GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
TARIMSAL ATIKLARDAN ENZİMATİK YOLLA KSİLOOLİGOSAKKARİT ÜRETİMİ
Şeyda BOSTANCI
TOKAT 2009
iv
ÖZET ... i
ABSTRACT ... ii
ÖNSÖZ ... iii
SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ ... vii
ŞEKİLLER DİZİNİ ... viii
ÇİZELGELER DİZİNİ ...ix
1. GİRİŞ ... 1
2. KAYNAK ÖZETLERİ ... 3
2.1. Türkiye’de Üretilen Tarımsal Atıklar ... 3
2.2. Lignoselülozik Materyaller ve Özellikleri ... 4
2.2.1. Selüloz ... 6
2.2.2. Lignin ... 7
2.2.3. Hemiselüloz ... 9
2.2.3.1. Hemiselülozun kaynağına göre yapısı ... 10
2.2.3.2. Hemiselülozun eldesi ve uygulanan ön işlemler ... 12
2.2.3.3. Hemiselülozu parçalayan enzimler ve bunların üreticileri ... 13
2.2.3.4. Hemiselülozun ve parçalanma ürünlerinin kullanım alanları ... 15
2.2.4. Ksilooligosakkaritler ... .17
2.2.4.1. Ksilooligosakkaritlerin sağlık açısından önemleri ... 18
2.2.4.2. Ksilooligosakkaritlerin fiziksel özellikleri ve kullanım alanları ... 19
2.2.4.3. Ksilooligosakkaritlerin elde edilme yöntemleri ... 21
2.2.4.3.1. Otohidroliz ... 21
2.2.4.3.2. Enzimatik hidroliz ... 22
2.2.4.3.3. Asit hidroliz ... 24
2.2.4.4. Ksilanazlar ... 25
v 3.2.1. Atıkların Karakterizasyonu ... 29 3.2.1.1. Nem ... 29 3.2.1.2. Kül ... 30 3.2.1.3. Lignin ... 30 3.2.1.4. Selüloz ... 31 3.2.1.5. Ksilan ... 31 3.2.1.6. Çözünürlükler ... 32 3.2.1.6.1. Soğuk suda çözünürlük ... 32 3.2.1.6.2. Sıcak suda çözünürlük ... 32 3.2.1.6.3. Alkol-benzen çözünürlük ... 32 3.2.1.6.4. Diklorometanda Çözünürlük ... 33
3.2.2. Atık Ksilanın Karakterizasyonu ... 33
3.2.2.1. Üronik asit ... 33
3.2.2.2. Şeker kompozisyonu ... 34
3.2.3. Ksilanın Büyük Ölçekte Özütlenmesi ... 35
3.2.4. Ksilanların Enzimle Hidrolizasyonu ... 35
3.2.4.1. Bradford metodu ile enzimin protein miktarını belirleme ... 35
3.2.4.2. Ksilanaz aktivitesi ... 35 3.2.4.3. Enzimatik hidrolizasyon ... 36 3.2.5. İndirgen Şeker ... 36 3.2.6. TLC ... 36 3.2.7. İstatiksel Analiz ... 37 4. BULGULAR ve TARTIŞMA ... 38 4.1. Atıkların Karakterizasyonu ... 38
4.2. Atık Ksilanın Karakterizasyonu ... 41
4.3. Ksilanın Özütlenmesi ... 43
4.4. Ksilanın Enzimle Hidrolizasyonu ... 43
4.4.1. Enzimin Ksilanaz Aktivitesi ... 43
vi 4.4.6. Süre ve Hidrolizasyon ... 50 5. SONUÇ ... 53 KAYNAKLAR ... 54 EKLER ... 62 EK 1 ... 63 EK 2 ... 65 EK 3 ... 66 EK 4 ... 67 ÖZGEÇMİŞ ... 68
i
TARIMSAL ATIKLARDAN ENZİMATİK YOLLA KSİLOOLİGOSAKKARİT ÜRETİMİ
Şeyda BOSTANCI
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı
Danışman : Yrd. Doç. Dr. Özlem AKPINAR
Ksilooligosakkaritler (KOler), ksiloz içeren oligosakkaritlerdir ve genellikle tarımsal atıklardan alkali ortamda izole edilen ksilanın hidrolizasyonu ile elde edilirler. Bu çalışmada tarımsal atıklardan ayçiçeği, buğday, pamuk ve tütün sapları ksilooligosakkarit üretimi için kullanılmıştır. Öncelikle atıkların nem, kül, selüloz, lignin, ksilan içerikleri ve farklı çözgenlerde çözünebilirlikleri belirlenmiştir. İncelenen atıkların nem içerikleri %4-6, kül içerikleri %3-7, selüloz içerikleri %32-44, ksilan içerikleri %19-29, soğuk suda çözünürlükleri %4-9, sıcak suda çözünürlükleri %7-12, diklorometanda çözünürlükleri %1-6, alkol-benzende çöüznürlükleri %1-6 arasında bulunmuştur. Ayçiçeği, buğday, pamuk ve tütün saplarından alkali ile elde edilen ksilanların %85-95 ksiloz, %3-15 glükoz ve %7-12 arasında üronik asit içerdikleri bulunmuştur. Ayrıca buğday saplarından elde edilen ksilanın bütün bunlara ek olarak %11 civarında arabinoz içerdiği belirlenmiştir. Elde edilen ksilanlar Trichoderma longibrachiatum ksilanazı ile hidrolize edilerek ksilooligosakkarit üretilmiştir. Ksilooligosakkarit verimi üzerine pH, sıcaklık, hidroliz periyodu, substrat konsantrasyonu ve enzim konsantrasyonunun etkisi incelenmiştir. Optimum hidroliz koşulları 4 U/mL enzim konsantrasyonu, 50˚C, 30 dakika, pH 4,6 ve %2 ksilan konsantrasyonu olarak belirlenmiştir. T. longibrachiatum ksilanazının diğer ksilanlara göre en iyi, dallı yapıdaki buğday arabinoksilanını hidrolize ettiği saptanmıştır. TLC analizi T. longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizlenen ksilanların hidroliz ürünlerinin farklı miktarlarda oligosakkaritler (X2, X3, X4, X5, X6 ve X7) ile monosakkaritlerden oluştuğunu göstermiştir. Çalışmada kullanılan bütün ksilanlar yapıdaki farklılıklara bakılmaksızın farklı polimerizasyon derecesine sahip KO üretmiştir.
2009, 68 sayfa
Anahtar Kelimeler: Ksilooligosakkaritler, ksilan, ayçiçek sapları, buğday sapları, pamuk sapları, tütün sapları
olu maktadır. laç sanayiinde, hayvan yemlerinde ve gıdalarda prebiyotik olarak kullanılmaktadır. Özellikle son yıllarda fonksiyonel gıdaların öneminin artması ile popüler bir gıda katkı maddesi olmu tur. Bunlar, sindirim sistemi tarafından parçalanmadı ı için genelde prebiyotik olarak da adlandırılmaktadır ve sa lık açısından da pek çok yararları vardır (Erdo an ve Akpınar, 2008).
KOler, sindirilemeyen oligosakkaritler olarak sınıflandırılmaktadır. Bunlar, ksiloz monomerleri arasındaki ba ın konfigürasyonunda olmasından dolayı insan sindirim enzimleri (amilaz, -glikozidaz, maltaz, sükraz) tarafından hidrolizasyona dayanıklıdır. Sindirim sistemi tarafından hidrolize ve absorbe edilmedi inden ba ırsakta ya ayan bakterilere substrat olarak hizmet ederler. Ba ırsak mikroflorasını daha sa lıklı bir kompozisyona do ru de i tirirler. Kolesterol seviyesini dü ürebilme ve kalsiyumun kullanılabilirli ini arttırma gibi özelliklere sahiptir. Aynı zamanda kısmen tatlı, pH ve sıcaklık de i imlerine kar ı stabil, su tutma kapasitesi yüksek bir üründür ve gıdaların donma noktasını de i tirebilme gibi etkiye sahip fonksiyonel birer oligosakkarittir (Voragen, 1998; Ebringerova ve ark., 2000; Roberfroid, 2000; Vazquez ve ark., 2000; Alonso ve ark., 2003; Moure ve ark., 2006; Erdo an ve Akpınar, 2008).
KOler do al olarak meyveler, sebzeler, bambu filizleri, bal ve sütte bulunmalarına kar ın, ekmek ve bira yapımında do al olarak üretilirler; ancak bu kaynaklardan elde edilmesi yüksek maliyetli ve dü ük verimli olmasından dolayı, ekonomik de ildir. Endüstriyel olarak ksilanca zengin lignoselülozik materyallerden üretilirler (Vazquez ve ark., 2000). Lignoselülozik do aya sahip olan tarımsal atıklar etanol, glikoz, ksiloz, ksilitol ve ksilooligosakkaritler gibi çe itli kimyasalların üretimi için, yenilenebilir bir kaynak olarak kullanılabilirler. Uygun bir lignoselülozik materyalden elde edilen ksilan; enzim, asit ve ısı ile hidroliz (otohidroliz) edilerek KOler üretilebilir (Erdo an ve Akpınar, 2008).
Ksilooligosakkaritlerin elde edilmesi oldukça zahmetli ve pahalıdır; ancak bunların yaygın olarak kullanılması, bunların ucuz bir kaynaktan toksik bile ikler olu umuna izin vermeden, verimli bir biçimde üretilmesine ba lıdır. Ksilanın asit ile hidrolizi esnasında KOlerin yanında furfural gibi istenmeyen bile iklerin de elde edilmesi söz konusudur. Isı ile hidroliz (otohidroliz) de ise KOler ksilan özütlenmesine ihtiyaç duymadan direkt olarak lignoselülozik materyallerden üretilmektedir; ancak bu yöntemde de hidroliz olayının daha ileri giderek furfural gibi istenmeyen maddeler olu turma riski vardır. Enzimle hidroliz daha spesifik ve ılımlı ko ullarda gerçekle ti i için ksilanın enzimatik hidrolizi asit ve ısı ile hidrolizine tercih edilmektedir. Enzimatik hidrolizde, korozif kimyasallara ihtiyaç duyulmadı ı gibi zararlı yan ürünler veya atıklar da olu mamaktadır. Ayrıca enzimatik hidrolizde, enerji ihtiyacı da daha dü üktür; ancak enzimatik yolla üretilen KOlerin polimerizasyon derecesi ve verimi kullanılan enzim kayna ına ve ksilan kayna ına ba lı olarak de i mektedir (Erdo an ve Akpınar, 2008). Türkiye’de yılda yakla ık 55 milyon ton tarımsal atık üretilmektedir (Anonim, 2007a). Üretilen bu atıklar, ço unlukla ya yakılmakta ya da tarlada çürümeye bırakılmaktadır. Bunlar hayvan yemi olarak de erlendirilebilir; fakat bu kullanım önemli bir ekonomik de ere sahip de ildir. Günümüzde artan çevresel endi eler, bu bol bulunan tarımsal atıkların çevreye dost teknolojilerle ortadan kaldırılmaları üzerine odaklanılmasına sebep olmu tur (Erdo an, 2007). Bu materyallerin de eri daha yüksek bir ürüne dönü türülmesi hem bu atıkların uygun bir ekilde ortadan kalkmasına sebep olacak, hem de çiftçiye ek bir gelir sunacak ve kırsal alanlarda i imkanı yaratacaktır. Laboratuvarımızda yapılan daha önceki çalı malarda, Aspergillus niger’den elde edilen ksilanaz ile tütün saplarının (Erdo an, 2007) ve pamuk saplarının (Akpinar ve ark., 2007), KO üretimi için kullanılabilir oldu u gösterilmi tir. Bu ara tırmada ise bu atıklar ve bunlara ek olarak bu day ve ayçiçe i saplarından Trichoderma longibrachiatum’dan elde edilen ksilanaz ile KO üretimi yapılmı tır. Ara tırma kapsamında, yukarıda adı geçen atıklardan elde edilen ksilanlardan üretilen KO profili ve verimi kar ıla tırılmı tır.
