Trakya bölgesinde tarla farelerinde kültür, seroloji ve moleküler yöntemlerle Francisella tularensisin aranması

1

T.C.

TRAKYA ÜNİVERSİTESİ

TIP FAKÜLTESİ

TIBBİ MİKROBİYOLOJİ

ANABİLİM DALI

TRAKYA BÖLGESİ’NDE TARLA FARELERİNDE

KÜLTÜR, SEROLOJİ VE MOLEKÜLER

YÖNTEMLERLE FRANCISELLA TULARENSIS’İN

ARANMASI

(Uzmanlık Tezi)

Dr. Gülizar ÜNAL YILMAZ

2

TEŞEKKÜR

Uzmanlık eğitimimde ve tez çalıĢmamda yardımını esirgemeyen sayın hocam Prof. Dr. ġaban GÜRCAN’a, sayın hocalarım Prof. Dr. ġaban ÇAVUġLU’ya, Prof. Dr. Murat TUĞRUL’a, Prof. Dr. Nermin ġAKRU’ya, Doç. Dr. NeĢe AKIġ’a; saha çalıĢmasındaki yardımları için Biyoloji bölümünden sayın hocam Yard. Doç. Dr. Beytullah ÖZKAN’a ve moleküler çalıĢmalardaki desteği için Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji öğretim üyesi Prof. Dr. Aynur KARADENĠZLĠ’ye; ayrıca baĢta AraĢ. Gör. Bio. ġebnem BUKAVAZ olmak üzere tüm araĢtırma görevlisi ve laboratuvar personeli arkadaĢlarıma çok teĢekkür ederim.

3

İÇİNDEKİLER

GİRİŞ VE AMAÇ... 1

GENEL BİLGİLER ... 3

BAKTERİNİN MİKROBİYOLOJİK ÖZELLİKLERİ ... 9

TANI ... 11 KLİNİK ... 14 TEDAVİ... 16 VEKTÖRLER VE REZERVUARLAR ... 17

GEREÇ VE YÖNTEMLER ... 19

BULGULAR ... 33

TARTIŞMA ... 37

SONUÇLAR ... 51

ÖZET ... 52

SUMMARY ... 54

KAYNAKLAR ... 56

EKLER

1

SİMGE VE KISALTMALAR

DNA : Deoksiribonükleik asit

ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay

F. tularensis : Francisella tularensis

PCR : Polymerase chain reaction (polimeraz zincir reaksyionu)

1

GİRİŞ VE AMAÇ

Dünyada pek çok farklı yerde “tavĢan ateĢi”, “avcı hastalığı” “geyik sineği ateĢi”, “kene ateĢi”, “O’Hara Hastalığı”, “Francis Hastalığı” gibi isimlerle tanımlanan tularemi, dünyada ve ülkemizde görülen zoonotik hastalıklardan olup son yıllarda özellikle ülkemizde gittikçe daha fazla önem kazanmaya baĢlamıĢtır (1-3). Özellikle bakterinin biyolojik terör ajanı olması, tanı konusunda yaĢanan sorunlar, verilen yanlıĢ tedaviler ve son yıllarda ülkemizde olgu sayısının giderek artması tularemiyi daha önemli hale getirmiĢtir (4-7). Etkenin nereden bulaĢtığı yoğun araĢtırma konusu olmuĢ, dünyanın pek çok yerinde farklı kaynaklar suçlanmıĢtır. Bazı yerlerde kemiricilerle direk temas sonucu bakteri bulaĢırken, bazı bölgelerde bu hayvanların üzerinde yaĢayan keneler veya bu hayvanlardan kan emen çeĢitli sinekler suçlanmıĢ, bazı kaynaklarda solunum yoluyla bulaĢtan söz edilmiĢ, bazı bölgelerde ise kontamine suların kullanımı veya içilmesi sonucu bulaĢ olduğu kanaatine varılmıĢtır (6-11). Her ne suretle olursa olsun hastalığın yayılmasında ve bulaĢmasında kemiricilerin rolü açıktır. Yapılan gözlemlerde yağmurun çok yağdığı ve kemirici sayısının arttığı dönemlerde olgu sayısında artıĢ görüldüğü tespit edilmiĢtir. Bu da hastalığın döngüsünde kemiricilerin ne kadar önemli bir yere sahip olduğunu bize göstermektedir (6,8,11-14).

Bu tez çalıĢmasının amacı insanları tehdit eden tularemi hastalığının döngüsü içindeki tarla farelerinin tularemi için risk oluĢturup oluĢturmadığını göstermektir. Tarla farelerinde tularemi etkeninin varlığı; bu hayvanların karaciğer ve dalak dokularında kültür ve moleküler testlerle, serumlarında ise Francisella tularensis’e karĢı geliĢen antikorların varlığının araĢtırılmasıyla belirlenmeye çalıĢılmıĢtır. Bu çalıĢma sayesinde bölgemizdeki tarla

2

farelerinin bu hastalık için bir risk taĢıyıp taĢımadığı ve tularemi açısından riskli bölgelerin belirlenmesi hedeflenmiĢtir.

3

GENEL BİLGİLER

Anadolu’da çok uzun dönemlerden beri var olduğu bilinen tularemi hastalığı Türkiye’de ilk olarak 1936 yılında resmi olarak kayıtlara geçerek bildirimi yapılmıĢtır (15). Milattan önce 1400-1300 yıllarında Hititler döneminde Orta Anadolu’da günümüzde tularemi olduğu düĢünülen veba benzeri bir hastalığın varlığı bilinmektedir. Bu hastalığın savaĢlar döneminde Ortadoğu’dan geldiği düĢünülmektedir. Suriye, Mısır ve Lübnan civarında bu hastalıktan yöneticiler ve aristoklar da dahil birçok kiĢi ölmüĢ, özellikle Mısır’da merkezi yönetimler sarsılarak ülkeler kargaĢa içine girmiĢtir. Hastalığın Ģehrin kenar mahallelerinde oturan ve hayvanlarla yakın temas içinde olan bazı etnik gruplarda daha az görülmesi bu topluluklar üzerinde baskıyı arttırarak göçe zorlamıĢ, ülkelerin ve milletlerin yazgısı değiĢmiĢtir (16-18). Daha sonra hastalık gemiler, askerler ve kemiriciler vasıtasıyla Orta Anadolu’ya kadar gelmiĢtir (ġekil 1).

Hastalığın hayvanlar, sinekler ve keneler aracılığıyla insanlara bulaĢarak ateĢ, halsizlik ve boyunda ĢiĢlikler meydana getirdiği fark edilmiĢ, bu sebeple savaĢlarda askeri gücü kırarak birçok zarara sebep olmuĢtur. Bunu gören Hititler, Batı Anadolu’da kendilerine tehdit oluĢturan Arzava’lılara karĢı bu hastalığı kullanmayı planlamıĢ, bu ülke topraklarına hastalıklı koçları salarak Arzavalı’lardan daha güçsüz olmalarına rağmen iki yıl içinde savaĢı kazanmıĢlardır. Bu sebeple bu hastalığa “Hitit Vebası” da denmektedir. Tarihin ilk biyolojik terör ajanı da bu Ģekilde Anadolu’da kullanılmıĢtır. Bu dönemle ilgili pek çok yazıt Hitit ve Mısır tarihinde geçmektedir. Günümüzde yapılan araĢtırmalarda eski tarihlerde görülen bu hastalığın muhtemelen tularemi olduğu düĢünülmektedir. (17,18).

