1‹stanbul Üniversitesi, Cerrahpafla T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal› ‹stanbul, 2‹stanbul Üniversitesi, ‹stanbul T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, ‹stanbul.
Nevriye Gönüllü1, Ömer Küçükbasmac›1, Özden Büyükbaba-Boral2, Mine An¤-Küçüker2
‹letiflim / Correspondence: Nevriye Gönüllü Adres / Address: ‹stanbul Üniversitesi, Cerrahpafla T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal› ‹stanbul Tel: 0212 414 30 00/22462 E-mail: nevriegonullu@yahoo.com
The influence of urine and glucose added urine on the in vitro
antimicrobial activity of various antibiotics
ÖZET
Bu çal›flmada idrar›n ve glukoz ilave edilmifl idrar›n çeflitli antibiyotiklerin in vitro aktivitesi üzerine etkisi buyyonda mikrodilüsyon yöntemiyle araflt›r›lm›flt›r. Beta-laktam antibiyotiklere duyarl› 16 Escherichia coli suflu kullan›lm›flt›r. Ampisi-lin, ampisilin+sulbaktam, sefalotin, sefuroksim, seftriakson, amikasin, siprofloksasin, sulfometoksazol ve trimetoprimin mini-mal inhibitör konsantrasyonlar› (M‹K), mikrodilüsyon yöntemi ile paralel olarak Mueller Hinton buyyon, insan idrar› ve glu-koz ilave edilmifl insan idrar›nda (G idrar, gluglu-koz 440mg/dl) araflt›r›lm›flt›r. Yaklafl›k olarak tüm antibiyotiklerin M‹K'leri idrar ve glukozlu (G) idrarda, buyyondaki M‹K'lere göre daha yüksek bulunmufltur. Ampisilinin M‹K90'›, idrarda sekiz kere, G idrarda ise 32 kere buyyon ortam›na göre yüksek bulunmufltur. Seftriakson, siprofloksasin ve trimetoprimin M‹K90'lar› G idrarda, idrar ortam›na göre iki kere yüksek bulunmufltur. Ampisilin+sulbaktam, sefalotin, sefuroksim ve sulfametoksazol için M‹K90'lar idrarda ve G idrarda eflit bulunmufltur. Amikasin için M‹K90G idrarda, idrar ortam›na göre iki kez düflük bulunmufltur.
Siprofloksasin, sulfametoksazol ve trimetoprim d›fl›nda, tüm antibiyotiklere ait sonuçlar buyyon-idrar karfl›laflt›r›lmas› için anlaml› (p<0.05) bulunmufltur. Sulfometoksazol ve trimetoprim d›fl›nda, tüm antibiyotiklere ait sonuçlar› buyyon-G idrar kar-fl›laflt›r›lmas› için anlaml› bulunmufltur. Sonuçlar idrar-G idrar karkar-fl›laflt›r›lmas› için anlams›z bulunmufltur.
Bu çal›flmada baz› antibiyotiklerin aktivitelerinin idrardan ve G idrardan etkilendi¤i gösterilmifltir. Standard duyarl›l›k test-lerinin, idrar yolu infeksiyonlar›n›n tedavisinde kullan›lan baz› antibiyotiklerin aktivitesini oldu¤undan daha yüksek göstere-bilece¤i belirlenmifltir
Anahtar kelimeler: ‹drar, glukoz ilave edilmifl idrar, M‹K, antibiyotikler SUMMARY
The influence of urine and glucose added urine on the in vitro activities of various antibiotics was assessed by the microbroth dilution method in this study. Sixteen beta-lactam susceptible Escherichia coli isolates were used. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of ampicillin, ampicillin+sulbactam, cephalothin, cefuroxime, ceftriaxone, amikacin, ciprofloxacin, sulfamethoxazole and trimethoprim were performed parallel in Mueller Hinton broth, human urine and glucose added (440 mg/dl glucose) urine by the microbroth dilution method. MICs of nearly all antibiotics were higher in urine and glucose added urine than MICs in broth. MIC90against ampicillin was 8 fold higher in urine and 32 fold higher in glucose added urine than MIC90in broth. MIC90s against ceftriaxone, ciprofloxacin and trimethoprim in g-urine were only 2 fold higher than MIC90in urine. Equal MIC90in g-urine and urine were obtained for ampicillin-sulbactam, cephalothin, cefuroxime and sulphamethoxazole. Two fold smaller MIC90in g-urine in comparison with MIC90in urine were found for amikacin. The results of statistical analysis were significant (p<0.05) for all antibiotics except ciprofloxacin, sulphamethoxazole and trimethoprim for broth-urine comparison. For broth-g-urine the results were significant for all antibiotics except sulphomethoxazole and trimethoprim. The results were found unsignificant for urine -g-urine comparison.