Tarımsal atıklar; bitkisel üretim, hayvansal üretim ve tarım ürünlerinin i lenmesi sonucunda açı a çıkan atıklardır. Yaygın bir ekilde bulunan bu atıklar, ta ıma ve i çilik maliyetleri nedenleri ile toplanıp de erlendirilememektedir. Tarlada kalan tarımsal atıklar (mısır sapı, yulaf sapı, eker kamı ı, pamuk sapı, mısır sapı, ayçiçe i sapı, saman ve tütün sapı vb.,) hayvan yemi veya yakacak olarak de erlendirilebilmekte; ancak bu kullanımların önemli bir ekonomik de eri yoktur (Öztürk ve Ba çetinçelik, 2006). Genellikle, atıklar ya tarlalarda çürümeye bırakılmakta ya da yakılmaktadır. Bu tip uygulamaların hem ekosistem, hem de insan sa lı ı için olumsuz etkileri vardır.
Türkiye’de üretilen tarımsal ürünlerden, yakla ık olarak yıllık toplam 50-65 milyon ton tarımsal atık olu maktadır. Tarımsal üretim ve olu an tarımsal atık verileri Çizelge 2.1’de verilmi tir (Öztürk ve Ba çetinçelik, 2006). Buna göre en fazla üretilen tarımsal ürünler sırası ile 22,4 milyon tonla bu day, 8,32 milyon tonla arpa, 2,29 milyon tonla pamuk, 2,20 milyon tonla mısırdır ve bunu ayçiçe i izlemektedir. Üretim miktarlarına ba lı olarak da Türkiye’de en fazla atık bırakan tarımsal ürünler bu day, arpa, pamuk, mısır ve ayçiçe idir.
Çalı mamızı yürüttü ümüz il olan Tokat’ta üretilen tarımsal ürünler ve olu an atık miktarları ise Çizelge 2.2’de verilmi tir (Anonim, 2007a; Erdo an, 2007). Buna göre en fazla üretilen tarımsal ürünler sırası ile 368 bin tonla bu day, 70,8 bin tonla arpa, 17 bin tonla mısır ve 5 bin tonla tütündür. Yine atık miktarı da üretilen ürün miktarlarına ba lı olarak en fazla bu day, mısır, arpa ve tütündedir. Bölgede ayçiçe i üretimi di er ürünlere göre fazla olmasa da atık bakımından tarımsal ürünler arasında be inci sıradadır.
Çizelge 2.1. Türkiye yıllık tarla ürünleri üretim ve atık miktarları (Öztürk ve Ba çetinçelik, 2006).
Ürünler Atıklar Üretim
(ton) Alan (ha) Toplam Atıklar (ton)
Bu day Saman 22 439 042 9 424 785 29 170 755 Arpa Saman 8 327 457 3 732 992 9 992 948 Çavdar Saman 253 243 145 907 405 188 Yulaf Saman 322 830 150 459 419 678 Mısır Sap 2 209 601 565 109 5 911 902 Pirinç Saman 331 563 59 879 582 555 Tütün Sap 181 382 222 691 362 763 Pamuk Sap 2 292 988 680 177 6 317 181 Ayçiçe i Sap 836 269 545 963 2 341 554
Çizelge 2.2. Tokat ili yıllık tarla ürünleri üretim ve atık miktarları (Anonim, 2007a; Erdo an, 2007).
Tarla Ürünleri Üretim (ton) Alan (ha) Toplam Atık (ton)
Bu day 368 061 146 825 478 479 Tütün 4 897 6 780 9 794 Ayçiçe i 982 518 2 749 Arpa 70 866 30 750 85 039 Çavdar 78 50 124 Yulaf 741 529 964 Mısır 17 019 4 390 34 038 Soya 8 3 15 Pirinç 1 780 321 3 127
2.2. Lignoselülozik Materyaller ve Özellikleri
Lignoselülozik materyaller (LM), çe itli tarımsal atıklar (sap, saman, kabuk gibi), her yıl yapraklarını döken a açlar ve i ne yapraklı (kozalaklı) a açlar, kentsel katı atıklar (ka ıt ve a aç ürünleri), ka ıt ve pulp endüstrisi atıkları ile otsu bitkilerden olu maktadır. Bu materyallerin kompozisyonları kayna ına göre de i mektedir; ancak
temel olarak selüloz (%35-50), hemiselüloz (%20-35) ve lignin (%10-25)’den olu ur. LM’nin di er bile enleri proteinler, ya lar ve küldür (Saha, 2003). ekil 2.1’de LM’nin yapısı gösterilmektedir. Hemiselülozun büyük bir ço unlu unu olu turan ksilan, kovalent ve kovalent olmayan ba larla hücre duvarının yapısal bütünlü ünde önemli rol oynamaktadır. Bitki hücre duvarında ksilan veya hemiselüloz, lignin ve selüloz arasındadır. Ksilanın önünde lignin bariyeri mevcuttur ve lignin ksilanın 4-O-metil-D-glikoronik asit birimlerine ester ba ları ile ba lıdır (Beg ve ark., 2001; Saha, 2003 ve 2005; Butt ve ark., 2008).
De erinin dü ük olması, bol bulunması ve kolay elde edilmesi sebepleri ile LM önemli bir biyokütle kayna ıdır ve geni ölçekte yakıt ve kimyasal üretiminde kullanım potansiyeline sahiptir (Yang ve ark., 2007).
2.2.1. Selüloz
Selüloz, yüksek bitkilerin hücre duvarının ana yapı ta ıdır. Sebzeler ve tahıl ürünleri gibi birçok lifli gıdanın kuru a ırlı ının %20-50’sini olu turur. Selüloz, bitki hücre duvarında hemiselüloz ve ligninle birlikte bulunur. Ana zinciri 10 000’den fazla -D-(1,4)- ba lı glikopiranozil birimlerini içerir ve düz bir zincir yapısına sahiptir. ekil 2.2’de selülozun kimyasal yapısından da görüldü ü gibi, selülozda fonsiyonel gruplar hidroksil (-OH) gruplarıdır. Bu -OH grupları birbirleri e veya O-, N-, S- grupları ile hidrojen ba ı olu tururlar (Ramirez, 2008). Selülozun molekül a ırlı ı, bitkinin yeti ti i yer ve bitki çe idine göre de i ir. Uzayan molekül, düz erit formundadır ve moleküller içi ve moleküller arası hidrojen ba ları ile birbirine ba lıdır. Do al selüloz, bütün bu düzenli kristal yapıyla beraber kristal olmayan (amorf) bölgelerden de olu mu tur. Amorf selülozun suyu hızlı bir ekilde absorbe etme yetene i vardır. Bu yetenek bitkiye yapısal dayanıklılık, esneklikte artı ve kırılmalara kar ı direnç sa lar. Selüloz, higroskopik (nem çekici) bir materyaldir, suda çözünmez fakat su, zayıf asit ve birçok çözücüde i ebilir (Shelton ve Lee, 2000).
ekil 2.2. Selülozun kimyasal yapısı.
Selüloz, birçok alanda kullanılmaktadır. Selülozdan termokatalitik i lemlerle elde edilen mikrokristal selüloz; farmakoloji, kozmetik ve gıda sanayiinde kullanılmaktadır. Mikrokristal selüloz, asit hidrolizi ile selülozun amorf bölgelerinin çıkartılması ile elde edilir. Toz formda dolgu maddesi, diyet amaçlı gıda ve tıbbi tabletlerde ba layıcı, jel
O H OH H H H H O H OH O O H OH H H H H O H O OH O H OH H H H H O H O OH O H OH H H H H O H O OH 1 4 1 4 1 4 1 4 OH O H OH H H H H O H OH O O H OH H H H H O H O OH O H OH H H H H O H O OH O H OH H H H H O H O OH 1 4 1 4 1 4 1 4 OH Se Glukoz
formda viskoziteyi düzenleyici, pasta ve krema gibi ürünlerde emülsifiye edici olarak kullanılmaktadır (Laka ve Chernyavskaya, 2007).
Selülozun türevlerinden en çok kullanılanı karboksimetil selüloz (CMC), anyonik, düz, suda çözünen bir polimer olup selülozun sırası ile NaOH ve sodyum monoklor asetat ile muamelesinden üretilir. CMC çözeltileri kararlı ve viskoz oldu undan gıdaların reolojik özelliklerini düzenlemede kullanılır (Shelton ve Lee, 2000).
nsan sindirim sisteminde selülozu parçalayan selülaz enzimleri bulunmaz fakat otçul hayvanlar i kembe mikrofloralarında selülozu parçalayarak de erlendirebilirler. Selülaz enzimi; mikroorganizmalar (bakteri ve küf gibi), bitkiler ve memeli olmayan hayvanlar tarafından üretilir. Selülaz enzim sistemi, selülozu glikoza hidrolize eder. Do ada selülazlar; endoselülazlar (endo-1,4-ß-D-glikan-4-glikanohidrolaz, EC 3.2.1.4), ekzoselülazlar (ekzo-1,4-ß-D-glikan-4-sellobiyohidrolaz, EC 3.2.1.91) ve β−glikozidazdan (ß-D-glikozit glikohidrolaz, EC 3.2.1.21) olu ur (Saha, 2005).