4

Şekil 1. Milattan önce 14. yüzyılda Ortadoğu’da tulareminin yayılımı. Yuvarlak içine

alınan bölge hastalığın muhtemel orjini. Oklar ise hastalığın yayılımını gösteriyor (17).

DÜNYADA TULAREMİ

Tularemi aslında çok eski tarihlerden beri dünyada mevcut olan bir hastalıktır. Esasen Kuzey Yarımküre’de görülür (2,19). Özellikle milattan önce 1400’lü yıllarda Ortadoğu’da birçok insan bu hastalık sebebiyle ölmüĢtür (18). Japonya’da ve Rusya’da 1800’lü yıllarda bilinen tularemi aslında 16. yüzyılda Norveç’te lemming denilen bir kemirici grubunun hastalığı olarak bilinmekteydi (20,21). Etken 1906’daki San Francisco depreminden sonra 1911-1912 yıllarında Amerika’nın Kaliforniya eyaletine bağlı Tulare bölgesinde Mac Coy ve Chapin tarafından ölü yer sincaplarından izole edilerek gösterilmiĢtir. Bu dönemde bakteriye Tulare bölgesinden izole edildiği için Bacterium tularense denmiĢtir (6,22). Ġlk insan olguları 1914 yılında Lamb ve Wherry tarafından bildirilmiĢtir (21). Ancak insanlar üzerinde geniĢ epidemiyolojik çalıĢmalar yapan, insanlardaki klinik tabloları ortaya çıkartan, farklı klinik tablodaki pek çok kiĢinin aynı hastalıktan muzdarip olduğunu belirten, hastalık için “tularemi” terimini ilk kullanan, enfekte tavĢan ve kemiricilerin etleriyle temas edenlerin hastalandıklarını ilk gözlemleyen, tanı için serolojik testleri bulan ve kan emen sineklerin bu

5

hastalıkta vektörlük ettiğini ilk belirten kiĢi Edward Francis’tir (20,23). Daha önceleri Brucella ve Pasteurella genusları içinde incelenmiĢ olan bakteri, 1947’de yeni bir genus içinde incelenmeye baĢlanmıĢ, Edward Francis’in yaptığı bu çalıĢmalar sebebiyle bu yeni genusun adı Francisella, bakterinin adı da Francisella tularensis olarak değiĢtirilmiĢtir. Edward Francis yaptığı bu çalıĢmalar sayesinde 1959 yılında Nobel ödülü almıĢtır (1,2,6,8).

Amerika’da bu hastalık tanımlandıktan sonra dünyanın pek çok yerinde de görülmeye baĢlanmıĢtır. Kuzey Amerika’nın pek çok yerinde, Orta Asya ülkelerinde, Rusya’da, Ġskandinav ülkelerinde, Balkanlarda ve Japonya’da pek çok tularemi olgusuyla karĢılaĢılmıĢtır (1,24). Özellikle Kuzey Amerika ve Ġskandinav ülkeleri tularemi açısından endemik bölgelerdir, Doğu Avrupa ve Rusya’da da salgınlar görülmektedir. Dünya genelinde en çok olgular bu ülkelerden bildirilmektedir. Yılda milyonda 0,5-5 insidansta tularemi olgusu görülen Amerika’da 1939 yılında 2291 kiĢiyi etkileyen büyük bir salgın meydana gelmiĢtir. Sovyetler Birliği’nde 1940’ta 100.000’i aĢkın kiĢinin etkilendiği bir salgın daha meydana gelmiĢtir (25). Almanya’da da 1950 yılında büyük bir salgın meydana gelmiĢ; Çek Cumhuriyeti, Fransa, Ġsveç, Finlandiya gibi ülkelerde de çok sayıda olgu bildirilmiĢtir. Özellikle Doğu Avrupa ülkelerinde ve Rusya’da 2. Dünya savaĢı sonrası prevelans artmıĢtır. Tüm dünyada görülme sıklığı artan tulareminin yayılımına bakacak olursak özellikle son 10 yıl içinde Balkan ülkelerinde görülen olgu sayısı artıĢı dikkati çekmektedir. Kosova’da 1999-2000 yıllarında savaĢ ortamının getirdiği etkiler sebebiyle salgınlar meydana gelmiĢtir. Bu salgınlarda toplam 327 kiĢi tularemi tanısı almıĢtır. Kosova’da 100.000 kiĢide 5.2 olan insidans oranı Avrupa’nın en yüksek değeridir. Bu ülkeyi Ġsveç 100.000 kiĢide 2.80, Finlandiya 1.19, Slovakya 1.0, Çek Cumhuriyeti 0.81, Norveç 0.42, Sırbistan-Karadağ 0.40, Macaristan 0.36, Bulgaristan 0.21, Hırvatistan 0.15 oranlarıyla takip etmektedir (8,24-26). Ġlginç olarak tularemiye Ġngiltere’de, Ġzlanda’da, Afrika’da, Güney Amerika’da ve Antartika’da rastlanmaz (22). ġu ana kadar Avustralya’dan F. tularensis’e bağlı iki olgu bildirimi olmuĢtur (27,28).

6

Şekil 2. Dünya’da tulareminin görüldüğü bölgeler (7).

Dünyada pek çok yerde görülen tulareminin son yıllarda artıĢ sebebinin iklim değiĢikliklerinden kaynaklandığı düĢünülmektedir. Küresel ısınma sebebiyle yıl içindeki ortalama sıcaklığın artması tulareminin döngüsünde çok önemli bir atağa sebebiyet vermiĢtir. Bununla ilgili Ġsveç’te yapılan bir çalıĢmada iklimde değiĢiklik olduğunda neler olabileceğini anlamak amacıyla bilgisayar ortamında iklim senaryosu geliĢtirilmiĢ, 2010’dan 2100 yılına kadar ortalama 2°C sıcaklık artıĢının hastalığın üzerinde nasıl bir etki yaratacağı hesaplanmaya çalıĢılmıĢtır. Yapılan bu çalıĢma sonunda olgu sayısının ve salgın oranının ne kadar artacağı çarpıcı bir çekilde gösterilmiĢtir (29).

Japonya’da 1932 yılında Çin ile savaĢ döneminde F. tularensis üzerinde biyoterör çalıĢmaları baĢlamıĢ, Amerika ve Rusya 1950’li yıllarda F. tularensis’i biyolojik silah programlarına almıĢlardır. Amerika ve Rusya’da streptomisine dirençli suĢların yanı sıra aĢıya dirençli suĢlar da üretilmiĢtir. Dünya Sağlık Örgütü 1969 yılında yaptığı açıklamada 50 kg F. tularensis bakterisinin toz hali aerosol olarak 5 milyon nüfuslu bir kentte 250 bin kiĢiyi etkileyeceğini, 19 bin ölüm yaĢanacağını bildirmiĢtir. 1972’de yapılan kongre sonrası Amerika’daki tüm stokların yok edildiği, bu tarihten sonra Amerika’nın sadece hastalığın immunolojisi, aĢı geliĢtirme ve bakterinin genomu üzerinde çalıĢmaya devam ettiği belirtilmiĢtir. Ancak Amerika biyoterör alanında çalıĢmalarını sürdürmektedir. Centers for

7

Disease Control and Prevention (CDC)’ın tanımına göre F. tularensis yayılım kolaylığı, yüksek mortalite ve morbidite oranı, sosyal parçalanmaya sebebiyet verme ve yakın sürveyans takibi gibi özelliklerinden dolayı Ģarbon, veba, çiçek, ebola, Junin hemorajik ateĢi, Lassa ateĢi, botulizm ile birlikte Kategori A’da yer alır (2,4,5,30,31).