This study demonstrated that MICs of antibiotics are influenced by the human urine and glucose added urine. MICs of some antibiotics used in the treatment of urinary tract infections may be overestimated by the standard antibiotic testing methods.
‹drar›n ve glukoz ilave edilmifl idrar›n çeflitli antibiyotiklerin
antimikrobiyal aktiviteleri üzerine etkisi
G‹R‹fi
Eriflkinlerin idrar yolu infeksiyonlar›n›n tedavisin-de antibiyotikler s›kça kullan›lan ilaçlard›r. Komplike olmayan idrar yolu infeksiyonlar› genç sa¤l›kl› kad›nlarda daha s›k görülmektedir ve te-davileri kolayd›r. Bununla birlikte, diyabetli has-talarda idrar yolu infeksiyonlar› komplike bir se-yir göstermektedirler (1).
Diyabet, endokrin hastal›klar aras›nda en s›k gö-rülen hastal›kt›r. Retinopati, nöropati, nefropati gibi organ komplikasyonlar›n›n d›fl›nda, diyabetli hastalar yüksek infeksiyon riski tafl›maktad›rlar ve bu hasta grubunun infeksiyonlar› daha a¤›r sey-retmektedir. Diyabetli hastalarda idrar yolu infek-siyonlar› en s›k görülen infeksiyonlar aras›nda yer al›rlar. ‹drar yolu infeksiyonlar›n›n, diyabetli hastalar aras›nda s›k görülmesinin nedenleri ara-s›nda glikozüri, nötrofillerin anormal fonksiyonu ve üroepiteliyal hücrelere artm›fl aderans gösteril-mektedir. Glikozüri, diyabetli hastalar›n idrar yo-lu infeksiyonlar›nda önemli bir rol oynamaktad›r. In vitro yap›lan çal›flmalarda, glikozürinin çeflitli Escherichia coli sufllar›n›n üremesini artt›rd›¤› bil-dirilmifl, bununla birlikte bu bulgu in vivo yap›-lan çal›flmalarda kan›tyap›-lanamam›flt›r; bu çal›flmalarda, glikozürili hastalarda, glikozürisiz hastalara göre da-ha s›k bakteriüri oldu¤u gösterilememifltir (2). Baz› antibiyotiklerin idrarda neden daha az etki-li oldu¤u sadece pH'n›n etkisiyle aç›klanamamak-tad›r. Bu etkinin azalmas›na idrar›n içinde çözül-müfl birçok di¤er etkeninde önemli rol oynad›k-lar› düflünülmektedir (1). Yak›n zamanda yapt›¤›-m›z bir çal›flmada, antibiyotik M‹K'lerinin insan idrar›ndan etkilendi¤ini ve genel olarak idrarda normal besiyerine oranla daha yüksek oldu¤unu göstermifltik (3). Glikozürinin ve glukozun anti-biyotiklerin antimikrobiyal etkisi üzerine etkisi hakk›nda fazla bilgi bulunmamaktad›r. Bu çal›fl-ma, idrar yolu infeksiyonlar›n›n tedavisinde kul-lan›lan baz› antibiyotiklerin aktivitesi üzerine glu-kozun etkisinin (glikozüriyi taklit ederek) belir-lenmesi amac› ile planlanm›flt›r.
GEREÇ VE YÖNTEM
Bakteriler. Bu çal›flmada idrar yolu infeksiyonu etkeni olan 16 E.coli suflu kullan›lm›flt›r. Tüm sufllar beta-laktam duyarl› fenotipindendir.
Antibiyotikler. Çal›flmada kullan›lan antibiyotik-ler afla¤›da s›ralanm›flt›r: ampisilin, sulfometoksa-zol, trimetoprim (Fako, ‹stanbul); ampisilin+sul-baktam (Bilim, ‹stanbul); sefuroksim (GraxoSmith Kline, ‹stanbul); seftriakson (Deva, ‹stanbul); amikasin (Mustafa Nevzat, ‹stanbul); siprofloksa-sin (Bayer, ‹stanbul).
