Ksilanaz aktivitesi

Ksilanaz aktivitesini belirlemek amacıyla farklı dilusyonlarda hazırlanan enzim çözeltisi (0,1 mL) ticari bir ksilan olan hu a acı ksilanı (%1 konsantrasyonda 1 mL) ile pH 4,6’da 50oC’de 30 dk inkübe edilmi ve olu an indirgen eker miktarı DNS yöntemi ile

belirlenmi tir. Bir ünite (U) enzim aktivitesi 1 dakikada 1 µmol ksiloz e de eri üreten enzim miktarı olarak tanımlanmı tır (Bailey ve ark., 1992).

3.2.4.3. Enzimatik hidrolizasyon

ncelenen atıklardan elde edilen ksilanların hidrolizinde Trichoderma longibrachiatum ksilanazının 1ml’si (4 U/mL enzim konsantrasyonunda) ile 10 mL ksilan ( %2 substrat konsantrasyonunda, pH 4,6’da 50 mM sitrat tamponla hazırlanmı ) 50 C’de inkübe edilmi tir. Reaksiyon süresi sonunda örnekler 5 dk kaynatılarak enzim inaktive edilmi tir. Hidrolizasyon reaksiyonunun sonucu DNS metodu ile indirgen eker ölçülerek bulunmu tur. Reaksiyon ürünleri TLC ile a a ıda belirtildi i ekilde analiz edilmi tir. KO üretmek için reaksiyon süresi (0 ile 48 saat aralı ında), sıcaklık (30 C, 40 C, 50 C, 60 C, 70 C), pH (3,6; 4,6; 5,6), substrat (%1 ile %5 aralı ında) ve enzim konsantrasyonu (1, 2, 4, 6, 16, 20 U/mL) optimize edilmi tir.

3.2.5. ndirgen eker

ndirgen eker DNS metodu ile ksiloz standartı kullanılarak belirlenmi tir (Miller, 1959). Enzimatik hidrolizasyon sonunda elde edilen örneklerden 50 µL alınarak 950 µL distile su ile karı tırılmı tır. Bu karı ımın üzerine 1,5 mL DNS ilave edilerek vorteks karı tırıcı ile örnekler homojen hale getirilmi tir. 100°C’de 5 dakika kaynatma i leminden sonra örnekler oda sıcaklı ına so utulmu ve olu an renk spektrofotometrede 560 nm’de okunmu tur.

3.2.6. TLC

Ksiloz standartı ve örnekler TLC plakalarına uygulandıktan sonra plakalar etil asetat:asetik asit:saf su karı ımı (2:2:1) içinde yürütülmü tür (Ek 4). TLC plakaları etil

alkol:H2SO4 (18:2) sprey çözeltisi ile spreylenerek etüvde 105 C’de 10-15 dk bekletilmi tir.

3.2.7. statiksel Analiz

Analiz sonuçları ortalama ve standart sapma ile beraber verilmi tir. Verilerin analizinde istatiksel SPSS bilgisayar paket programı (SPSS, Inc., II., USA) kullanılmı tır. Analiz verileri arasındaki farklılık (p<0.05) Duncan çoklu kar ıla tırma testine göre hesaplanmı tır.

Tarımsal atıkların kimyasal kompozisyonları; yeti tikleri yere, mevsime, hasat ekline, analiz metotlarına göre de i mektedir. Çizelge 4.1’de farklı lignoselülozik maddelerden çalı mada kullanılan ayçiçek sapı (AS), bu day sapı (BS), pamuk sapı (PS) ve tütün sapı (TS) örnek saplarının kimyasal kompozisyonları verilmi tir. Sonuçlar arasındaki farklılıklar nem, kül, selüloz, lignin, suda ve di er çözücülerde çözünürlük bakımından istatistiki yönden önemli bulunmu tur; ancak seçilen bu örneklerde hemiselüloz (ksilan) kompozisyonu bakımından önemli bir fark bulunmamı tır.