TÜRKİYE’DE TULAREMİ

Türkiye’de ilk tularemi bildirimi 1936 yılında Trakya’da Kaynarca Deresi’ne çok yakın bir askeri birlikte olmuĢtur. Dr. Kemal Hüseyin Plevnelioğlu, Dr. Ömer Bican, Dr. Ġrfan Titiz ve Dr. Mustafa Fevzi Kurtaran bu olguların çoğunun Lüleburgaz Askeri Hastanesi’ne baĢvuran ve Kaynarca Dere’sinde yıkanma öyküsü olan askerlerin, daha az bir kısmının da birliğe yakın bölgelerde oturan ve aynı su kaynağını kullanan köylülerde olduğunu saptamıĢtır (15,32). Bundan dokuz yıl sonra Lüleburgaz’da tekrar salgın görülmüĢtür (9). Bu tarihler içinde Türkiye’nin birkaç yerinden daha (Doğu Anadolu’nun bazı yerleri, Tatvan, Konya) olgu bildirimleri olmuĢtur (33).

Türkiye’deki en büyük tularemi salgını 1953 yılında bildirilmiĢtir. AraĢtırmacı Ġbrahim Ethem Utku’ya göre 300 civarında, hastane kayıtlarına göre ise 154 olgunun bildirildiği bu salgın Antalya’nın Bademağacı Köyü’nde meydana gelmiĢtir (34).

1953-1988 yılları arasında sessiz kaldığı düĢünülen tularemi, 1988’de Bursa’nın Karacabey ilçesine bağlı birçok köyde yeni bir salgın olarak karĢımıza çıkmıĢtır (35). Bölgede yapılan araĢtırmada o dönemde salgın olan köylerde fare sayısının çok arttığı gözlemlenmiĢ, salgının kaynağının su olduğu düĢünülmüĢtür (36). Bu tarihten sonra günümüze kadar Bursa’da sporadik veya küçük salgınlar Ģeklinde tularemi olguları bildirilmeye devam etmiĢtir (37).

1997 yılında Ankara AyaĢ Yağmurdere Köyü’nde; 1998 yılında Bilecik Pazarcık Ahmetler’de; 1999’da Samsun Havza’da; 2000 yılında Düzce Akçakoca’da, Zonguldak’ta, Sinop YeĢilyurt’ta, Yalova’da; 2001 yılında Bolu Gerede Yazıkara Köyü’nde, bundan birkaç ay sonra aynı köyde ve bu köye çok yakın Nuhören Köyü’nde de salgınlar bildirilmiĢtir (8,38-41)

2002’de Balıkesir’de ve Balıkesir’e bağlı çeĢitli köylerde, 2004-2005 yıllarında Batı Karadeniz’de Zonguldak, Kastamonu ve Bartın’da, 2004 yılında Amasya Suluova’da, 2004-2005’te Kars’ta, 2004-2005’te Kocaeli Gölcük’te ve Edirne LalapaĢa Demirköy’de, 2005-2007’de Samsun Havza’da, 2009’da Çankırı ÇerkeĢ Kadıözü Köyü’nde, 2009-2010’da Sivas’ta, Sakarya’da, 2010’da Tekirdağ Hayrabolu Muzruplu Köyü ve Konya’daki salgınlar, 2011’de

8

Çanakkale’de görülen olgular bize etkenin ülkemizde yaygın bir Ģekilde var olduğunu göstermektedir (12,42-54). Hemen hemen tüm illerden olgu bildirilmeye baĢlanması da hastalığın ülke geneline yayılmaya baĢladığını bize göstermektedir (ġekil 3).

Şekil 3. Türkiye’de illere göre tularemi olgularının dağılımı (26).

Daha önce hakkında sağlıklı sayısal veriler elde edilemeyen tularemi 2005 yılında “BulaĢıcı Hastalıkların Ġhbarı ve Bildirim Sistemi Standart Tanı, Sürveyans ve Laboratuvar Rehberi”nde Grup C bildirimi zorunlu hastalıklar listesine girmiĢtir (6,8). Bu sayede ülkemizden daha sağlıklı epidemiyolojik veriler elde edilmeye baĢlanmıĢtır. Tularemi hastalarına ait veriler 2011 yılından itibaren tularemi için özel olarak hazırlanmıĢ sürveyans sistemine kayıt edilmektedir (54).

Türkiye’de 2005 yılında 431 tularemi bildirimi yapılmıĢ, sonraki üç yıl içinde olgu sayısında belirgin bir azalma dikkati çekmiĢtir. 2009’da olgu sayısı tekrar artarak 428’e kadar çıkmıĢ, 2010 yılında 1531, 2011’de 2151 olmuĢtur (ġekil 4) (8,26).

9

Şekil 4: Avrupa ve Türkiye’de görülen tularemi olgu sayılarının karşılaştırması (XXXV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, Aydın, 2012. Prof. Dr. Şaban Gürcan’ın “F.

tularensis ve tularemi hastalığının epidemiyolojisi” başlıklı sunumundan

alınmıştır).

BAKTERİNİN MİKROBİYOLOJİK ÖZELLİKLERİ

F. tularensis 1911’de ilk kez tanımlandığında ismine Tulare bölgesinden izole edildiği için Bacterium tularense denmiĢtir. Daha sonraki çalıĢmalarda ayrı bir cins olduğu düĢünülmüĢ ve insanlar üzerinde yaptığı çalıĢmalar sebebiyle Edward Francis’in adıyla anılması uygun görülerek ismi 1959 yılında F. tularensis olarak değiĢtirilmiĢtir. Yapılan genetik çalıĢmalar sonucunda Francisella’nın Brucella, Yersinia veya Pasteurella ile benzerliği bulunmadığı belirtilmiĢ, 2000 yılı Bergey’s Manual’de Thiotrichales alt sınıfına ait Proteobacteria γ-alt bölümünde, Francisella ailesinin tek cinsi olduğu bildirilmiĢtir (55,56). Francisella’nın tür düzeyinde ayrımı genom homolojilerinin yakın olması sebebiyle hala çok değiĢkenlik göstermektedir (57).

Francisella cinsinin içinde yer alan türlerden biri olan F. tularensis türünün dört alt türü mevcuttur. Bunlar:

F. tularensis subsp. tularensis (Tip A) F. tularensis subsp. holarctica (Tip B) F. tularensis subsp. mediasiatica F. tularensis subsp. novicida’dır (58).

991 710 962 662 589 1646 282 625 1685 557 508 568 1281 959 838 807

431

126

89

71

428

1531

2151

0

500

1000

1500

2000

2500

Avrupa Birliği

Türkiye

10

Tip A biovarının eski ismi F. tularensis subsp. nearctica, Tip B biovarının eski ismi ise F. tularensis subsp. palaeartica’dır (1).

F. tularensis’in alt türü olarak kabul edilen F. tularensis subsp. novicida’nın son çalıĢmalarda alt tür olarak değil tür olarak değerlendirilmesi gerektiği vurgulanmıĢ ancak bu konu henüz tam olarak açıklığa kavuĢturulamamıĢtır. Bazı kaynaklarda F. tularensis subsp. novicida, bazı kaynaklarda F. novicida olarak geçmesine rağmen hala F. tularensis’in alt türü olarak değerlendirilmektedir (57,59).