Endoselülazlar, glikoz birimleri arasındaki -1,4 glikozidik ba ı rastgele hidrolizleyerek farklı uzunluklarda oligosakkaritler olu tururlar. Ekzoglikanazlar, selülozu indirgen ve indirgenmeyen uçlarından ba layarak hidrolize ederler ve glikoz veya sellobiyoz olu tururlar. -glikozidazlar, sellobiyoz ve sellodekstrinleri glikoza hidrolize ederler (Saha, 2005). Selülazlar tekstil, gıda, ka ıt, hayvan yemi gibi çe itli alanlarda kullanılmaktadır (Doi ve ark., 2003). Clostridium, Cellulomanas, Bacillus,
Thermonospora gibi bakteriler ve Trichoderma, Fusarium, Humicola, Penicillium ve Schizophyllum gibi küfler selülaz enzimlerinin en etkili üreticileridirler. Selüloz, glikoza
hidrolize edilerek mikrobiyal veya kimyasal yöntemlerle etanol, bütanol ve organik asitler, aseton veya gliserol gibi çe itli ürünlere dönü türülebilir (Howard ve ark., 2003).
2.2.2. Lignin
Lignin, kompleks, hidrofobik, aromatik yapılı bir polimerdir. Bitki hücre duvarının ayrılmaz bir parçasıdır ve bitki hücre duvarında selüloz ve hemiselüloz karbonhidrat
matriksine gömülmü tür (Palonen, 2004). Lignin; bitkiye mekanik destek, çözgen iletimi ve mikrobiyal parçalanmalara kar ı direnç gibi özel fonksyonlar kazandırır. Lignin, 3 boyutlu, fenilpropan yapıda, p-kumaril, koniferil ve sinapil alkol birimlerinden olu mu kompleks yapılı bir a eklinde tanımlanır ( ekil 2.3) (Castro, 1994). Yumu ak odunsu bitkilerin yapısındaki lignin genelde koniferil alkolden olu urken, sert odunsu bitkilerin yapısındaki lignin ise e it miktarlarda koniferil ve sinapil alkolden olu mu tur (Hortling ve ark., 2004).
Polisakkaritlerin aksine lignin, hidrofobik (su sevmeyen) bir polimerdir. Bu özellik bu polimere farklı fiziksel ve kimyasal özellikler kazandırır. Lignin, kimyasal ve enzimatik parçalamalara kar ı do adaki en dirençli polimerlerden birisidir ve klasik olarak lignin, lignoselülozik materyallerin %72 (w/w) sülfürik asitte çözünmeyen kısmı olarak tanımlanır. Ligninin kompleks yapısında güçlü kovalent ba lar vardır, C-C ve eter ba ları lignini asit ve alkali hidrolitik olaylarına kar ı dirençli yapar. Bu ba , ılımlı oksidasyon, nitrobenzen oksidasyonu gibi i lemlerle kırılır. Aynı zamanda bitki hücre duvarındaki veya mikroorganizmalarla üretilen peroksidazlar ya da lakkazlar bu monomerleri okside ederek lignini parçalayabilirler (Castro, 1994). Lignin, dioksan gibi organik çözücülerde yava çözünür (Shelton ve Lee, 2000).
Selüloz ve hemiselülozun aksine lignin, fermentasyon prosesleri ile de erlendirilemez (Anonim, 2007b). Bununla beraber birçok alternatif kullanımı mevcuttur. Bu kullanımlara; kimyasal dönü üm ürünleri (vanilin, dimetilsülfit, fenoller, benzen türevleri gibi.), çe itli makromoleküler (dispersantlar, emülsiyon stabilizatörü, pıhtıla tırıcı ve çökeltici maddeler, vs.), karbonla tırma, pirolizle tirme (aktif karbon, karbon veya grafit lifleri ve köpükler), toprak ve gübre uygulamaları örnek gösterilebilir (Alma, 1999).
ekil 2.3. Ligninin ve biyosentezinde öncü alkollerin kimyasal yapısı (Castro, 1994).
2.2.3. Hemiselüloz
Hemiselüloz, tek ve çok yıllık bitkilerin toplam kütlesinin %20-30’nu olu turan, hücre duvarında selüloz ve ligninle beraber bulunan önemli bir heretojen polimerdir. Hemiselüloz, 5 C’lu pentoz ekerler (ksiloz, arabinoz gibi) ile 6 C’lu heksoz ekerler (mannoz, glikoz, galaktoz gibi ) ve eker asitlerinden olu mu heterojen bir polimerdir. Hemiselülozun ekerleri D-ksilopiranoz, D-glikopiranoz, D-galaktopiranoz, L-arabinofüranoz, D-mannopiranoz ve D- glikopiranosilüronik asit ile iz miktarlarda di er
yapısı -1,4 ba ı ile ba lı ekerlerden olu an hemiselüloz, -1,2, -1,3 ve -1,6 noktalarında dallanma gösterir. Hemiselülozlar, yapılarında bulunan ekerlere göre a a ıda verilen biçimlerde gruplandırılır (Sorenson ve ark., 1999).
• Ksilanlar ( -1,4-D-ksiloz iskeleti)
• Arabinoksilanlar ( -1,4-D-ksiloz iskeleti) • Glikoronoksilanlar ( -1,4-D-ksiloz iskeleti) • Mannanlar ( -1,4-D-mannoz iskeleti)
• Glikomannanlar ( -1,4-D-glikoz : -1,4-D-mannoz iskeleti) (1:3) • Galaktomannanlar ( -1,4-D-mannoz iskeleti)
• Galaktoglikomannanlar ( -1,4-D-glikoz : -1,4-D-mannoz iskeleti) (1:3) • Glikoronomannanlar ( -1,4-D-mannoz ve -1,2 –D-glikoronik asit iskeleti) • Arabinogalaktanlar ( -1,3)-( -1,6)-D-galaktoz iskeleti)
• -(1,3)-D-glikanlar
• -(1,3) - -(1,4)- D-glikanlar
Selülozun aksine hemiselüloz, kimyasal açıdan homojen de ildir. Selülozun polimerle me derecesi (DP) 2 500-10 000 iken hemiselülozun DPsi 70-200 arasında de i mektedir (Saha, 2003 ve 2005; Ebringerova ve ark., 2005).
2.2.3.1. Hemiselülozun kayna ına göre yapısı
Hemiselülozların yapısı lignoselülozik materyallerin kayna ına göre de i mektedir. Hemiselüloz, sert odunsu ve yumu ak odunsu yapılarda farklılık gösterir. Sert odun hemiselülozları genellikle 4-O-metil glikoronoksilan eklinde sınıflandırılmı yüksek asetille mi heteroksilandan olu urken yumu ak odun hemiselülozları glikomannan, galaktoglikomannan ve ksilana sahiptir. Yumu ak odun hemiselülozları (genellikle heksozanlar) asit hidrolize, sert odun hemiselülozlarından (genellikle pentozanlar) daha dirençlidir. Sert odun ksilanları asit hidrolize oldukça dayanıksızdırlar ve oldukça ılımlı ko ullar altında otohidrolize u rarlar (Ramos, 2003).
E
ekil 2.4. De i ik kaynaklardan elde edilen hemiselülozların yapısı. A: O-asetil-4-O-metilglikoronoksilan (sert odunsu bitkiler); B: Arabinoksilan (bu day kepe i); C: Arobinoksilan (çimen); D: Arabino-4-O-metilglikoronoksilan (yumu ak odunsu bitkiler); E: Galaktomannan (Keçiboynuzu gamı).
O O OH O AcO RO O OH O AcO O O O H O OAc O O H O OH OR O H O OH O H H3CO HOOC O O H OH CH2OH O O H OH CH2OH OH O OH O O H RO O OH O O H O O O H O O OR O O OH OH H3CO COOH O O H OH HC O OH OH H3CO COOH O O O H RO OH O OH O O H O O OH O O H O O O O O OR O H CH COOH2C H3CO OH O OH OH H3CO COOH O O H OH CH2OH O OH OH H3CO COOH O O O H RO OH O OH O O H O O OH O O H O O O O O OR O H A B C D O O OH O AcO RO O OH O AcO O O O H O OAc O O H O OH OR O H O OH O H H3CO HOOC O O H OH CH2OH O O H OH CH2OH OH O OH O O H RO O OH O O H O O O H O O OR O O OH OH H3CO COOH O O H OH HC O OH OH H3CO COOH O O O H RO OH O OH O O H O O OH O O H O O O O O OR O H CH COOH2C H3CO OH O OH OH H3CO COOH O O H OH CH2OH O OH OH H3CO COOH O O O H RO OH O OH O O H O O OH O O H O O O O O OR O H A B C D O OH O H O H OH O OH O O H OH O OH O O H O O OH O O H OH O OH O O H O OH
Birçok bitki materyalinin ksilanı 1,4 ba lı -D-ksilopiranoz birimlerinin homopolimerik iskelet zincirinden olu mu tur. Ksilozun yanında ksilanlar; arabinoz, glikoronik asit veya onun 4-O-metil eteri ile asetik, ferulik ve p-kumarik asitlerini içerir. Dallanma sıklı ı ve kompozisyonu ksilanın kayna ına ba lıdır. Bununla birlikte daha homojen ksilanlar, hasır otu, do al sakızlı bitki tohum kabu u ve tütün saplarında bulunmaktadır. Yumu ak odun heteroksilanlarında arabinofüranosil birimleri p-kumarik asitler ve ferulik asitlerle esterle mi tir. Sert odun ksilanlarında ise ksiloz birimlerinin %60-70’i asetille mi tir. Sert odun ksilanlarının (150-200) DPsi yumu ak odun ksilanlarından (70-130) daha yüksektir (Saha, 2003 ve 2005). ekil 2.4’de çe itli kaynaklarda bulunan hemiselülozların yapısı verilmi tir.
2.2.3.2. Hemiselülozun eldesi ve uygulanan ön i lemler
Lignoselülozik biyokütlenin kompozisyonu kayna ına göre çe itlilik göstermektedir. Bu materyallerin yapısı çok komplekstir (Saha, 2003). Hemiselüloz, hücre duvarında lignin ve selülozla beraber bulundu undan, lignoselülozik biyokütlenin de erlendirilebilmesi ve hemiselülozun elde edilmesi amacı ile bazı ön i lemlerin uygulanması gereklidir.