Kül miktarı, incelenen örneklerdeki inorganik anyon ve katyonları yani mineral madde miktarını göstermektedir. Çalı mamızda kül yüzdeleri AS, BS, PS ve TS örneklerinde sırası ile %3,12, %5,46, %7,31 ve %6,88 olarak hesaplanmı tır ve aradaki farklılı ın istatistiksel açıdan önemli oldu u bulunmu tur. Buna göre kül içeri i en yüksek PS’nda (%7,31) en dü ük ise AS’nda (%3,12) hesaplanmı tır (Çizelge 4.1).

Genelde, sert odunsu bitkilerin kül miktarı yumu ak odunsu bitkilerin kül miktarından daha fazladır. Literatürde kül oranları AS’nda %5 oranlarında (Sharma ve ark., 2002), BS’nda %5-10 (Anonim, 2007b; Mengelo lu ve Alma, 2002; Youngquist ve ark., 1996; Rowell ve ark., 2000), PS’nda %2-6 (Clayton, 1969; Youngquist ve ark., 1996; Ate , 1990; Akpınar ve ark., 2007; Mengelo lu ve Alma, 2002; Silverstein 2004), TS’nda %5-11 (Erdo an, 2007; Tank ve ark., 1985; Pehlivan, 2000) arasında bulunmu tur. A açların yapılarında %40-50 oranında bulunan selüloz, tarımsal atıklarda %25-40 civarındadır (Ate , 1990). Selüloz içeri i atık saplarının türüne, iklim ko ullarına ve yeti tirilme ortamına göre de i iklikler göstermektedir (Kahraman, 1998). AS %41,7, BS %39,5, PS %32,96 ve TS %44,27 oranında selüloza sahip oldu u bulunmu tur (Çizelge 4.1).

Çizelge 4.1. Atıkların (AS, BS, PS ve TS) kimyasal kompozisyonu. Veriler 3 paralel ortalaması ve standart sapması ile verilmi tir.

çerik (%) Bile enler AS BS PS TS Nem 5,65±0,30c _4,74±0,10d _7,09±0,19a _5,95±0,09b Kül 3,12±0,36d _5,46±0,13c _7,31±0,17a _6,88±0,92b Selüloz 41,66±2,61ab _39,50±2,70b _32,96±0,65c _44,27±2,93a Ksilan 18,87±3,98a _20,62±0,78a _21,34±0,36a _21,82±1,24a Lignin 26,12±0,35b _19,75±0,67d _28,76±0,37a _22,68±0,97c So uk su çözünürlü ü 4,59±0,50c _7,30±0.17b _8,98±0,15a _7,79±0,70b Sıcak su çözünürlü ü 7,09±0,59c _9,15±0,67b _12,24±0,28a _10,05±0,47b Diklorometan çözünürlü ü 1,55±0,09c _3,74±0,04b _3,64±0,13b _5,93±0,32a Alkol-benzen çözünürlü ü 1,71±0,20c _4,21±0,15b _5,36±0,28a _5,65±0,18a

abcd _{Farklı harfler Duncan çoklu kar ıla tırma testine göre örnekler arasındaki farklılı ı} gösterir. Ayrı harfle i aretlenmi ortalamalar, istatistiki olarak birbirinden farklıdır (P<0,05).

Literatürde selüloz oranları AS’nda %39-41 (Marechal ve Rigal, 1999; Sharma ve ark., 2002), BS’nda %38-46 (Youngquist ve ark., 1996; Anonim, 2007b), PS’nda %35-50 (Clayton 1969; Akpınar ve ark., 2007; Mengelo lu ve Alma, 2002; Ate , 1990), TS’nda %33-46 (Tank ve ark., 1985; Erdo an, 2007) arasında bulunmu tur.

Ksilan içeri i bakımından AS, BS, PS ve TS incelendi inde sırası ile %18,87, %20,63, %21,34 ve %21,82 oranında ksilana sahip oldu u gözlenmi (Çizelge 4.1) ve farklılıklarında önemsiz oldu u bulunmu tur.