Francisella’nın diğer türü F. philomiragia 1959 yılında saptanmıĢtır. Bu tür önce Yersinia cinsi içinde incelenmiĢ ancak daha sonra Francisella cinsine ait bir tür olduğuna karar verilmiĢtir. F. tularensis’e göre daha az virulandır (60). Atlantik morinosunda F. philomiragia’nın alt türü kabul edilen F. philomiragia subsp. noatunensis bulunmuĢ (61,62), ancak daha sonra alt tür değil F. noatunensis olarak ayrı bir tür olduğuna karar verilmiĢtir (57). Morinolarda tanımlanan F. piscidida ise yine Francisella’nın türü olarak kabul edilmiĢtir (61,62). Son çalıĢmalarda ise F. hispaniensis ve F. guangzhouensis olmak üzere iki tür daha Francisella cinsine dahil edilmiĢtir (63,64). Böylece son düzenlemeler sonucunda Francisella cinsinin 6 türe ayrıldığı ifade edilmektedir (F. tularensis, F. philomiragia, F. piscidida, F. noatunensis, F. hispaniensis ve F. guangzhouensis) (65). F. japonica ise F. tularensis subsp. holarctica’nın biovarı olarak değerlendirilir (F. tularensis subsp. holarctica biovar japonica) (22). Ayrıca son yıllarda eritromisine olan duyarlılık dirençlilik durumuna göre F. tularensis subsp. holarctica’nın iki alt türü daha eklenmiĢtir (23).

Bu türlerin dünyadaki coğrafi dağılımına bakacak olursak en virulan suĢ olan ve intradermal 10 bakteriyle veya inhale formda alınan 25 bakteriyle bile hastalık yapabilme potansiyeli olan F. tularensis Tip A biovar sadece Kuzey Amerika’da görülür. Bu alttür ile meydana gelen klinik tablo diğer alttürlere ve türlere göre daha ağır seyreder ve ölümcül olabilir. Tedavi almayan olgularda ölüm oranı %5-60 arası değiĢir. Aynı türün daha az virulan olan Tip B biovarı daha çok Asya ve Avrupa’da görülür (8,23,66). Balkanlarda ve ülkemizde görülen salgınlar tip B biovar tarafından meydana gelmektedir ve bu salgınlarda tespit edilen suĢların Bulgaristan suĢlarına benzer olduğu bildirilmiĢtir (67). Bu biovarla meydana gelen hastalıkta ölüm oranı çok düĢüktür. Ülkemizde en sık görülen tularemi formu orofarengeal tularemi bu biovar tarafından oluĢturulur ve bu klinik form için enfeksiyon oluĢturma dozu 108 bakteridir (7). F. tularensis subsp. mediasiatica sadece Orta Asya’da Kazakistan ve Türkmenistan civarında görülür. F. tularensis subsp. novicida’nın kökeni ise Kuzey Amerika

11

olup bağıĢıklığı baskılanmıĢ olgularda görülebilmekteyken, Avustralya’da doğada da saptanmıĢtır (19,21,28).

F. tularensis Gram boyamada çok küçük ve soluk kokobasiller Ģeklinde görülür. Hatta bazı boyamalarda kok Ģeklinde de görülebilmektedir. Ġntrasellüler bir mikroorganizmadır. Boyutları yaklaĢık olarak 0.2-0.7 µm’dir. F. tularensis subsp. novicida’nın ve F. philomiragia’nın biraz daha büyük olduğu belirtilmektedir (1). Oldukça küçük olmasından ve Gram boyamada Gram negatif boyanmalarından dolayı doku, sıvı veya diğer klinik örneklerin direk mikrobiyolojik incelemesinde seçilmeleri oldukça güçtür. Bu nedenle tularemi düĢünülen materyallerden direkt mikroskobik inceleme yapmanın pratik açıdan pek bir önemi yoktur (68).

Francisella’ların katalaz reaksiyonu zayıf pozitif, F. philomiragia hariç diğer Francisella’lar oksidaz negatiftir. X ve V faktörlere ihtiyaç duymaz (1). Hareketsizdir ve sporsuzdur. Ekzotoksin salgılamaz (69). F. tularensis’te hidrojen sülfür (H2S) pozitiftir. Eosin

Metilen Blue Agar ve Mac Conkey Agar besiyerlerinde üremeyen Gram negatif bakterilerdendir. Brucella’dan ayrılan en önemli özelliklerinden bir tanesi üreazının negatif olmasıdır. Besiyerlerinde çok zor ürer, %5-10 karbondioksit (CO2)’li ortamda daha iyi ürediği

görülür. Üremeyi kolaylaĢtırmak için besiyerini sülfidril bileĢikleri (sistin, sistein isovitaleX, tiyosülfat) ile zenginleĢtirmek gerekir (1,2,69,70). Ancak F. tularensis subsp. novicida’nın ve F. philomiragia’nın sisteine gereksinim duymadan besiyerlerinde ürediği görülmüĢtür (28). Ayrıca F.tularensis subsp. novicida sukrozdan asit oluĢturmaz, F. philomiragia jelatini sıklıkla hidrolize edebilmesiyle F. tularensis’ten ayrılır (2). F. tularensis’in Tip A ve Tip B biovarı gliserol fermantasyonu ile ayrılabilir ancak unutulmamalıdır ki F. tularensis subsp. mediasiatica ve F. tularensis subsp. novicida da tip A biovardaki gibi gliserol fermentasyonu yapar (6).

Uzun zincirli yağ asiti kompozisyonu Francisella’nın diğer bakterilerden ayrılmasında kullanılır ancak Francisella alttür ayrımında yetersiz kalır. Francisella cinsi içinde türler ve alt türler ancak 16S rRNA sekans analizi gibi moleküler testlerle ayrılabilir (69,71).

TANI

Tularemi tanısı koyabilmek için öncelikle gerekli olan koĢul, hastalığın akla getirilmesidir. Klinik açıdan bruselloz, tüberküloz, pyojenik bakteri enfeksiyonları, streptokoksik tonsilliofarenjit, difteri, salmonelloz, yersinyoz, toksoplazmoz, kedi tırmığı hastalığı, enfensiyoz mononükleoz, Ģarbon, sporotrikoz, kandidoz, aktinomikoz, layĢmanyoz, lejyonelloz, sifiliz, lenfogranuloma inguinale, Ģankroid, herpes simpleks enfeksiyonu,

12

adenovirus enfeksiyonları, atipik pnömoni, maligniteler gibi birbirinden çok farklı pek çok hastalıkla karıĢabilen tulareminin laboratuvar tanısı dört baĢlık altında toplanabilir (6,19).

Kültür

Hastalığın tanısı için altın standart kültürdür. Moleküler yönden türler ve alttürlerin aydınlatılmasında da kültür çok önemli bir yer tutar. Ancak klinik örneklerden bakterinin kültürle izolasyonu oldukça güçtür (6,72). Kültürde etkenin üreme Ģansı %25’tir (6). Rutin besiyerlerinde üremediği için özel koĢullar ve ek kimyasallar eklenmiĢ besiyerleri gerekir. Zor üreyen bir bakteri olması, çok virülan bir mikroorganizma olması, yüksek oranda laboratuvar bulaĢı gibi bir riskin bulunması araĢtırmacıları tanı için baĢka testlere yönlendirmiĢtir (2,73).