Minimal inhibitör konsantrasyon (M‹K). M‹K, saptanmas›nda Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)'ün tarif etti¤i mikrodilüsyon yön-temi uygulanm›flt›r (4). Antibiyotiklerin 100'er μl katyon ayarl› Mueller Hinton buyyon, insan id-rar› ve glukoz ilave edilmifl (G idrar, glukoz 440 mg/dl) insan idrar› içeren mikropleytlerde çift se-ri dilüsyonlar› yap›lm›flt›r. Standard sufl olarak E.coli ATCC 25922 kullan›lm›flt›r. Logaritmik üreme faz›nda bulunan bakteri süspansiyonlar› yaklafl›k 5x105 CFU/ml Mueller Hinton buyyon ve idrar ve glukozlu idrar içeren kuyucuklar›n içine inoküle edilmifltir. 35°C'de 24 saatte üreme olmayan en düflük antibiyotik konsantrasyonu M‹K olarak kabul edilmifltir.
‹statistik. ‹statistik inceleme Kruskal-Wallis testi ile yap›lm›flt›r. Çoklu karfl›laflt›rmalar Dunn'›n yöntemi ile yap›lm›flt›r.
BULGULAR
Çeflitli antibiyotiklere karfl› M‹K da¤›l›m›, M‹K aral›klar› ve M‹K90'lar› Tablo 1'de gösterilmifltir. Yaklafl›k olarak tüm antibiyotiklerin M‹K'leri id-rar ve G idid-rarda daha yüksek bulunmufltur. Am-pisiline karfl› M‹K90 idrar ortam›nda sekiz kere, G idrar ortam›nda ise 32 kere buyyon M‹K90'a göre yüksek bulunmufltur. Seftriakson, siproflok-sasin ve trimetoprim M‹K90'lar› G idrarda, idra-ra göre iki kez yüksek bulunmufltur. Ampisi-lin+sulbaktam, sefalotin, sefuroksim ve sulfame
Antibiotikler Ampisilin Ampisilin + sulbaktam Sefalotin Sefuroksim Seftriakson Amikasin Siprofloksasin Sulfametoksazol Trimetoprim
Broth İdrar G idrar Broth İdrar G idrar Broth İdrar G idrar Broth İdrar G idrar Broth İdrar G idrar Broth İdrar G idrar Broth İdrar G idrar Broth İdrar G idrar Broth İdrar G idrar
Media 0.002 0.004 0.008 0.015 0.03 0.06 0.12 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 >1024 MIK Aralı MIK 90 %R %I %S 1 1 5 8 1 2 7 5 1 1 0.25-4 2-32 2-64 0.12-4 4-64 4-128 0.25-8 2-16 4-16 0.5-4 2-16 2-16 0.004-0.12 0.03-1 0.015-2 4-16 0.06-32 1-16 0.002-64 0.015-128 0.015-128 32->1024 256>1024 256>1024 0.002-512 0.06-512 0.03-512 2 16 64 4 64 64 8 16 16 4 16 16 0.12 1 2 16 32 16 64 64 128 >1024 >1024 >1024 512 256 512 4 3 7 2 1 1 3 7 4 5 8 2 3 4 10 1 1 1 1 1 4 9 1 1 5 9 2 6 8 2 2 4 8 2 5 3 6 1 6 5 4 2 5 5 1 3 2 7 1 1 1 4 1 5 2 1 2 1 4 6 5 5 1 1 3 5 2 1 1 2 6 4 2 2 2 3 3 3 2 1 4 1 3 2 3 3 3 1 3 2 3 3 1 2 2 1 3 1 1 1 2 3 1 10 2 5 2 7 1 1 1 1 1 1 5 5 1 1 2 1 1 1 3 1 1 1 1 1 2 6 2 68.7 31.3 75 25 100 25 6.2 68.8 100 100 100 100 100 Tablo 1. M‹K da¤›l›m›, M‹K aral›¤›, M‹K 90 ve duyarl›l›k oranlar›
toksazol için M‹K90 hem idrarda hem G idrarda eflit bulunmufltur. Amikasine karfl› G idrarda M‹K90, idrar M‹K90'a göre iki kez düflük bulun-mufltur.