Literatürde hemiselüloz oranları AS’nda %32-34 (Sharma ve ark., 2002; Marechal ve Rigal, 1999), BS’nda %26-30 (Anonim, 2007b; Mengelo lu ve Alma, 2002), PS’nda %19-26 (Akpınar ve ark., 2007; Mengelo lu ve Alma, 2002; Ate , 1990), TS’nda %17-22 (Erdo an, 2007, Akpınar ve ark., 2008) arasında bulunmu tur.

Lignin yönünden AS, BS, PS ve TS sırası ile %26,12, %19,75, %28,76 ve %22,68 oranında lignin içerdi i ve aradaki farklılı ın istatistiksel açıdan önemli oldu u bulunmu tur (Çizelge 4.1).

Literatürdeki lignin oranları AS’nda %17-18 (Sharma ve ark., 2002; Marechal veRigal, 1999), BS’nda %15-20 (Anonim, 2007b; Han ve Rowell, 1997; Mengelo lu ve Alma, 2002), PS’nda %20-27 (Clayton, 1969; Mengelo lu ve Alma, 2002; Akpınar ve ark., 2007; Ate , 1990), TS’nda %17-19 (Tank ve ark., 1985; Erdo an, 2007) arasında bulunmu tur.

Genellikle sert odunsularda selüloz ve hemiselüloz oranının yumu ak odunsulardakinden yüksek, lignin oranının ise daha dü ük oldu u bildirilmi tir (Mazlan, 1998). Yumu ak odunsularda selüloz %42, hemiselüloz %27 ve lignin %28 oranında iken sert odunsularda selüloz %45, hemiselüloz %30 ve lignin %20 oranındadır. So uk su, lignoselülozik materyallerden tanenleri, gamları, renk maddeleri ile ekerleri sıcak su ise yine aynı maddeler ile ni astalı maddeleri yapıdan uzakla tırmı tır. Alkol- benzen karı ımı ya sı maddeleri, mumları ve reçineleri diklorometan ise yine mum, ya , reçine benzeri maddeleri yapıdan uzakla tırmı tır. Sıcak suda çözünürlük ile alkol- benzen çözünürlük de erleri zayıf alifatik ve aromatik bile enlerin varlı ının bir göstergesidir. Özütlenen bu maddeler, dü ük molekül a ırlı ında ve nötral çözücülerde çözünen organik maddelerdir. Aromatiklerin kombinasyonundan olu mu bile enler, ya lar vakslar, ya asitleri ve alkoller, flavanoidler, tanenler, terpenler ve çe itli ekerler özütlenebilen maddeleri olu tururlar. Bunlar tarımsal atıkların toplam a ırlı ının %15- 30’ unu olu turmaktadırlar ve bitki türüne, co rafi bölge ve mevsime göre bunların içerikleri de i mektedir (Mazlan, 1998).

So uk suda çözünürlük oranları AS’nda %4,59, BS’nda %7,3, PS’nda %8,98, TS’nda %7,79; sıcak suda çözünürlük oranları AS’nda %7,09, BS’nda %9,15, PS’nda %12,24, TS’nda %10,05; alkol-benzen karı ımında çözünürlük oranları AS’nda %1,71, BS’nda %4,21, PS’nda %5,36, TS’nda %5,65; diklorometanda çözünürlük oranları ise AS’nda %1,55, BS’nda %3,74, PS’nda %3,64, TS’nda %5,93 bulunmu tur. Özüt maddeler

bakımından sert odunsular daha zengindir. Sert odunsularda %5 oranında özüt varken yumu ak odunsularda %2 oranındadır (Mazlan, 1998).

4.2. Atık Ksilanın Karakterizasyonu

Ksilan, monokotil bitkilerde (hububat ve tahıl) arabinoz, asetil grupları ve glikoronik asit yan zincirleri içerirken dikotil bitkilerde (sert odunsular) ksilan, sadece kısmen asetille mi 4-O-metilglikoronoksilan zincirleri halinde bulunur (Nabarlatz, 2007). Çiçekli bitkilerde (glikorono-)arabinoksilanlar ve glikoronoksilanlar olarak 2 gruba ayrılır. Monokotların (hububat ve tahıl) hücre duvarında bulunan ksilan -D-1,4- ba ı ile ba lı D-ksilopiranozil birimlerinin düz zincir halindedir ve genelikle 2-O- ve/veya 3-O- pozisyonlarında -L-arabinofüranosil ile -D-glikopiranozil üronik asit veya onun 2-O- pozisyonunda 4-O-metil türevlerini içerir (Kabel, 2002).