Besiyeri olarak Francis besiyeri, Thayer- Martin besiyeri, Columbia besiyeri, cystein heart agar (CHAB), buffered charcoal yeast extract agar (BCYE), sisteinli çukulata agar gibi katı besiyerleri kullanılabilir (22,73). Besiyerleri içine zenginleĢtirmek amacıyla insan, tavĢan, at veya koyun kanı eklenebilir. Sıvı besiyerlerinin bakteriyi üretmek adına pek faydası yoktur. Ancak tiyoglikonatlı sıvı besiyerleri, brain heart infusion broth veya tripticase soy broth kullanılabilir (74,75). Floralı bölgelerden kültür iĢlemi yapılacaksa besiyeri hazırlanırken içine penisilin, polimiksin B, sikloheksimid eklenmesi bakterinin ayrımını kolaylaĢtırır (6,68). Klinik örneklerin laboratuarda iĢleme alınması 24 saatten fazla sürecekse buzdolabında transport besiyerinde bekletilebilir veya direkt olarak -80°C’de dondurulabilir. Serum örnekleri ise iĢleme alınana kadar bir hafta buzdolabında bekletilebilir. Daha uzun süre beklenmesi gerekiyorsa -20°C veya -80°C’de dondurulmalıdır (76). Kültürde üreme Ģansını arttırmak amacıyla klinik örnekler transport besiyerleriyle gönderilebilir (8). Bu Ģekilde üreme Ģansının %25’lerden %62’ye çıkartılabileceği gösterilmiĢtir (77). Amies ve Stuart transport besiyerleri karĢılaĢtırıldığında Stuart’a göre kömürlü Amies’te bakterinin daha uzun süre yaĢayabildiği saptanmıĢtır (73).

Seroloji

Kültürle tanı genellikle zor ve tehlikeli olduğundan dolayı tanı için baĢka testlere ihtiyaç vardır (6,8,72). Bunun için en düĢük maliyetli ve en pratik yöntem serumda antikor tayinidir. Günümüzde de tanı için en yaygın kullanılan yöntem budur (2,6,78). F. tularensis’e karĢı oluĢan antikorlar; mikroaglütinasyon, tüp aglütinasyon, lam aglütinasyon (hem serumdan çalıĢılabilir hem üreyen izolat değerlendirilebilir), hemaglütinasyon ve Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) testleri ile saptanabilir. Tüp aglütinasyon testi de sıkça uygulanıyor olsa da mikroaglütinasyon yöntemi hem uygulama hem de değerlendirme

13

kolaylığı ve daha az antijen kullanımı gerektirmesi sebebiyle tanı için çok daha fazla tercih edilir (6,7,19,79). Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı’nda 2005 yılından beri Bolu Gerede’den iki hastanın lenf bezi aspirasyon örneğinden üretilen F. tularensis kökenlerinden üretilen patentli tularemi antijeni kullanılmaktadır (79).

Hastalık bulgularının baĢlamasından 6-10 gün sonra serumda antikorlar saptanabilir. Aglütinasyonun en yüksek olduğu dönem hastalığın baĢlangıcından 4-7 hafta sonradır. Kanda antikorlar uzun yıllar kalabilir. Bu sebeple hastalığın tanısını koyarken yeni bir enfeksiyon mu yoksa geçirilmiĢ bir enfeksiyon mu karar vermek ve diğer tanıları da düĢünmek gerekir, bu yüzden hastadan belli aralıklarla alınan serum örneklerinde yapılan tularemi mikroaglütinasyon testinde titrenin dört kat artıĢı akut enfeksiyon tanısı için gereklidir (72,80).

Centers for Disease Control and Prevention (CDC)’nin tanımına göre 1/160 ve üzeri titreler tularemi açısından anlamlı kabul edilirken bazı araĢtırmacılara göre 1/80 ve üzeri titrenin tanı koydurucu özelliği olduğu bildirilmiĢtir. Hastalara yıllar sonra yapılan antikor kontrollerinde daha düĢük titrelerin de anlamlı kabul edilebileceği belirtilmiĢtir (6). Ancak ülkemizde Tularemi Saha Rehberi’nde belirtilen olgu tanımlarına göre aglütinasyon testlerinde anlamlı titrelerin 1/160 olduğu konusunda konsensüs vardır (7,8).

Moleküler Yöntemler

Kültürle etkenin üretilmesi zor ve laboratuvar bulaĢ riskinin yüksek olması sebebiyle tularemi tanısı daha çok kültür dıĢı yöntemlerle yapılır. Uygulama kolaylığı sebebiyle tanıda en sık kullanılan yöntem mikroaglütinasyon yöntemidir ancak tularemi antikorlarının hem Brucella, Proteus, Yersinia gibi bakterilerle olan çapraz reaksiyonları hem de antikorların genellikle ilk belirtilerden bir hafta sonra yükselmesinden dolayı daha hızlı ve daha doğru bir tanı yöntemi olan moleküler testler son yıllarda kullanılmaya baĢlanmıĢtır (72,81). Yara örnekleri, abse ve lenf bezi aspiratları, akıntıdan alınan sürüntüler veya bunun gibi birçok klinik örnekten yapılan polimerase chain reaction (PCR) tanı için oldukça faydalıdır (72). Real time TaqMan PCR ise diğer PCR tekniklerine göre daha avantajlıdır. Bu testte tul4, fopA, ISFtu2 ve 23kDa genleri kullanılır. Test 1-2 saat içinde çalıĢılıp Deoksiribonükleik asit (DNA)’e bağlanan boyalar sayesinde etkenin varlığı eĢ zamanlı olarak görüntülenebilir. Aynı yöntem kullanılarak sekans analizi ve tip tayini yapmak da mümkündür (82).

14 Direkt Floresan Testler

Fluorescein isothiocyanate (FITC) iĢaretli tavĢan antikorların kullanıldığı direkt floresan antijen (DFA) saptama yöntemiyle de tularemi tanısı koyulabilir. Klinik örneklerden hızlı tanı amacıyla yararlanılan bir testtir. ġüpheli tularemi olgularının tanısında ön tanı kriteri olarak kullanılır. Sadece bazı referans merkezlerde uygulanabilen bu testin duyarlılığı 106

cfu/ml’dir (71).

KLİNİK

Tularemi; ormanlık alanlarda çalıĢanlar, bu alanlarda yürüyüĢ yapanlar, avcılar, etle temas eden iĢte çalıĢanlar, kırsal alanda hayvanlarla yakın temas halinde yaĢayanlar, çiftçiler, laboratuvar çalıĢanları, veterinerler arasında daha fazla görülür (2,6,25,70).

Tularemi için klinik belirtiler bakterinin virülansına, miktarına, vücuda giriĢ bölgesine ve kiĢinin immunolojik yapısına bağlı olarak değiĢkenlik gösterir. Hiç bulgu saptanmayan sadece serolojik testlerde pozitiflik görülen olguların yanı sıra (12,37,40) sepsis ve ölüme kadar gidebilen değiĢik klinik bulgular meydana gelebilir (19,22). Asemptomatik tularemi oranı %4-19 arasında değiĢiklik gösterir (8). Türkiye’de Ģimdiye kadar 1936 döneminde Trakya Bölgesi’nde tularemiden bir olgunun öldüğü bildirilmiĢtir (83).