‹statistiksel incelemede M‹K de¤erlerin yükselme-si, siprofloksasin, sulfametoksazol ve trimetoprim d›fl›nda broth-idrar karfl›laflt›r›lmas› için anlaml› (p<0.05); buyyon-G idrar karfl›laflt›r›lmas› için sulfometoksazol ve trimetoprim d›fl›nda anlaml› bulunmufltur. Sonuçlar, idrar-G idrar karfl›laflt›r›l-mas› için anlams›z bulunmufltur.
TARTIfiMA
Rutin antibiyotiklere duyarl›l›k deneyleri hastala-r›n tedavisi için çok önemli bilgiler sa¤lamakta-d›r, ancak duyarl›l›k testlerinin güvenirlilik s›n›r-lar› vard›r çünkü bu testler idrar›n veya idrar›n içindeki çözülmüfl maddelerin etkisini dikkate alamamaktad›rlar. Kalsyum ve magnezyum iyon-lar› ve pH gibi besiyerine ba¤l› faktörlerin, du-yarl›l›k testlerinin sonuçlar›n› etkiledi¤i daha ön-ceden gösterilmifltir (5). ‹n vitro yap›lan birçok çal›flmada, pH'n›n antibiyotiklerin aktivitesi üze-rindeki etkisi araflt›r›lm›flt› ancak, idrarda bulunan glukoz, üre ve katyonlar›n etkilerini araflt›ran ça-l›flmalar az say›dad›r. Kuflkusuz etkileyecek fak-törler bunlarla da s›n›rl› de¤ildir. Bu çal›flma, id-rar yolu infeksiyonlar›n›n tedavisinde kullan›lan baz› antibiyotiklerin aktivitesi üzerine glukozlu idrar›n etkisinin belirlenmesi amac› ile planlan-m›flt›r. Daha önceden yapt›¤›m›z bir çal›flmada, se-falotin d›fl›nda bir çok antibiyoti¤in idrardaki akti-vitelerinde bir düflüfl saptam›flt›k. Çal›flmada M‹K'ler mikrodilüsyon yöntemi ile paralel olarak buyyon ve pH's› 6.4 insan idrar›nda araflt›r›lm›flt›r. Farkl› üç beta-laktam direnç fenotip grubuna ayr›lm›fl 30 E.coli suflunun çeflitli antibiyotiklere karfl› M‹K'leri araflt›r›lm›flt›r ve elde edilen insan idrar›nda M‹K90'lar daha yüksek bulunmufltur. Bu çal›flma, baz› antibiyotiklerin etkisinin idrar ortam›ndan etki-lendi¤ini ve standart yöntemlerle elde edilen M‹K'lerin, idrar yolu infeksiyonlar›n tedavisinde kullan›lan baz› antibiyotiklerin etkisini oldu¤undan
Yap›lan bir baflka çal›flmada, normal ve diyabe-tik fare modelinde Serratia marcescens kökenine karfl› kinolonlar›n etkisi araflt›r›lm›flt›r. Normal ve diyabetik farelerin serum ve böbrek antibiyotik konsantrasyonlar›n aras›nda herhangi bir fark gö-rülmemifltir. Bu bulgular, kinolonlar›n diyabetlile-rin idrar yolu infeksiyonlar› tedavisinde etkili ilaçlar oldu¤unu göstermifltir (6).
Minuth ve ark. (7) yapt›klar› çal›flmada, idrar or-tam›ndaki gentamisinin E.coli ve Pseudomonas aeruginosa sufllar›na karfl› antibakteriyel etkisini araflt›rm›fllard›r. Çal›flmada normal idrar kullan›l-m›flt›r ve sonuçta, idrar›n asidite, osmolarite ve normal komponentlerine ba¤l› olarak antibiyotik üzerine inhibitör bir etkiye sahip oldu¤u gösteril-mifltir. E.coli ve P.aeruginosa kökenlerin inhibis-yonu için idrar ortam›nda 40 kez daha fazla gen-tamisine ihtiyaç duyulmufltur. Bu bulgular, özel-likle böbrek yetmezli¤ine ba¤l› düflük at›l›m ya-da düflük doz kullan›m›na ba¤l› idrarya-da gentami-sinin düflük konsantrasyonda bulunmas› durumla-r›nda dikkate al›nmas› gerekti¤i bildirilmifltir. Fromtling ve ark. (8), in vitro olarak idrar orta-m›nda, pH ve glukozun, norfloksasinin antibakte-riyel aktivitesi üzerine etkisini araflt›rm›fllard›r. Araflt›r›c›lar, norfloksasinin idrar›n pH 6.0, 7.0 ve 8.0 de¤erlerinde gram-negatif patojenleri etkili bir flekilde inhibe etti¤ini göstermifllerdir. Glukozun 200 mg/dl ve 400 mg/dl (diyabet glikozürisini taklit ederek) konsantrasyonlar›nda, E.coli, Prote-us mirabilis, Klebsiella pneumoniae ve P.aerugino-sa sufllar›na karfl›, norflokP.aerugino-sasinin antibakteriyal et-kisinin anlaml› bir flekilde de¤ifltirmedi¤ini gös-termifllerdir.