Ön i lemler; fiziksel veya kimyasal olabilir. Fiziksel i lemlerde genellikle materyalin boyutu de i ik ö ütme yöntemleri ile küçültülür; ancak bu i lem kompleks yapıda olan lignoselülozik materyaller için yeterli de ildir. Bunlar, kimyasal yöntemler gibi daha güçlü ön i lemlere ihtiyaç duyarlar. Kimyasal i lemlerde ise lignoselülozik materyaller; yüksek sıcaklık, seyreltik asit, alkali, organik çözgen, amonyak, kükürtdioksit, karbondioksit veya di er kimyasallarla muamele edilerek, materyal enzimlerin daha kolay hidroliz edebilece i duruma getirilir. Çizelge 2.3’te lignoselülozik biyokütleye uygulanan ön i lem metodları verilmi tir (Saha, 2003). Böylelikle lignoselülozik materyaller farklı ekillerde de erlendirilmeye hazır hale gelir (Jeffries ve Jin, 2000). Hemiselülozun pH stabilitesinden dolayı alkali ortamda lignoselülozik materyallerden özütlenmesi oldukça yaygın olarak kullanılan bir i lemdir. Bazı durumlarda hammadde,
lignin ya da pektik maddelerin uzakla tırılması için, okside edici ajanlar, tuzlar ya da alkollerle ön i leme tabi tutulabilir (Vazquez ve ark., 2000).
Lignoselülozik biyokütledeki hemiselülozun alkali özütlenmesi için NaOH, KOH, Ca(OH)2, NH3, H2O2 ya da bu bile iklerin karı ımı kullanılır (Yoon ve ark., 2006; Sun ve ark., 2002; Pellerin ve ark., 1991; Zilliox ve Debeire, 1998 ). En çok kullanılan ajanlar KOH ve NaOH çözeltileridir. Genellikle ksilan içeren hemiselülozun izolasyonunda KOH’ın kullanımı daha çok tercih edilmektedir; çünkü fazla alkalinin asetik asitle nötralizasyonu esnasında potasyum asetat formu etanolde daha iyi çözünmektedir. Buna kar ın NaOH çözeltisi, daha çok özütlenmesi daha zor olan mannoz içeren hemiselülozun özütlenmesinde kullanılmaktadır (Lai, 2000).
Çizelge 2.3. Lignoselülozik biyokütleye uygulanan ön i lem metodları (Saha, 2003).
Metot Örnek
Termo-Mekaniksel Ö ütme, kesme
Otohidroliz Su buharı, yüksek basınç
Asit uygulaması Sulu asit (H2SO4, HCI), konsantre asit (H2SO4, HCI)
Alkali uygulaması Sodyum hidroksit, amonyum, alkali hidrojen peroksit
Organik solvent uygulaması Metanol, etanol, bütanol, fenol
2.2.3.3. Hemiselülozu parçalayan enzimler ve bunların üreticileri
Hemiselülazlar, hemiselülozdaki glikozidik ba ları hidrolize ederler ve hidroliz etti i substrata göre isimlendirilirler. Hemiselülozun heterojen yapısına ra men selülozla kar ıla tırıldı ında hidrolizasyonu daha iyi bilinmektedir. Hemiselülozların parçalanmasında gerekli olan ana enzimler ksilanazlar ve mannanazlar gibi endoenzimlerdir. Endoksilanazlar ve endomannanazlar sırası ile ksilanların ve glikomannanların iç ba larını rastgele hidrolize ederek oligomerik ürünler meydana getirirler. Sonraki a amalarda bu ara ürünler bir takım ekzoenzimler ( ksilozidaz ve
mannozidaz) ve yan grup kırıcı enzimler ( arabinozidaz, galaktozidaz, -glikoronozidaz veya esterazlar gibi) ile monomerlere hidroliz edilirler (Harjunpaa, 1998). Farklı hemiselülazların ksilan ve galaktoglikomannan üzerine etkisinin ematik gösterimi ekil 2.5’te verilmi tir. lerideki bölümlerde ksilanazlar ve endoksilanazlar daha ayrıntılı bir ekilde açıklanmı tır.
ekil 2.5. Ksilan (A) ve galaktoglikomannan (B) üzerine farklı hemiselülazların etkisinin ematik gösterimi (Harjunpaa, 1998).
2.2.3.4. Hemiselülozun ve parçalanma ürünlerinin kullanım alanları
Hemiselülozun kimyasal yapısı, özelliklerini etkileyen en önemli faktördür. Hemiselülozlar; adsorbant, yapı tırıcı, jelle tirici ajan, emülsifiyer, kalınla tırıcı ve gıda katkısı olarak gıda, kozmetik veya ilaç endüstrisinde kullanılmaktadırlar. Ksilan türevlerinden karboksimetilksilanlar, ka ıdı astarlamada deterjan, yumakla tırıcı ve yapı tırıcı olarak kullanılır. Antitümoral ve lipolitik aktivitelerinden dolayı ksilan sülfat türevlerinin tıpta önemli uygulamaları bulunmaktadır. Di er kaynaklardan elde edilen hemiselülozlar da stabilizör olarak ilaçlarda veya gıda endüstrisinde (meyve suyu stabilitesinde) kullanılmaktadır. Glikomannanlar, gıda endüstrisinde (balık yumurtası substitüyesi) kullanılırken arabinogalaktanlar madencilikte (demir ve bakır cevherlerinin i lenmesi) veya ilaç endüstrisinde (tablet ba layıcı veya emülgatörü gibi) uygulama alanı bulurlar. Farklı hemiselülozlardan elde edilen jeller, kozmetik, ilaç ve foto rafçılık endüstrisinde uygulama bulmu lardır (Popa ve Spiridon, 1998).
Hemiselülozun parçalanma ürünleri de farklı kimyasalların üretiminde yaygın olarak kullanılmaktadır (Popa ve Spiridon, 1998). Bunlardan birisi de yakıt etanol üretimidir. Lignoselülozik maddelerden yakıt etanol üretiminde hemiselülozik ekerlerden yararlanılmaktadır. Ksilozu etanole fermente edebilme yetene indeki mayalar
Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis ve Candida shehate’dir. Hemiselülozun bir
di er önemli ekeri olan arabinozu ise sadece birkaç maya türü etanole fermente edebilir. Bazı bakteriler örne in Escherichia coli, Klebsiella, Erwinia, Lactobacillus,
Bacillus ve Clostridium hemiselülozda bulunan ekerleri fermente edebilirler; ancak
sınırlı miktarda etanol üretirler. Bu bakteriler genellikle hemiselülozdan daha çok asit (asetat, laktat, propiyonat, vb.,) ve çözgen (aseton, bütanol, 2,3-bütandiol, vb.,) üretmek amacıyla kullanılırlar (Saha, 2003; Bostancı ve ark., 2007).
Hemiselülozun parçalanma ürünlerinden üretilen 2,3-bütandiol, ba ka bir adla bilinen 2,3-bütilen glikol (2,3-BG) sıvı yakıt, çözücü, çe itli sentetik polimer ve reçinelerin ön maddesi olarak de erli bir kimyasaldır. 2 7200 J/g ısıtma de eri ile yakıt katkısı ve sıvı yakıt olarak kullanılan metanol (22 100 J/g) ve etanolle (29 100 J/g) kar ıla tırılınca daha avantajlıdır. 2,3-BG’nin dehidrasyon ürünü endüstriyel çözücü metil etil keton,
çok dü ük kaynama noktası nedeni ile yakıta daha çok uygundur. Daha ileri dehidrasyon ürünü olan 1,3-bütandien polimer endüstrisinin önemli bir monomeri ve sentetik kauçu un ba langıç maddesidir. 2,3-bütandiol katalitik dehidrojenasyonu ile olu turulan diasetil, yüksek de erli gıda katkı maddesidir. Çok farklı kimyasallar 2,3-BG’den kolayca hazırlanabilir. Endüstriyel ölçekte pulp, ka ıt ve gıda endüstrisi atıkları gibi çe itli zirai atıklardan 2,3-BG üretimi ile ilgili çalı malar yapılmaktadır (Saha, 2003; Bostancı ve ark., 2007).
Hemiselülozdan üretilen bir di er önemli madde de ksilitoldur. Ksilitol, 5 karbonlu eker alkolüdür, ço unlukla alkali ortamda ksilanın hidrolizasyonundan elde edilen ksilozun indirgenmesi ile üretilir. Ksilitol, birçok meyvede do al olarak bulunan bir tatlandırıcıdır. Do al olarak hu a acı, bö ürtlen, çilek, ye il salata, karnabahar, erik, fıstık, muz ve mantarda da bulunur ve insan vücudunda do al olarak 5-15 g/gün ksilitol üretilmektedir. Bitkilerden do rudan elde edilebilir; ancak ticari olarak hemiselülozdan üretilmektedir. Ksilitol, beyaz kristal eklinde olup nane gibi serinleten ho bir tadı vardır. Erime ısısı oldukça dü ük derecede oldu u için, ferahlık ve serinlik hissi verir ve herhangi bir alerjik etkisi yoktur; fakat fazla miktarda alınması ishale neden olabilir. Sükrozla benzer derecede tatlılı a sahiptir ve görünü ü ve tadı ekere benzemektedir. Ksilitol, a ızda fermente olmaz ve hayvan ve insan deneylerinde çürük önleyici oldu u görülmü tür. A ızdaki plak miktarını azalttı ı ortaya çıkmı tır. Minenin remineralizasyon sürecini uyarır ve floritle sinerjik etki göstererek a ız hijyeni ürünlerinin etkinli ini arttırır. Fermente edilebilen ekerlerin yerine tatlandırıcı kullanıldı ında çürük olu madı ı ve ekerlemelerde, sakızlarda, alkolsüz içeceklerde, çe itli ilaçlarda, pastillerde sükrozun yerine ksilitol kullanılmasının çürük riskini azaltıcı oldu u ifade edilmektedir. Alkolsüz içecekler, dondurma, sakız ve ekerlemeler gibi çe itli ürünlerde ksilitol kullanılmaktadır. Japonya, Finlandiya, skandinav ülkeleri ve Sovyetler Birli i’nde diyabetik ürünlerde, Almanya’daysa damar içi beslenme ürünlerinde sıklıkla kullanılmaktadır. Ksiloz, ksilitole kimyasal veya biyoteknolojik olarak dönü türülebilir. Kimyasal i lemlerde yüksek basınç (50 atm üstü) ve yüksek sıcaklık (80-140°C) kullanımı ve pahalı katalizörlere (Raney-Nikel) ihtiyaç duyulmasından dolayı biyoteknolojik olarak üretimi daha çok tercih edilmektedir. Biyoteknolojik olarak öncelikle hemiselüloz ksiloza parçalanır, daha sonra üretilen
ksiloz ksilitole fermente ettirilir. Birçok maya ve küf, ksiloz metabolizmasının ilk adımında ksilozun ksilitole indirgenmesini katalizleyen NADPH’a sahiptir (Biswas ve Vashistha, 1997; Bostancı ve ark., 2007).