Bakteri vücuda girdikten 1 ile 21 gün sonra bulgular görülmeye baĢlar. Bu süre ortalama 3-5 gündür (6,19,22). Bakteri vücuda girdikten sonra bir süre o bölgede çoğalır. Daha sonra bu bölgeyi drene eden lenf nodlarına ulaĢarak çoğalmaya devam eder. Karaciğer, dalak, akciğer, plevra, böbrek, kemik iliği gibi birçok organı etkiler. Hastada ateĢ, terleme, halsizlik, baĢ ağrısı, kas ağrıları, iĢtahsızlık, boğaz ağrısı, boyunda veya vücudun herhangi bir yerinde ĢiĢlik ve bunun gibi nonspesifik bulgulara rastlanır. Bazen sadece ateĢ görülür. Aylarca bu Ģikayetler devam edebilir (19,75). ġiĢliklerin histopatolojik incelemesinde granülomatöz lezyon saptanır. Bu sebeple pek çok hastalıkla karıĢan tularemi en çok tüberküloz lenfadenit olarak tanı alır. Bu tanıyla streptomisin tedavisi alanlar tedavi açısından Ģanslı olsalar da tanıda meydana gelen bu karıĢıklık hastanın aylarca gereksiz birçok ilaç kullanmasına sebep olur (84).

Türkiye’de kadınlarda tularemi erkeklere göre 1.18 oranında daha fazla görülür (8). Dünya geneline bakılacak olursa erkeklerde daha fazla görülmektedir (31). Bunun sebebi ise Türkiye’de kadınların sularla daha fazla temas etmesi, evde veya ev çevresinde hayvan artıklarına daha yüksek oranda maruz kalmaları gösterilmektedir. Bugüne kadarki tularemi olgularına bakılacak olursa olguların çok azı 18 yaĢ altındadır. Bu da hastalığın genellikle

15

eriĢkinler üzerinde etki ettiğini düĢündürmektedir. Tularemi görülen kadın cinsiyette yaĢ ortalaması 38.7, erkeklerde ise 30.6 olduğu bildirilmiĢtir (8).

Tulareminin kliniği CDC olgu tanımına göre 7 farklı Ģekilde görülür (6). Bunlar: 1. Ülseroglandüler tularemi

2. Glandüler tularemi 3. Oküloglandüler tularemi 4. Orofarengeal tularemi 5. Ġntestinal tularemi

6. Pnömonik tularemi (primer plöropulmoner hastalık) 7. Tifoidal tularemi

Ülseroglandüler tularemi daha çok F. tularensis subsp. tularensis tarafından meydana gelir. Genelde kene, sivrisinek gibi böcek ısırıkları veya enfekte hayvanlarla temas öyküsü mevcuttur. Isırılan veya enfekte hayvanla temas eden bölgede önce papül oluĢur daha sonra bu papül ülser halini alır ve bölgesel lenfadenopati geliĢir. Dünya’da en sık bu tularemi formu görülür (6,19).

Glandüler tularemide herhangi bir papül ya da ülser olmaksızın izole lenfadenopati ve ateĢ vardır (6,19).

Oküloglandüler tularemi kontamine suyla temas sonrası ya da ellerle etkenin göze bulaĢtırılması sonucu oluĢur. Hastada Ģiddetli konjunktivit ve periorbital ödem görülür. Buna preauriküler lenfadenopati eĢlik eder. Konjunktivit dakriosistite kadar ilerleyebilir (6,19).

Orofarengeal tularemi de kontamine sularla ya da besinlerle iliĢkili tularemi formudur. F. tularensis subsp. holarctica alttürü ile iliĢkilidir. Ülkemizde görülen tularemi en sık bu formda karĢımıza çıkar. Hastada ateĢ ve boğaz ağrısı mevcuttur. Muayenede tonsillit, farenjit bulguları görülür. Ağız içinde, tonsiller üzerinde veya farenkste enflamasyon görülebilir. Ağrılı lenfadenopati de tabloya eĢlik eder. Lenf nodu süpüre olabilir (6,19).

Ġntestinal tularemi bulantı, kusma, ishal ve karın ağrısı ile karakterize bir tablodur (6). Pnömonik tularemi bakterinin solunum yoluyla alınması sonucunda meydana gelir. Nadiren tifoidal veya ülseroglandüler tularemi olgularında sepsis sonrası hematojen yolla da oluĢabilir. Laboratuvar bulaĢları sonucu da bu formda tularemi görülür (6,19,85).

Tifoidal tularemi sistemik bulgularla seyreden tularemi tablosudur. Etkenin giriĢ yeri belli değildir. Hastada yüksek ateĢ, üĢüme, titreme, Ģiddetli baĢ ağrısı, yaygın vücut ağrıları görülür. Hasta septik Ģoka, dissemine intravasküler koagülasyona (DIC) veya akut respiratuvar distrese (ARDS) girebilir hatta kaybedilebilir (6,19,86,87).

16

T.C. Sağlık Bakanlığı’nın tularemi için kabul ettiği olgu tanımı aĢağıdaki gibidir: ġüpheli olgu, klinik bulguları tularemiye uyan bir olguda aĢağıdakilerden en az bir tanesinin bulunması;

1. Son bir ay içerisinde tularemi bildirimi olan bir bölgeye seyahat etmek,

2. Son bir ay içerisinde tularemi açısından riskli temas öyküsü (doğadan su içmek veya kullanmak, kene ve benzeri artropod ısırığı, yabani hayvanlarla veya hayvan leĢleriyle temas),

3. Beta laktam antibiyotiklerin kullanımına rağmen yanıt vermeyen tonsillo farenjit. Olası olgu, Ģüpheli bir olguda aĢağıdakilerden en az bir tanesinin bulunması;

1. AĢı olmamıĢ veya önceden tularemi geçirmemiĢ bir olguda 1/160 ve üzeri titrede antikor varlığı,

2. Klinik örneklerde bakteri DNA pozitifliği,

3. Klinik örneklerde IFA, ELISA gibi incelemelerde pozitiflik.

Kesin olgu, Ģüpheli bir olguda aĢağıdakilerden en az bir tanesinin bulunması; 1. Klinik örneklerden etkenin izolasyonu

2. En az 10 gün arayla yapılan serolojik testlerde antikor titresinin en az dört kat artması (7).

TEDAVİ

Tularemi tedavisinde temel amaç etkenin vücuttan eradikasyonu, semptomların düzeltilmesi, lenf bezi süpürasyonunun önlenmesi, daha ağır klinik tablolara ilerlemenin ve sekellerin engellenmesidir (88).

Tulareminin tedavisi, baĢta aminoglikozitler olmak üzere, tetrasiklinler, kinolonlar ve kloramfenikol ile yapılır. Tedavide birinci seçenek olarak aminoglikozitler (streptomisin veya gentamisin), ikinci seçenek olarak tetrasiklin (doksisiklin) veya kinolonlar tercih edilir. Beta-laktamlar, makrolidler, linkozamidler ve kotrimoksazolün tularemi tedavisinde yeri yoktur (6,7).

Antibiyotik tedavisi ne kadar erken baĢlanırsa o kadar iyi sonuçlar alınır. Ülkemizde genellikle tularemi tanısı atlanarak baĢka hastalıklarla karıĢtığı için etkin tularemi tedavisi çok geç verilir. Bu da hastanın tedavisini güçleĢtirir. Tam iyileĢme sağlanabilmesi için hem etkin antibiyotiğin verilmesi hem de hastalığın erken döneminde tedavinin baĢlanması oldukça önemlidir (19,37,43,88).

17 VEKTÖRLER VE REZERVUARLAR

F. tularensis’in doğadaki döngüsü oldukça karmaĢıktır. Hangi hayvanların konak, hangilerinin mekanik vektör, hangilerinin biyolojik vektör olduğu konusu çok net değildir. Uzun dönemler boyunca doğada var olan tularemi 100’den fazla memeliyi ve bunun yanı sıra birçok kuĢ türünü, soğukkanlı canlıları ve artropodları etkiler. Endemik olan bir bölgede tularemi için belli bir kemirici popülasyonunun yanı sıra kene ve sinek popülasyonunun varlığı da dikkati çeker (14).

