a n s 0 1 2 3 4 5 6 Kontrol 0.01 0.1 1 10
*
**
Grafik 1: Apelinin 1. Protokol Grubunda Kasılma Frekansı Üzerindeki Etkileri. * p<0.05, ** p<0.001 (Tek Yönlü Varyans Analizi Post Hoc Tukey Testi).
G e n li k ( g r) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Kontrol 0.01 0.1 1 10
*
Grafik 2: Apelinin 1. Protokol Grubunda Kasılma Genliği Üzerindeki Etkileri. * p<0.05. (Tek Yönlü Varyans Analizi Post Hoc Tukey Testi).
5.2. Đkinci Protokol Grubu Bulguları
Đkinci protokolde düzenli spontan kasılmalar devam ederken organ banyosu
içeriği Ca+2’suz Krebs çözeltisi ile değiştirildi ve kasılmaların hemen durduğu gözlendi.
10 dk sonra apelin 10 µM konsantrasyonda uygulandı ve meydana gelen değişiklikler
kaydedildi (Resim 2). 10 µM dozda apelin uygulanması sonucu bütün şeritlerde 1
Resim 2: 2. Protokol grubuna örnek olarak 2. uterus şeriti orijinal trase: Kalsiyumsuz
5. TARTIŞMA VE SONUÇ
Apelin 1998 yılında sığır midesinden izole edilerek APJ’nin endojen ligandı
olarak bulunmuştur (80) ve biyolojik etkilerini APJ aracılığıyla göstermektedir (150,
167). Apelinin APJ’ye bağlandığında cAMP formasyonunu inhibe ettiği ve hücre
proliferasyonunda ve apopitozda önemli role sahip bir enzim olan mitojen aktiveli
protein kinaz ve fosfatidilinozitol 3 kinaz yolaklarını aktive ettiği gösterilmiştir (104,
134, 168, 180, 181). Apelin insan embriyonik böbrek hücrelerinde ERK1/2’ yi APJ’nin
Gi2 proteine bağlanmasıyla aktive eder. Apelin etkili ERK1/2 aktivasyonu Gβγ alt ünitesi
aracılığıyla olmayıp PKC bağımlıdır (182). Apelin hamster ovaryum hücrelerinde
forskolinle uyarılmış cAMP üretimini pertussis toksin duyarlı G proteini aracılığıyla
inhibe etmektedir (180). Aynı hücrelerde apelin G proteinin α alt birimi aracılığıyla Ras
bağımsız olarak ERK’yi (183), P70S6 kinazı ise ERK bağımlı ve fosfatidilinozitol 3
kinaz Akt bağımlı olarak 2 tane sinyal iletim kaskadı aracılığıyla aktive ettiği
belirlenmiştir (181). Benzer etki insan umbilikal ven endotelyal hücrelerinde de
gösterilmiştir (181). P70S6, protein sentezini artırarak endotelyal hücre
proliferasyonunda rol oynar (178, 184). Bu bilgiler APJ’nin büyük oranda inhibitör Gi/o
proteinine bağlandığını göstermektedir (88, 185).
Apelin ve reseptörünün ağırlıklı olarak kalp, akciğerler, yağ doku ve meme
bezleri olmak üzere birçok dokuda ekspresyonu gösterilmiştir (82, 84, 87, 88, 122).
Đnsanlarda plasenta, over ve uterus dokularında da apelin ekspresyonu tespit edilmiştir
(176). Bu da üreme sisteminin, hormon için muhtemel bir etki alanı oluşturduğunu