Hemiselülozdan elde edilen ekerler, laktik asit üretiminde de kullanılabilinir. Laktik asit, her insanın vücudunda olu an do al organik bir bile iktir. Laktik asit, geçmi te ticari olarak büyük ölçüde ek imi sütten elde edilmekte idi, ancak bugün mikrobiyal fermentasyonla veya kimyasal sentezle üretilmektedir. Bu amaçla lignoselülozik maddeler; bol, ucuz ve yenilenebilir olduklarından laktik asit üretiminde tercih edilmektedir. Laktik asit; gıda, kozmetik, farmakoloji ve kimya endüstrisinde geni çapta kullanılmaktadır (Wee ve ark., 2006; Bostancı ve ark., 2007).
Hemiselüloz parçalanma ürünlerlerinin bir di er kullanım alanı, ferulik asit üretimidir. Ferulik asit, çe itli bitki hücre duvarlarında bulunan bir sinamik asittir. Sinamik asitler, kan damarlarını koruyucu ve antioksidan etkili fitokimyasal maddelerdir. Mısır lifi yakla ık %3 ferulik asit içerir. Bu day kepe i di er bir ferulik asit (%0,5-1) kayna ıdır (Saha, 2003; Bostancı ve ark., 2007).
Hemiselülozun bir di er önemli kullanım alanı ve bu tezin konusunu olu turan ksilooligosakkarit üretimidir. Endüstriyel olarak ksilanca zengin lignoselülozik maddelerden üretilirler. Bu konu ksilooligosakkaritler (KOler) bölümünde daha geni bir ekilde açıklanmı tır.
2.2.4. Ksilooligosakkaritler
KOler, ksiloz birimlerinin -1,4 glikozidik ba ı ile birle mesinden olu an ( ekil 2.6) ve daha çok ksilobiyoz, ksilotriyoz ve ksilotetroz içeren eker oligomerleridir (Hopkins ve ark., 1998). KOlerin polimerizasyon derecesi (DP) genellikle 2-10 arasında de i mektedir ve buna ba lı olarak da molekül a ırlıkları dü ük olmaktadır. KOler, sindirilemeyen oligosakkaritler sınıfına girdi i için sa lık üzerinde prebiyotik ve fonksiyonel gıda bile eni olarak kullanım alanlarına sahiptir. KOler do al olarak
meyveler, sebzeler, bal ve sütte bulunur. Endüstriyel olarak da ksilanca zengin lignoselülozik materyallerden elde edilen ksilanın uygun metodlarla parçalanması ile KOler üretilir (Roberfroid, 2000; Vazquez ve ark., 2000).
ekil 2.6. Ksilooligosakkaritlerin kimyasal yapısı (n=ksiloz ünitelerinin sayısı).
2.2.4.1. Ksilooligosakkaritlerin sa lık açısından önemleri
KOlerde ksiloz birimleri arasındaki ba -1,4 ba ı oldu u için, bu ba ı insan ve hayvan sindirim enzimleri parçalayamamaktadır. Sindirilemeyen bu oligosakkaritler, ba ırsakta ya ayan bifidobakteriler ve laktobasilluslar için substrat olarak hizmet ederek bu yararlı bakterilerin aktivitelerini ve üremelerini arttırır (Van Loo ve ark., 1999). nsan vücudunda sindirilememesi ve kolondaki bir veya sınırlı sayıdaki bakterilerin geli mesini ve/veya aktivitesini seçici olarak artırdıklarından dolayı, prebiyotik olarak adlandırılmaktadır (Gibson ve Roberfroid, 1995). Prebiyotikler, ince ba ırsaktan geçerken ince ba ırsak ve pankreatik enzimlerce sindirilmeden kalın ba ırsa a gelirler ve burada bifidobakteriler gibi yararlı bakteriler tarafından fermente olurlar. Fermantasyon sonucunda kısa zincirli ya asitleri (asetat, butirat, propiyonat gibi), hidrojen gazı ve CO2 olu ur. Açı a çıkan bu ya asitleri, ba ırsak pH’ını dü ürüp asidik ortam olu masını sa layarak, zararlı bakteri enzimlerinin çalı masını önler ve ba ırsak mukozasının fonksiyonunu artırarak, patojenik mikrofloranın buraya ba lanarak ço almasını engellemektedirler. Aynı zamanda bu bakteriler do al antimikrobiyal maddeler (nisin, bifidosin, laktasin gibi) salgılayarak Clostridium ssp., Bacteroides, E.
coli, Salmonella gibi hastalık yapıcı bakterilerin geli imini engeller (Fooks ve ark.,
1999). KOlerin fermantasyonu sonucu olu an gaz, kısa zincirli ya asitleri ve laktat sindirim sistemi hareketini etkilemekte ve dı kı atılımını kolayla tırarak kabızlı ı
O OH O H O H O O OH O H O OH OH O H O n-1
önlemektedirler (Van Loo ve ark., 1999). KOler, koroner kalp hastalı ına yol açan dü ük yo unluklu kolesterol (LDL) düzeyinin kanda azalmasına neden olur (Voragen, 1998). KOler, Ca ve Mg minerallerinin biyolojik kullanımını arttırarak çözünmeyen minerallerin çözünmesine yardımcı olur. Bu açıdan kemik erimesi yani osteoporoz hastalı ına da iyi gelir (Tungland ve Meyer, 2002). KOler, kan ekerini etkilemedi i için glisemiks (karbonhidratların kandaki glikoz seviyesi) de ildir. Bu sebeplerle diyabetik gıdalarda rahatlıkla kullanılabilir. A ızdaki sindirim enzimlerince de sindirilemedi inden di çürümelerine neden olmaz. Tatlandırıcı olarak ekerleme, içecekler, sakız, di macunu gibi ürünlerde kullanım alanı bulur (Roberfroid, 2000). KOlerin de kullanım miktarının belli bir dozu vardır. Fazla miktarlarda tüketilmesi a ırı gaz ve laksatif etkiye neden olur (Mancilla-Margalli ve Lopez, 2002). Japonya’da maksimum KO kullanım dozu 0,12 g/kg vücut a ırlı ıdır (Moure ve ark., 2006).
2.2.4.2. Ksilooligosakkaritlerin fiziksel özellikleri ve kullanım alanları
KOlerin tatlılık derecesi dü üktür, nem çekme özelli i donma noktasını ve camsı geçi özelli ini etkiler. Molekül a ırlıkları arttıkça viskoziteleri de artar. Bunun sonucunda a ızda dolgunluk hissine sebep olurlar. Dolgu maddesi ve aroma arttırıcı olarak gıdalarda kullanılır. KOler dü ük polimerle me derecesine (DP=2-10) ve dü ük molekül a ırlı a sahip oldukları için suda kolay çözünürler. Tatlılı ı sükrozun tatlılı ının %30-60’ı kadardır. KOlerde zincir uzunlu u arttıkça tatlılık azalmaktadır. pH stabiliteleri yapılarında yer alan ba ı nedeniyle di er ekerlere ( ba lı heksozlar gibi) göre daha iyidir. Ni asta su karı ımının bekletilmesi sırasında ni astanın çözünürlü ünü kaybedip kristal hale gelmesi eklinde tanımlanan ni asta retrogradosyonu so ukta hızlanmakta ve ekme in bayatlamasına neden olmaktadır bu olayı KOler engellemektedir (Voragen, 1998).
ekil 2.7’de KOlerin kullanım alanları verilmi tir. Birçok gıda uygulamalarının yanında gıda dı ı uygulamalarda da KOlere ihtiyaç duyulmaktadır. Fiziksel ve fizikokimyasal özellikleri sebebi ile gıda uygulamalarında takviye edilmi gıdalar, sinbiyotik gıdalar,
özel gıdalar (diyet) ve yeni geli tirilmi gıdalarda gıda bile eni olarak gıda dı ı uygulamalarda ise hayvan besleme, tarımsal uygulamalar, farmakoloji uygulamalarda KOler kullanılır (Vazquez ve ark., 2000).
Takviye Edilmi Gıdalar Gıda Uygulamaları Gıda Bile enleri Sinbiyotik Gıdalar
(canlı mikroorganizmalar ile)
Özel Gıdalar -Obeziteye Kar ı - ç Beslenme
Yeni Geli tirilen Gıdalar
(enzimatik sentez ile) Hayvan Besleme Uygulamaları
-Balıklar
-Evcil Hayvanlar Gıda Dı ı Uygulamalar
Tarımsal Uygulamalar
-Büyümeyi Uyarıcı ve Hızlandırıcı -Olgunla tırma Ajanı
-Verim Artırıcı Farmakoloji Uygulamaları -Mide-ba ırsak Enfeksiyonlarından Koruyucu Aktif Ajan Olarak
-Osteoperoz
-Deri ve Saç Bozuklukları -Kulak ltihabı
-Ka ıntı ve Cilt Hastalıkları ekil 2.7. KOlerin kullanım alanları (Vazquez ve ark., 2000).
2.2.4.3. Ksilooligosakkaritlerin elde edilme yöntemleri
KOler, ksilan içeren zengin lignoselülozik materyallerden üretilir. Ksilan, hemiselülozun ba lıca bile enidir (Kulkarni ve ark., 1999). Uygun bir LM’den elde edilen ksilan; otohidroliz, enzimatik ve asit hidroliz ile hidrolize edilerek KOler üretilir (Vazquez ve ark., 2000; Moure ve ark., 2006).
2.2.4.3.1. Otohidroliz
Otohidroliz, sadece lignoselülozik madde ve su kullanarak hemiselülozun hidrolitik depolimerize olması ile selüloz ve ligninden ayrılması i lemidir. LM, ısı ve basınç etkisi ile sulu ortamda hidrolize olur. Suyun otoiyonizasyonu ve LM’de bulunan üronik asit, asetik asit gibi asidik bile iklerin iyonizasyonundan olu an hidronyum iyonları hemiselülozu parçalayarak çözünür ekerlerine, eker parçalanma ürünlerine dönü türür. Otohidroliz likörü, KOler, di er eker oligomerleri, monosakkaritler, asetil ve üronik asit oligomerleri, serbest asetik asit, furfural ve di er bile enlerden olu ur (Parajo ve ark., 2004). Otohidroliz, 130-230°C’leri arasında lignoselülozik materyalin yapısına göre belirli bir sürede gerçekle ir. Hidrotermal proses sonucunda likörde yüksek konsantrasyonda istenmeyen eker dı ı bile enlere rastlanabilir. Bu nedenle KOlerin safla tırılması büyük önem ta ır. KOlerin safla tırılmasını basitle tirmek için otohidrolizden önce hammaddeye ön i lem yapılabilir. Örne in, otohidrolizden önce LM çözücü ile muamele edilerek hammaddeden istenmeyen maddeler uzakla tırılabilinir. E er belirlenen son moleküler a ırlık istenenden fazla ise enzimatik i lemlerle DP azaltılabilir (Vazquez ve ark., 2000; Moure ve ark., 2006; Erdo an ve Akpınar, 2008).