Tulareminin yayılımı, karasal döngü ve su döngüsü olmak üzere ikiye ayrılarak değerlendirilir (8,25). Karasal döngüde; küçük kemiriciler, yabani tavĢanlar ve artropodlar (Dermacentor, Amblyomma, Haemaphysalis ve Ixodes cinsi keneler) F. tularensis için çok önemlidir. Tularemi bu hayvanlarda genelde ölümcül bir tablo yaratır. Ancak bazı kemiricilerde belirgin bir hastalık tablosu oluĢmadan varlığını sürdürebilir. Bakteri, bu asemptomatik kemiricilerden diğer kemiricilere kene, sinek, sivrisinek gibi kan emici artropodlarla taĢınarak doğada varlığını sürdürür. Keneler, enfeksiyon odaklarının doğadaki kalıcılığını sağlaması açısından oldukça önemlidir. Hastalığı dıĢkılarıyla veya ısırmayla konağın dolaĢım sistemine bulaĢtırırlar. VahĢi hayvanlar arasındaki bulaĢ ve vahĢi hayvanlardan evcil hayvanlara (koyun, sığır, keçi, at, domuz, kedi ve köpek) bulaĢ da keneler ve kan emici sinekler aracılığıyla (mekanik vektör) olur. Bazı keneler etkeni vücudunda ömür boyu (1-2 yıl) taĢırlar (rezervuar). Ġnsanlarda keneye bağlı tularemi enfeksiyonları genelde yaz aylarında görülür. F. tularensis sineklerde iki hafta kadar canlılığını sürdürebilir. Amerika’da at sinekleri, geyik sinekleri ve Kuzey Avrasya’da sivrisinekler etkenin geçiĢi açısından önemlidir. F. tularensis subsp. holarctica’nın doğa döngüsünde su ile iliĢkili kemirgenler (kunduz, misk sıçanı, diğer sıçan türleri, tarla ve su fareleri, yabani tavĢan, sincap ve rakunlar) ana rezervuar olarak rol oynamaktadır (2,8,14,25,89). Avrupa’da F. tularensis’in en sık karĢılaĢılan taĢıyıcısı su sıçanı olarak bilinen Arvicola terrestris ve tarla faresi olarak bilinen Microtus arvalis’tir. Rattus rattus (siyah sıçan)’lar da etkeni taĢıyabilir. Rusya’da ise su sıçanı (Arvicola terestris), ev faresi (Mus musculus), tarla faresi (Microtus arvalis) ve Lepus cinsi yabani tavĢanlar en sık sebeptir. Kuzey Amerika’da ise Sylvagus cinsi tavĢanlar dikkati çekmektedir. Bu hayvanların çıkartıları, ölüleri veya etleri; bu hayvanların girdiği ve çıkartılarını bıraktıkları sular tulareminin bulaĢmasında baĢlıca etkendir. Avrupa’da kıĢ mevsiminde salgın olduğu dönemlerde tarla faresi ve bunun gibi kemirici popülasyonundaki artıĢ dikkat çeker. TavĢanların ise bu mikroorganizma ile nasıl karĢılaĢtığı tam olarak

18

bilinmese de farelerin otlar ve bitkiler üzerinde bıraktığı artıklarından etkilenerek hastalandıkları görüĢü hakimdir (14,90)

F. tularensis dıĢ ortam koĢullarına oldukça dirençlidir. Özellikle suda özgür yaĢayan amipler (Acanthamoeba castellani) bakterinin doğada yaĢamını sürdürebilmesi açısından önemlidir (14,91). Suda, toprakta, çamurda, bataklıklarda, hayvan atıklarında, samanlıklarda, dondurulmuĢ etlerde yıllarca canlı kalabilmektedir (7,8,20,21).

Ġnsanlar F. tularensis’in rastlantısal konağıdır. Birçok kuĢ türü, balıklar ve sürüngenler de rastlantısal konaktırlar (2,66). KuĢlarla ilgili çok veri elde edilemese de uzak mesafelere etkenin taĢınmasında ve tulareminin dünyaya yayılmasında rolleri olduğu düĢünülmektedir (92,93). Bazı bölgelerde kuĢlarla, kemiriciler ve tavĢanlar aynı keneleri taĢıyabilmektedirler. Bu sebeple etkenin doğadaki sürekliliğine katkı sağladıkları düĢünülmektedir (14).

Tulareminin sulardan kaynaklandığını ilk belirten kiĢi Miller’dir (94). Dr. Tahsin Berkin ve Dr. Talat Vasfi Özel 1936 ve 1937 yıllarında Trakya’da yaptıkları araĢtırmalar sonunda, bölgedeki tulareminin çoğunlukla su kaynaklı olduğunu düĢünmüĢlerdir. Askerleri garnizonun yakınındaki Kaynarca Deresi ve erlerin bu derede yıkanması, hastalığın daha çok dere çevresindeki köylerde görülmesi ve bu sularda yıkananlarda, pirinç tarlalarında çalıĢanlarda dikkati çekecek oranda daha sık görülmesi bu görüĢü desteklemiĢtir. Ancak ne sulardan yapılan çalıĢmalardan ne de doğadan toplanan kene, tavĢan gibi hayvanlardan sonuç alınamamıĢ, bakterinin hangi hayvanlarda mevcut olduğu ve suları nasıl kirlettikleri gösterilememiĢtir (32,83).

Sonraki yıllarda meydana gelen tularemi salgınlarında sularda etken varlığına dair kanıtlar elde edilmiĢ, ancak bunları kontamine eden hayvanlara veya diğer kaynaklara dair yapılan çalıĢmalarda olumlu bir sonuç alınamamıĢtır (6,8,12). Burada sunulan çalıĢmada Türkiye’de tularemi etkeninin insanlara bulaĢmasında önemli bir rol oynayan suların kontaminasyonunda farelerin potansiyel rollerinin ortaya çıkarılması amaçlanmıĢtır.

19

GEREÇ VE YÖNTEMLER

ARAŞTIRMANIN YERİ

Bu tez çalıĢması Trakya Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’nun 28.12.2011 tarihli 2011.11.09 karar no’lu onayı (Ek-1), 27.07.2012 tarihli Çevre ve Orman Bakanlığı Doğal Koruma ve Milli Parklar Genel Müdürlüğü’nün izni (Ek-2) ve Trakya Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Komisyonu (TÜBAP) tarafından 2012/108 numaralı proje desteği ile Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuarı, Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Memeli AraĢtırma Laboratuvarı ve Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı AraĢtırma Laboratuvarı’nda gerçekleĢtirildi.

ÇALIŞMA ŞEMASI 1. Hayvanların toplanması 2. Örneklerin tür tayini

3. Dokuların ve kanların alınması, serumların ayrılması 4. Kültür iĢlemleri

5. Seroloji testleri 6. DNA izolasyonu 7. Moleküler testler

HAYVANLARIN TOPLANMASI

ÇalıĢmaya baĢlamadan önce Trakya Bölgesi’ndeki köyler incelenerek hangi köylerin çalıĢmaya alınacağı belirlendi. Trakya Bölgesi’nde 2005 yılında salgın meydana gelen

20

Edirne’nin LalapaĢa ilçesine bağlı Demirköy, yine bu bölgede 2010 yılında en son salgının meydana geldiği Tekirdağ ili Hayrabolu ilçesine bağlı Muzruplu Köyü, 1936 yılında Türkiye’deki ilk tularemi olgularının bildirildiği ancak daha sonra hiç olgu bildirimi olmayan iki yerleĢim yeri olan Kırklareli Pınarhisar’a bağlı Kaynarca Beldesi ve Tekirdağ Saray’a bağlı Sinanlı Köyü çalıĢma kapsamına alındı. Hayvanların toplanması için yeterli sayıda Sherman tipi canlı yakalama kapanları Trakya Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü’nden temin edildi. Kapanlara fıstık ezmesi ile karıĢtırılmıĢ elma ve ekmek parçalarının yanı sıra farelerin soğuktan korunması için pamuk koyuldu (ġekil 5).