Yap›lan bir baflka çal›flmada, sukroz ve glukozun 30 Streptococcus mutans sufluna karfl› sefalospo-rinin aktivitesinin ne flekilde etkiledi¤ini araflt›r›l-m›flt›r. Sufllar›n yaklafl›k %21'i sukroz varl›¤›nda duyarl›, glukoz varl›¤›nda ise dirençli saptanm›fl-t›r. Dört farkl› sefalosporine karfl› sukroz M‹K de¤erleri glukoz M‹K de¤erlerine göre daha dü-flük bulunmufltur. Araflt›r›c›lar, bu bulgular›
suk-aç›klamaktad›rlar. Glukan›n sentezi, bakteriler aras›ndaki mesafeyi ve ayn› zamanda antibiyoti-¤in diffüzyonunu art›rmaktad›r (9).
Bu çal›flmada, araflt›r›lan antibiyotiklerin antibak-teriyal aktivitesi üzerine glukozun büyük bir et-kisi saptanamam›flt›r. Antibiyotiklerin in vitro ak-tiviteleri insan idrar›nda ve glukozlu insan idra-r›nda benzer bulunmufltur ancak M‹K de¤erleri, hem insan idrar›nda hem de flekerli insan idra-r›nda broth ortam›na göre daha yüksek bulunmufl-tur. Bu antibiyotiklerin M‹K'lerinin insan idrar›-n›n içeri¤inden etkilendi¤i ve idrar yolu infeksi-yonlar›n›n tedavisinde bu bulgular›n dikkate al›n-mas› gerekmektedir. Bu çal›flma ile birlikte bir-kez daha standart test yöntemi ile elde edilen so-nuçlar›n, idrar gibi daha karmafl›k in vivo koflul-larda elde edilen sunuçkoflul-lardan daha farkl› olabile-ce¤i vurgulanm›flt›r.
KAYNAKLAR
1. Caron F. Bases pharmacologiques de l'antibiothérapie des infections urinaires (1re partie): données experimentales in vitro. Antibiotiques 1999; 1: 27-31.
2. Hoepelman AIM, Meiland R, Geerlings SE. Pathogenesis and management of bacterial urinary tract infections in adult patients with diabetes mellitus. Int J Antimicrob Agents 2003; 22: 35-43.
3. Büyükbaba-Boral Ö, Gönüllü N, Küçükbasmaci Ö, An¤-Küçüker M, An¤ Ö. The influence of urine on the in vitro antimicrobial activity of various antibiotics against different Escherichia coli phenotypes. Chemotherapy 2004; 50: 35-39. 4. National Committee for Clinical Laboratory Standards: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, ed 5. Approved Standard M7-A5. Wayne, Pa USA: NCCL, 2000.
5. Nicolle LE. Measurement and significance of antibiotic ac-tivity in the urine. In: Lorian V, ed. Antibiotics in Labora-tory Medicine, 4. bask› Baltimore: Williams and Wilkins Co, 1996: 793-812.
6. Obana Y, Nishino T. Therapeutic efficacy of ofloxacin, ciprofloxacin and NY-198 in experimentally infected normal and alloxan-induced diabetic mice. Drug Exp Clin Res 1988; 14: 327-331.
7. Minuth JN, Musher DM, Thorsteinsson SB. Inhibition of the antibacterial activity of gentamicin by urine. J Infect Dis 1976; 133: 14-21.
8. Fromtling RA, Abruzzo GK, Gadebush HH. In vitro ef-fect of pH and glucose concentration on the antibacterial ac-tivity of norfloxacin in urine. Methods Find Exp Clin Phar-macol 1984; 6: 737-741.
9. Petti S, Renzini G, Tarsitani G. Effect of sucrose and glu-cose on the susceptibility of Streptococcus mutans to cepha-losporins. New Microbiol 1998; 21: 289-293.