Alkali özütleme i lemleri ile AS, BS, PS ve TS’den sırası ile elde edilen ASK (ayçiçe i sapları ksilanı), BSK (bu day sapları ksilanı), PSK (pamuk sapları ksilanı) ve TSK (tütün sapları ksilanı) kompozisyonları Çizelge 4.2’de verilmi tir. Çizelgeden de görüldü ü üzere elde edilen ksilanların pentoz ve heksoz ekerler ile üronik asitten olu mu heterojen bir yapıya sahip oldu u görülmektedir. Ksilanın kompozisyonu bitkiden bitkiye de i mektedir. ncelenen atıkların ksilanlarında ksiloz oranları %85 ile %95 arasında de i mektedir. Kimyasal yapılarına ba lı olarak PSK’nda glikozun, BSK’nda ise arabinozun yüksek oranda oldu u görülmektedir. Ksilan, kısmen asetille mi olmasına ra men alkali özütleme i lemi süresince asetil grupları uzakla tırıldı ından asetil gruplar belirlenememi tir.

Üronik asit oranları da tarımsal atık kayna ına göre de i mektedir. Ksilanların üronik asit oranları ASK’da %10,16; BSK’da %6,58; PSK’da %9,75 ve TSK’da %11,30 oldu u tespit edilmi tir (Çizelge 4.3). Tarımsal atık örneklerinden AS’nın %6,20; BS’nın %3,19; PS’nın %7,47 ve TS’nın ise %8,51 üronik asit içerdi i belirlenmi tir. Test edilen örneklerin atık ve ksilan üronik asit içeriklerinde farklılıkların önemsiz oldu u bulunmu tur.

Sonuçlar ASK, PSK ve TSK’nın glikoronoksilan yapısında, BSK’nın ise daha heterojen bir yapıya sahip arabinoksilan yapısında oldu unu göstermi tir. Özellikle ASK, PSK ve TSK yapılarının sert odunsu bitkilerin ksilanına, BSK’nın ise yumu ak odun ksilanına (arabinoksilan) benzer oldu u saptanmı tır (Akpınar ve ark., 2008).

Çizelge 4.2. Atık ksilanlarının (ASK, BSK, PSK ve TSK) nötral eker ve üronik asit kompozisyonları. Veriler 3 paralel ortalaması ve standart sapması ile verilmi tir.

çerik (%)

Bile enler ASK BSK PSK TSK

Ksiloz 95,72±3,72a _85,17±0,10b _85,12±7,28b _93,45±0,99a Glikoz 4,27±3,72b _3,36±0,07b _14,87±7,28a _6,54±0,99b Arabinoz 0b _11,47±0,17a ₀b ₀b Üronik asit 10,16±0,18b _6,58±0,18d _9,75±0,21c _11,30±0,26a Glikoz/Ksiloz (mol/mol) 0,04 0,03 0,17 0,06 Arabinoz/Ksiloz (mol/mol) 0 0,13 0 0

abcd _{Farklı harfler Duncan çoklu kar ıla tırma testine göre örnekler arasındaki farklılı ı} gösterir. Ayrı harfle i aretlenmi ortalamalar, istatistiki olarak birbirinden farklıdır (P<0,05).

Çizelge 4.3. AS, BS, PS ve TS’nın atık ve ksilan üronik asit oranları. Veriler 3 paralel ortalaması ve standart sapması ile verilmi tir.

Üronik Asit çeri i (%)

Örnek Atık Ksilan

AS 6,20±0,59 10,16±0,18

BS 3,19±0,53 6,58±0,18

PS 7,47±0,23 9,75±0,21