Buhar veya otohidroliz uygulamaları di er uygulamalara göre hidrolizasyon için sudan ba ka kimyasala ihtiyaç duymamasından dolayı, çevreye daha dost görünen bir teknolojidir (Alonso ve ark., 2003). Reaksiyonun tek a amada gerçekle mesi, korozyon sorununun ya anmaması, zararlı atıkların olu maması ve çevreye zararsız olması otohidrolizde belli ba lı avantajları olu tururken, heksoz ve pentoz ekerlerin yüksek
sıcaklıkla birlikte furfural gibi istenmeyen maddeler olu turabilmesi, hidrolizasyon liköründe KOler ile birlikte lignin ve selüloz parçalanma ürünlerinin bulunması, olu an KOlerin polimerizasyon derecesinin gıdalar için istenen büyüklükten yüksek olmasından dolayı ek i lem gerektirmesi dezavantajlarıdır (Garrote ve ark., 1999; Erdo an ve Akpınar, 2008).
Literatürde, Garrote ve ark. (2001 ve 2002) mısır koçanı, Kabel (2002) çe itli lignoselülozik atıklardan; Parajo ve ark. (2004) Eucalyptus globulus odunu, mısır koçanı, pirinç kepe i ve arpa kabu undan; Nabarlatz ve ark. (2005 ve 2007) ise badem kabu u, mısır koçanı, zeytin çekirde i, pirinç kabu u, bu day kepe i ve arpa kepe inden KO üretmi lerdir.
2.2.4.3.2. Enzimatik hidroliz
Ksilan içeren lignoselülozik materyallerden, do rudan enzimatik hidrolizle KOlerin üretimi sadece turunçgil kabukları gibi hassas materyaller için uygundur. Bu nedenle, KOlerin üretimi 2 a amada gerçekle ir; lignoselülozik biyokütleden ksilanın alkali özütlenmesi ve bunu takiben de ksilanın enzimatik hidrolizidir (Vazquez ve ark., 2000; Moure ve ark., 2006; Erdo an ve Akpınar, 2008). Genel olarak tarımsal atık saplarından enzimatik yolla KO üretim akı eması ekil 2.8’de verilmi tir.
Enzimle hidroliz di er yöntemlerle kar ıla tırıldı ında daha spesifiktir çünkü sıcaklık (40-50ºC) ve asitlik (pH 4,5-7) açısından daha ılımlı ko ullarda gerçekle ir. Bu yüzden ksilanın enzimatik hidrolizi asit ve ısı ile hidrolizine tercih edilmektedir. Enzimatik hidrolizde, korozif kimyasallara ihtiyaç duyulmadı ı gibi zararlı yan ürünler veya atıklar da olu mamaktadır. Ayrıca enerji ihtiyacı da daha dü üktür; ancak bu yöntemde hidroliz için gereken enzimlerin üretimi oldukça zahmetli, pahalı ve zaman alıcıdır (Vazquez ve ark., 2000; Moure ve ark., 2006; Erdo an ve Akpınar, 2008 ).
Ksilanazlar, ksilanın -1,4 ba ını hidrolizleyerek ksilanı ksiloza hidrolizleyen enzimlerdir. Ksilanın ksiloza tamamen hidrolizi için en az 3 tane enzime ihtiyaç
duyulur. Bu enzimler; endoksilanazlar, -ksilozidazlar ve esterazlardır. Ksilooligosakkarit (KO) üretiminin gerçekle mesi enzim kompleksinin endoksilanaz aktivitesine ba lıdır. KOlerin enzimatik olarak üretimleri ve ksiloz üretimini engellemek için enzim kompleksi dü ük ekzoksilanaz ve/veya -ksilozidaz aktivitesine sahip enzim kompleksleri istenir. Enzimatik hidroliz sonucu olu an KOlerin DPsi kullanılan enzimle de i ir. Bu sorun enzimatik hidrolizin en büyük dezavantajını olu turur (Sun ve ark., 2002; Erdo an ve Akpınar, 2008).
ekil 2.8. Tarımsal atık saplarından KO üretim akı eması.
Literatürde enzimatik hidroliz ile mısır koçanından (Playne ve Crittenden, 1996), yulaf ksilanından (Jaskari ve ark., 1998), KO üretmi lerdir. Silveira ve ark. (1999) farklı ksilanlar ve ka ıt pulpundan Trichoderma harzianum türlerinden (CNP 17) elde edilen
ksilanaz ile, Zhu ve ark. (2006) mısır koçanından enzimatik hidrolizle KO üretmi lerdir. Yang ve ark. (2007) Thermobifida fusca’dan elde edilen ksilanaz ile küspe, mısır koçanı, bu day kepe i ve yerfıstı ı kabu u ksilanından, Hussin ve ark. (2008)
Trichoderma viride’den elde edilen ksilanaz enzimi ile palmiye ksilanından KO
T arı msa l at ık sapı
Alka l i Eks tra ksi yo nu Se lü loz
Lig nin
Ta rı msa l At ık Sa pı Ksi la nı
K s ila na z Enz i ma ti k H id ro liz
üretmi lerdir. Bunların dı ında enzimatik hidrolizle lignoselülozik materyallerden Pellerin ve ark. (1991), Chen ve ark. (1997), Nishimura ve ark. (1998), Ai ve ark. (1991), Swennen ve ark. (2005), Yoon ve ark. (2006) sırası ile mısır koçanı, hu a acı, sert odunsular, badem kabuklarından ve Akpınar ve ark. (2007) pamuk saplarından KO üretmi lerdir.
2.2.4.3.3. Asit hidroliz
Ksilanın enzimatik hidrolizinin pek çok avantajları olmasına ra men, enzimatik hidrolizin bazı dezavantajları da vardır. Ksilan yapısındaki farklı eker grupları, asetil grupları ve dallanmalar enzimatik hidrolize kar ı direnç göstermekte ve üretilen ürünün DPsini kontrol etmek çok zordur (Sun ve ark., 2002). Enzimatik hidrolizde üretilen KOlerin DPsi, kullanılan enzime ba lıdır. Buna kar ılık asit ile hidroliz reaksiyonunda kullanılan asidin cinsinden ve ksilan yapısından ba ımsız olarak, ksiloz üniteleri arasındaki glikozidik ba ları rastgele hidroliz edilmektedir. Alternatif olarak, ksilan enzimle hidrolize edildi i gibi asitle de hidrolize edilebilir (Erdogan, 2007). Asit hidrolizde HCl, H2SO4 gibi asitler kullanılır; ancak uygulamalarda daha çok sülfürik asit tercih edilir. Fazla asidi nötürle tirmek amacıyla kullanılan CaCO3 ile H2SO4 birle ti inde suda çözünmeyen CaSO4 tuzu olu ur ve bu tuzun filtrasyonla uzakla tırılması daha kolay olmaktadır. Asit hidrolizi ile polimerle me derecesi 2-15 arasında olan ksilooligosakkaritler elde edilebilir, ancak önemli bir miktarda monosakkarit ve buna ba ımlı olarak birçok mikroorganizma için toksik etkili olan furfural gibi maddeler üretilebilir (Dominguez ve ark., 1996; Erdo an ve Akpınar, 2008).
Literatürde, Kimura ve Tajima (1998), Sun ve ark., (2002) ve Akpınar ve ark., (2009) lignoselülozik atıklardaki (pamuk sapı gibi) ksilandan asit hidrolizi ile ksilooligosakkarit üretmi lerdir.
2.2.4.4. Ksilanazlar
Ksilanı hidrolize eden enzimlere ksilanolitik enzimler denir. Ksilan, dallanmı heteropolisakkarittir. Homoksilanlar sadece ksiloz birimlerinden olu ur, yan zincirleri yoktur ve do ada yaygın de ildir (Wong ve ark., 1988; Ebringerova ve Heinze, 2000; Beg ve ark., 2001). Kompleks yapısından dolayı ksilanın tamamen hidrolizi için farklı enzimler gerekmektedir. Endoksilanazlar ( -1,4), -ksilozidaz, -L-arabinofüranozidaz, -glikoronozidaz, asetil ksilan esteraz ve fenolik asit esterazlar (ferulik asit ve p-kumarik asit) ksilanın ksiloza hidrolizasyonu için gerekli ksilanolitik enzimlerdir. ekil 2.9’da bu enzimlerin etki mekanizmaları gösterilmi tir. Endoksilanaz enzimi ( -1,4-endoksilanazların, 1,4- -D-ksilanksilanohidrolaz, EC 3.2.1.8) ksilanın ana iskeletini rastgele hidrolize eder. –ksilozidaz (1,4- -D-ksilozidaz, 1,4- -D-ksilan ksilohidrolaz EC 3.2.1.37) kısa zincirli oligosakkaritleri hidrolize eder. Asetil ksilan esterazlar, ksilan molekülünün asetil gruplarını uzakla tırırken, -L-arabinofüranozidazlar (EC 3.2.1.55) ksilanda bulunan -L-arabinofüranozil ucunu hidrolize ederler. -D-glikoronozidazlar (EC 3.2.1.1) ksiloz ve D-glikoronik asit veya 4-O-metileter arasındaki -1,2-glikozidik ba larını hidrolize eder. Feruloyil esterazlar (EC 3.1.1.73), ferulik asit ile ksiloz arasındaki ester ba ını hidrolize eder (Saha, 2003; Collins ve ark., 2005).
Ksilanazlar, genellikle glikoprotein yapısında, 6-80 kDa arası molekül a ırlı ında, optimum pH’ı 4,5-6,5 ve optimum sıcaklı ı 40-60 C olan enzimlerdir. Farklı kaynaklardaki ksilanazların sıcaklık, pH gibi optimum özellikleri de i mektedir. Wong ve ark. (1988), ksilanazları fizikokimyasal özelliklerine göre 2 gruba ayırmı tır. Dü ük molekül a ırlıklı (< 30 kDa) ve nötral pI’da ksilanazlar ile yüksek molekül a ırlıklı (> 30 kDa) ve asidik pI’da ksilanazlar (Butt ve ark., 2008). Ayrıca ksilanazlar, sıcaklık ve pH tercihlerine göre de termostabil, ekstremofilik, termofil, psikrofil, alkalifil ve asidofil eklinde de sınıflandırılır (Collins ve ark., 2005).
Ksilanazların ticari üretiminde genellikle Trichoderma reesei, Aspergillus niger,
Thermomyces lanuginosus, Aureobasidium pullulans, Bacillus subtilis ve Streptomyces lividans mikroorganizmalar kullanılır (Beg ve ark., 2001). Endüstride kullanılan
ksilanazlar genellikle küf veya bakteri kaynaklı, mezofilik (40-60 C), nötral veya hafif asidiktirler (Collins ve ark., 2005).
ekil 2.9. Ksilanazların ksilan iskeletindeki rolleri (Erdogan ve Akpinar, 2008).
Ksilanazlar, ilk ba larda pulp ve ka ıt endüstrisinde kullanım alanı bulmu tur. Bu alanda ksilanazlar, beyazlatma ajanı olarak kullanılmı lardır. Bunun yanında kanatlı hayvanlarda gıda katkısı olarak (Bedford ve Classen, 1992), bu day unundan yapılmı hamurun yo rulmasını ve fırıncılık ürünlerinin kalitesini iyile tirmede (Maat ve ark., 1992), kahve, bitkisel ya ve ni asta özütlenmesinde (Wong ve Saddler, 1992), tarımsal silaj ve yemlik tahılların besinsel özelliklerini iyile tirmede (Kuhad ve Singh, 1993), meyve suyunun berrakla tırılmasında selülaz ve pektinazla birlikte (Biely, 1985), keten, ha ha , hint keneviri, çin keneviri gibi bitkisel lif kaynaklarının zamklarını gidermede (Kapoor ve ark., 2001; Puchart ve ark., 1999; Sharma, 1987) kullanılmaktadırlar. Ka ıt endüstrisinde klor yerine a artma amacı ile ksilanaz kullanımı ka ıt hamurundan lignin ayrılmasını kolayla tırmı tır. Klor ve klorlu bile iklerin çevreye verdikleri zarar böylece önlenmi tir. Hayvan beslenmesinde küf kaynaklı Trichoderma ve Aspergillus türleri kullanılmaktadır. Yemlere eklenen ksilanaz hayvanların yemi daha kolay sindirmesini sa lamaktadır. Fırıncılık ürünlerinde ksilanazların kullanımı suda çözünmeyen hemiselülozu çözünür hale geçirir, hamurun su tutma gücünü artırır, ekme in somun
O OH O H RO O O OH OH H3CO COOH O O H OH O O OH O H OH O OH O O H O O OAc O O H O O O O O OR O H C CH O CH R OH Endoksilanaz ββββ-ksilanaz
Asetil ksilan esteraz
αααα-glukoronozidaz
αααα-arabinofuranozidaz
Ferulik asit esteraz p-kumarik asit esteraz
Ac: Asetil R: H (p-kumarik asit) R: OCH3 (ferulik asit)
O OH O H RO O O OH OH H3CO COOH O O H OH O O OH O H OH O OH O O H O O OAc O O H O O O O O OR O H C CH O CH R OH Endoksilanaz ββββ-ksilanaz
Asetil ksilan esteraz
αααα-glukoronozidaz
αααα-arabinofuranozidaz
Ferulik asit esteraz p-kumarik asit esteraz
Ac: Asetil R: H (p-kumarik asit) R: OCH3 (ferulik asit)
hacmini artırarak ekme in tazeli ini uzun süre muhafaza etmesini sa lar (Kulkarni ve ark., 1999; Beg ve ark., 2001)
2.2.4.5. Endoksilanazlar
Endoksilanazlar veya endo-1,4- ksilan ksilanohidrolazlar (EC 3.2.1.8), -D-ksilopiranoz birimleri arasındaki -1,4 iç ba larını hidrolizleyerek ksilan iskeletini rastgele parçalarlar ve dü ük molekül a ırlı ında ksilan parçaları ile ksilooligosakkaritler olu tururlar (Beg ve ark., 2001; Courtin ve ark.,, 2006; Verwimp ve ark., 2006; Verwimp, 2007; Berrin ve Juge, 2008).
Bugün 300’den fazla endoksilanaz belirlenmi tir. Bunlar küf, bakteri, böcek, salyangoz, kabuklular, alg ve bitkilerde bulunurlar. Endoksilanazlar bitkilerden bu day, arpa ve çavdar gibi tahıllarda bulunmaktadır. Bu dayda bulunan endoksilanazlar, endosperm hücre duvarını (ço unlukla arabinoksilan ve -glikan içeren) parçalarlar, ni asta ve protein eri ilebilirli ini iyile tirirler. Endüstriyel olarak endoksilazlar mikrobiyal kaynaklardan üretilmekte ve endüstriyel proseslerde yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Genetik bilgiye ve yapısal analize göre endoksilanazlar aminoasit dizili ve yapılarına göre glikozid hidrolazların (GH) 5, 7, 8, 10, 11, 16, 26, 43 ve 62 aileleri altında sınıflandırılmaktadırlar. Bununla birlikte endoksilanazların büyük bir bölümü GHF 10 ve 11 sınıfına aittir. GH 11 ailesi, ksilan iskeletinin substitüye olmamı bölgesini hidroliz ederken GH 10 ailesi, ksilan iskeletinin 4-O-metil-D-glikoronat, asetat ve -L-arabinofüranosil substitüyelerini hidrolizler. Bakteri ve küf endoksilanazları, GH 10 ve 11 ailesi içinde sınıflandırılırken bitki endoksilanazları daha çok GH 10 ailesi içinde yer alırlar (Beg ve ark., 2001; Courtin ve ark., 2006; Verwimp ve ark., 2006; Verwimp, 2007; Berrin ve Juge, 2008). Endoksilanazlar, di er ksilanolitik enzimlerle sinerjik biçimde çalı arak kompleks yapıdaki ksilanın tamamını hidrolize ederler.
Endoksilanazlar, moleküler kütle, izoelektrik nokta, optimal sıcaklık ve pH stabilitesi gibi fiziko-kimyasal özellikleri bakımından farklılık gösterir. GH 10 endoksilanazlar genellikle yüksek molekül a ırlı ı (>30 ×103) ve dü ük pI (3,6-4,5) ile karakterize
edilirler (nitelendirilirler). GH 11 endoksilanazlar genellikle dü ük molekül a ırlı ında (20×103) alkali (pI 8-9) ve asidik (pI 4-5) endoksilanazlar içinde gruplandırılır. (Verwimp, 2007; Berrin ve Juge, 2008). Dekker ve Richards (1976)’a göre küf endoksilanazlarının optimum pH’sı 3,5-5,5 iken bunlar genellikle geni pH aralıklarında (3,0-10,0) oldukça kararlıdırlar. Bakteriyel endoksilanazlar, genellikle optimum pH’ya (~6,0) sahiptirler; fakat pH stabiliteleri daha azdır (5,0-7,3) (Courtin ve ark., 2006; Verwimp, 2007; Berrin ve Juge, 2008). GH 10 ve GH 11 aileleri ayrıntılı incelenmesine ra men, son zamanlarda ke fedilen GH 5, 7, 8 ve 43 ailelerinin özelliklerine ait ara tırmalar çok sınırlıdır. Trichoderma reesei’ den elde edilen GH 7 ailesine ait enzim, spesifik olmayan endo- -1,4 glikanaz olarak sınıflandırılmı tır (Kleywegt ve ark., 1997). Paenibacillus polymyxa‘dan elde edilen ve GH 43 ait ksilanaz ve
-L-arabinofüranozidaz aktivitesine sahip oldu u bulunmu tur (Gosalbes ve ark., 1991).E. chrysanthemi’den elde edilen ve GH 5 ailesine ait ksilanazın
4-O-metil-D-glikoronoksilan veya onun asetille mi formunu hidrolize etti i ve di er tip ksilanları hidroliz etmedi i bulunmu tur (Vrsanska ve ark., 2007).
GH 11 ailesinden elde edilen ksilanazlar, GH 10 ksilanazlardan dü ük katalitik aktiviteye sahiptirler ve bunların hidrolizasyonu ile açı a çıkan ürünler GH 10 enzimleri ile hidrolize edilebilir. GH 10 ksilanazları son ürün olarak ksiloz açı a çıkarabilirken; GH 11 ksilanazların açı a çıkardı ı son ürünler ksilobiyoz ve ksilotriozdur. Ksilanolitik aktivitelerine ek olarak GH 10 ksilanazların ilginç bir özelli i de glikoz türevi (sellobiyoz gibi) substratları da hidolize edebilmeleridir. GH 10 ksilanazların aksine, GH 11 enzimleri uzun zincirli oligosakkaritleri daha iyi hidrolize ederler. Ksilanazların substrat spesifiklikleri do rudan elde edilen ürünlere yansımaktadır. Ksilanazların aktif bölgelerinde her bir ksiloz yerle ebilece i alt bölgeler vardır. Bu alt bölgelerin sayısı hidrolizasyon sonucu olu acak ürünün polimerizasyon derecesini do rudan etkilemektedir. Kinetik ve yapısal ara tırmalar GH 11 ailesine ait ksilanazların -3 ve + 3 olmak üzere toplam altı alt bölgesi bulundu unu göstermi tir. GH 10 ailesine ait enziminin aktif bölgelerinin büyüklü ü ise de i kendir. GH ailesi arasında sadece GH 10 ve GH 11 ksilanazları arabinoksilanı hidrolize ederler. GH 11 ksilanazları arabinoksilan iskeletinin substitüye olmamı bölgelerini hidroliz ederken GH 10 daha çok substitüye olmu bölgeleri hidroliz etmektedir (Berrin ve Juge, 2008).
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1. Materyal
Analiz için ayçiçek, bu day, pamuk ve tütün sapları Tokat ve çevresinden temin edilerek öncelikle kurutulmu daha sonra da boyutları 0,2-1 cm’ye küçültülmü tür.
Trichoderma longibrachiatum’dan elde edilen endo-ksilanaz Danisco (Finlandiya)
firması ve aluminyum silika jel 60 ince tabaka plakaları Sigma (Sigma Chemical Company, MO, USA) firmasından temin edilmi tir. Ksilooligosakkarit standartları; ksiloz (X1), ksilobiyoz (X2), ksilotriyoz (X3), ksilotetroz (X4), ksilopentoz (X5), ksiloheksoz (X6) ve ksiloheptoz (X7) ise Akpınar ve ark. (2009)’nın metodu baz alınarak 0,25 M H2SO4 ile hidrolize edilen tütün sapları ksilanından (%4 w/v) elde edilmi tir. Di er kullanılan bütün kimyasallar Sigma (Sigma Chemical Company, MO, USA) ve Merc (KGaA, Germany) firmalarından temin edilmi tir.
3.2. Yöntem
3.2.1. Atıkların Karakterizasyonu
3.2.1.1. Nem
Sabit tartıma getirilen petri kutuları içerisine 2 g kadar her bir örnekten tartılmı tır (M1). Örnekler 105°C’de etüvde sabit tartıma (M2) gelene kadar kurutulmu tur. Her bir örnek (AS, BS, PS ve TS) için analiz 3 paralelli yapılmı tır.
% Nem = [ (M1-M2) / m] x 100
M1 = Alınan örnek a ırlı ı+sabit tartıma getirilen kurutma kabının a ırlı ı (g) M2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen kurutma kabının a ırlı ı (g) m = Alınan örne in a ırlı ı (g)
3.2.1.2. Kül
Sabit tartıma gelen porselen krozelere (a) kurutulmu 1 g kadar her bir örnekten konularak kül fırınında 600oC’de yakılmı tır. Yakma i lemine örneklerde siyah leke kalmayana dek devam edilmi tir. Desikatörde so utulan örnekler tartılmı tır (b). Her bir örnek (AS, BS, PS ve TS) için analiz 3 paralelli yapılmı tır.
Kül miktarı (K.M.’de %)= 100 (b-a) M a: Yakma kabı darası (g)
b: Kül + yakma kabı (g) M: Örnek miktarı (g)
3.2.1.3. Lignin
AS, BS, PS ve TS örneklerinden 0,3 g (M1) kadar test tüplerine konularak, üzerlerine 4,5 mL %72’lik H2SO4 eklenmi ve 30oC’deki çalkalanan su banyosu içinde 1 saat bekletilmi tir. Daha sonra her bir örne e 84 mL saf su eklenenerek asit içeri i %3’e seyreltilmi tir. Örnekler 2 saat kaynatılarak, sabit tartıma getirilmi ve porlu süzgeçten (M2) süzülmü tür. Analiz 3 paralelli yapılmı tır.
% Lignin = [ (M1-M2) / m] x 100
M1 = Alınan örnek a ırlı ı+sabit tartıma getirilen porlu süzgecin a ırlı ı (g) M2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen porlu süzgecin a ırlı ı (g) m = Alınan örne in a ırlı ı (g)
3.2.1.4. Selüloz
AS, BS, PS ve TS örneklerinden 2,5 g kadar bir erlen içine tartılmı tır. Her birine 80’er mL sıcak saf su eklenerek 70oC’deki su banyosu içine yerle tirilmi tir. Her bir örne e önce 0,5 mL asetik asit sonra 1 mL sodyum klorit eklenerek, su banyosunda 1 saat çalkalanması sa lanmı tır. Tekrar aynı sıra ile aynı miktarda aynı maddeler eklenerek 1’er saat çalkalanmı tır. Bu ekilde toplam 7 kez bu çözeltiler eklenerek su banyosunda 1 gece bırakılmı tır. lk eklemeden 24 saat sonra örnekler darası alınmı filtre ka ıdından süzülerek, filtre ka ıdı ile birlikte 105oC’de kurutulmu tur. Kuruyan her bir örnekten (lignini uzakla mı holoselüloz) 2’ er gram (m) alınarak 25 mL %17,5’luk NaOH ile muamele edilip, darası alınmı porlu kroze ile filtre edilerek hemiselüloz uzakla tırılmı tır. Kalan katı kısım 100 mL %8,3’lük NaOH ve distile suyla yıkanmı , yıkanan örne e 15 mL %10’luk asetik asit ilave edilerek tekrar distile suyla yıkama i lemi gerçekle tirilmi tir. Daha sonra örnekler 105ºC’de 3 saat sabit a ırlı a gelene kadar kurutma i lemine devam edilmi tir.
% Selüloz = [ (M1-M2) / m] x 100
M1 = Alınan örnek a ırlı ı+sabit tartıma getirilen porlu süzgecin a ırlı ı (g) M2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen porlu süzgecin a ırlı ı (g) m = Alınan örne in a ırlı ı (g)
3.2.1.5. Ksilan
Yukarıda %17,5 NaOH muamelesinden elde edilen filtrat hacminin 2,5 katı kadar hacimdeki etil alkol/asetik asit (10:1) karı ımı ile nötralize edilip çöktürüldükten sonra ksilan filtrasyonla ayrılmı ve 60ºC’de kurutulmu tur (ASTM, 1993).
3.2.1.6. Çözünürlükler
3.2.1.6.1. So uk suda çözünürlük
AS, BS, PS ve TS örneklerinden 2 g kadar bir beher içine tartılmı tır. Her birine 300 mL saf su eklenmi tir. Magnetik karı tırıcıda 48 saat karı tırılarak, karı ım darası alınmı filtre ka ıdından süzülmü tür. Filtre ka ıdı ve kalıntı etüvde sabit tartıma gelinceye kadar 105ºC’de kurutulmu tur.
M1 = Alınan örnek a ırlı ı+sabit tartıma getirilen filtre ka ıdının a ırlı ı (g) M2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen filtre ka ıdının a ırlı ı (g) m = Alınan örne in a ırlı ı (g)
% Çözünürlük= [ (M1-M2) / m] x 100
3.2.1.6.2. Sıcak suda çözünürlük
AS, BS, PS ve TS örneklerinden 2 g kadar bir erlen içine tartılmı tır. Her birine 100 mL saf su eklenmi tir. 3 saat geri so utucuda kaynatılan örnekler, darası alınmı filtre ka ıdından süzülmü tür. Filtre ka ıdı ve kalıntı etüvde sabit tartıma gelinceye kadar 105ºC’de kurutulmu tur.
M1 = Alınan örnek a ırlı ı+sabit tartıma getirilen filtre ka ıdının a ırlı ı (g) M2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen filtre ka ıdının a ırlı ı (g) m = Alınan örne in a ırlı ı (g)
% Çözünürlük= [ (M1-M2) / m] x 100
3.2.1.6.3. Alkol-benzen çözünürlük
AS, BS, PS ve TS örneklerinden 2 g kadar tartılarak erlene transfer edilmi tir. Her birine 50 mL %95 etil alkol ile 100 mL benzen eklenerek 6 saat geri so utucuda
kaynatılan örnekler, darası alınmı filtre ka ıdından süzülmü tür. Filtre ka ıdı ve kalıntı etüvde sabit tartıma gelinceye kadar 105ºC’de kurutulmu tur.
M1 = Alınan örnek a ırlı ı+sabit tartıma getirilen filtre ka ıdının a ırlı ı (g) M2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen filtre ka ıdının a ırlı ı (g) m = Alınan örne in a ırlı ı (g)
% Çözünürlük= [ (M1-M2) / m] x 100
3.2.1.6.4. Diklorometanda çözünürlük
AS, BS, PS ve TS örneklerinden 2 g kadar tartılarak erlene transfer edilmi tir. Her birine 150 mL %98 diklorometan eklenerek 6 saat geri so utucuda kaynatılan örnekler, darası alınmı filtre ka ıdından süzülmü tür. Filtre ka ıdı ve kalıntı etüvde sabit tartıma gelinceye kadar 105ºC’de kurutulmu tur.
M1 = Alınan örnek a ırlı ı+sabit tartıma getirilen filtre ka ıdının a ırlı ı (g) M2 = Kurutulmu örnek+ sabit tartıma getirilen filtre ka ıdının a ırlı ı (g) m = Alınan örne in a ırlı ı (g)
% Çözünürlük= [ (M1-M2) / m] x 100
3.2.2. Atık Ksilanın Karakterizasyonu
3.2.2.1. Üronik asit
Atıkların ve bunlardan elde edilen ksilanın üronik asit içeri i m-hidroksidifenil metodu ile D-glikoronik asit standardı kullanarak belirlenmi tir (Melton and Smith, 2001). AS, BS, PS, TS ile ASK, BSK, PSK ve TSK örneklerinden 0,005 g kadar bir tüp içine tartılarak üzerlerine 2 mL konsantre sülfürik asit eklenmi ve buz içine yerle tirilerek 20 dk kar tırılmı tır. Toplam hacim 10 mL olana kadar distile su ile seyreltilmi tir ve örnekler 10 dakika 2000xg’de santrifüj edilerek sıvı kısımdan 400 µL alınmı ve 40 µl
4 M sulfamik asit/potasyum sulfamat çözeltisi (pH 1,6) ile karı tırılmı tır. Üzerine sülfürik asit içinde hazırlanmı 2,4 mL 75 mM sodyum tetraborat eklenmi ve 100ºC su banyosu içinde 20 dakika kaynatılmı tır. Örnekler oda sıcaklı ına kadar so utulduktan sonra 80 µL m-hidroksidifenol çözeltisi eklenmi tir. Kontrol de m-hidroksidifenol çözeltisi yerine 80 µL %0,5’lik NaOH eklenerek yapılmı tır. Örnekler 10 dakika oda sıcaklı ında inkübe edildikten sonra olu an pembe renk spektrofotometrede (Perkin Elmer UV/Vis spectrometer, Lambda EZ 201) 525 nm’de okunmu tur. Bu analizde kullanılan çözeltilerin hazırlanı ı Ek 1’de verilmi tir. ndirgen eker miktarı DNS metodu ile (Miller, 1959) ksiloz standartı kullanılarak hesaplanmı tır (Ek 3).
3.2.2.2. eker kompozisyonu
Atıklardan özütlenmi ksilan örneklerinin (ASK, BSK, PSK ve TSK) her birinden 0,3 g kadar tartılmı tır. Her birine 3 mL %72’lik sülfürik asit eklenerek 30ºC’deki su banyosunda 2 saat çalkalanması sa lanmı tır. Her bir örne e 77,55 mL saf su eklenerek asit içeri i %4’e dü ürülmü tür. Bu ekilde her bir örnek 100ºC’de kaynayan suda 4 saat kaynatılmı tır. So utulan örneklerin pH’ları 5 ile 6 arasına CaCO3 ile ayarlanarak 5000 rpm’de 10 dk santrifüjlenmi tir.
Nötral monosakkaritler sülfürik asitle hidrolizinden sonra Aminex HPX 87H (Biorad) kolonda HPLC ile belirlenmi tir (Pellerin ve ark., 1991). Hidrolizasyon esnasında olu an KOlerin miktarı refraktometrik dedektöre (model 200) ve kolon fırınına (model 200) sahip Perkin Elmer HPLC sisteminde analiz edilmi tir. Örnekler enjeksiyondan önce 0,20 µm boyutlu filtrelerden geçirilmi tir. Hareketli faz olarak 5 mM H2SO4 su kullanılmı tır. Örnekler 45ºC’de ve 0,4 mL/dk akı hızı ile 45 dakika kolondan elute edilmi tir.