Şekil 5. Fare kapanlarının hazırlanması (Fotoğrafın yayınlanması için Yard. Doç. Dr. Beytullah Özkan’ın ve Prof. Dr. Şaban Gürcan’ın izni alınmıştır).

Köylerin sulak alanlarına, dere ve kuyu kenarlarına, ambarlara, depolara, yemliklere ve çalı içlerine kapanlar yerleĢtirildi. Bütün kapanların yerleĢtirildiği alanlar not alındı ve numaralandırıldı. Demirköy’e 38 adet, Kaynarca’ya 25 adet, Muzruplu’ya 44 adet ve Sinanlı’ya 19 adet olmak üzere toplam 126 kapan yerleĢtirildi (ġekil 6,7).

21 Şekil 6. Çalı içine yerleştirilen bir fare kapanı

Şekil 7. Kuyu kenarlarına yerleştirilen fare kapanları (Fotoğrafın yayınlanması için Yard. Doç. Dr. Beytullah Özkan’ın izni alınmıştır).

22

Köylere 2012 yılının Aralık ayında gidildi. Gidilen tarihte Demirköy’de hava sıcaklığı gece -5°C, gündüz 6°C, hava açık; Kaynarca’da hava sıcaklığı gece 7°C, gündüz 14 °C, hava az bulutlu; Muzruplu’da hava sıcaklığı gece 4°C, gündüz 9°C, hava bulutlu; Sinanlı’da hava sıcaklığı gece 5°C, gündüz 10°C, hava bulutluydu. Kapanlar kurulduktan sonra bir gece beklendi ve ertesi gün tekrar köylere gidildi. Kapanlar tek tek kontrol edilerek toplandı ve örnekler laboratuvara taĢındı.

ÖRNEKLERİN TÜR TAYİNİ

Yakalanan örneklerin tür tayinleri Trakya Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü’nden öğretim üyesi Yard. Doç. Dr. Beytullah Özkan tarafından yapıldı. Tür tayininde örnekler Beytullah Özkan’ın memeli müze koleksiyonu örnekleriyle karĢılaĢtırılarak dıĢ vücut ölçüleri (baĢ ve vücut uzunluğu, kuyruk uzunluğu, arka ayak uzunluğu, kulak uzunluğu) ve renklenme durumları (post rengi, göğüs lekesi varlığı/yokluğu ve geniĢliği, yan tarafta sırt ile karın renginin kesin veya geçiĢli olması) kullanılarak gerçekleĢtirildi (ġekil 8,9).

23

Şekil 9. Canlı olarak yakalanmış bir tarla faresi (Apodemus flavicollis)

DOKULARIN VE KANLARIN ALINMASI, SERUMLARIN AYRILMASI Canlı oldukları tespit edilen hayvanlar sırayla önce kapanlardan dikkatlice çıkartılıp Ģeffaf bir torba içine alındı. Torba CO2 ile ĢiĢirilerek hayvanın anesteziye girip girmediği

gözlemlendi. Derin soluk alıp vermenin baĢlaması ve hareketlerin tamamen ortadan kalkmasından hemen sonra hızlı davranılarak hayvanlar sınıf-2 güvenlik kabini içine alındı ve ekstremiteleri pensle kıstırılarak refleks kontrolü yapıldı. Refleks yanıtı alınmayan hayvanlar küçük iğneler yardımıyla operasyon tahtasına sabitlendi ve göğüs bölgesi iyotlu solüsyon ile silinerek göğüs boĢlukları steril bir biçimde açıldı. Refleksleri devam eden hayvanlara tekrar anestezi uygulandı. Anesteziye tamamen giren ve göğüs boĢlukları açılan hayvanların kalbinden kanları birkaç saniye içinde steril enjektör yardımıyla alındıktan sonra hayvanın hayati fonksiyonlarının tamamen durduğu gözlemlendi. Alınan kanlar santrifüj edilmek üzere önceden etiketlenmiĢ kuru steril tüplere aktarıldı. Ölümü gerçekleĢmiĢ hayvanın daha sonra karnı iyotlu solüsyon ile silindi ve steril bir biçimde açıldı. Önce karaciğer daha sonra dalak dokuları dikkatli bir Ģekilde steril olarak çıkartılıp dörder parçaya bölündü ve her bir parça önceden etiketlenmiĢ steril ependorf tüplerine koyuldu. Ölü olarak yakalanan hayvanlardan kan alınamadan direkt olarak karın boĢlukları steril bir biçimde açılıp karaciğer ve dalak

24

dokuları alındı, bu dokular yine dörder parçaya bölünerek etiketlenmiĢ ependorf tüplerine koyuldu. Her dokudan bir parça kültür için bir diğer parça da DNA izolasyonu için ayrıldı. Kalan diğer iki doku ise -80°C derin dondurucuda saklandı. Kanlar 5 dk 3500 rpm devirde çevrilerek serumları ayrıldı. Kanları ve dokuları alınan hayvanlar ve kullanılan tüm diğer kontamine malzemeler tıbbi atık torbalarında toplanarak kurallara uygun Ģekilde imha edilmek üzere tıbbi çöp kutularına atıldı (ġekil 10).

Şekil 10. Fare dokularının çıkarılması KÜLTÜR İŞLEMLERİ

Francis Besiyerinin Hazırlanması

1. Bir litre kapasiteli önceden steril edilmiĢ cam balon içine 900 ml distile su, 33,3 gr brain heart infusion broth (Acumedia, Neogen, USA), 0,9 gr L-cystein (BioChemica, Almanya), 9 gr D-glukoz (Merck, Almanya), 13,5 gr toz agar (Chem Pure, Kimetsan, Türkiye) koyuldu.

2. Hazırlanan karıĢım manyetik karıĢtırıcıda karıĢtırılarak içindeki maddelerin iyice çözünmesi sağlandı.

25

3. Daha sonra steril edilmek üzere 121°C’de 15 dk otoklavlandı.

4. Otoklavdan çıkarılan besiyeri 50°C’ye ayarlanmıĢ Ben Mari’ye koyulup sıcaklığının 50°C’ye yavaĢ yavaĢ inmesi beklendi.

5. Besiyeri hazırlanmadan önce Edirne Ticaret Borsası Et ve Et Ürünleri Entegre Tesisi’ne gidilerek bir koyunun juguler veninden steril enjektörle 50 ml koyun kanı alındı ve boncuklu steril balona aktarıldı.

6. Sürekli çalkalanarak defibrine edilen kan laboratuvara getirildi.

7. Laboratuvarda 5 ml koyun kanı Brucella açısından test edilmek üzere ayrıldı. Ayrılan bu 5 ml’lik kan, kuru bir tüpe aktarılarak 5 dk 3500 rpm devirde santrifüj edildi ve üstte kalan serum kısmından Rose Bengal testi yapıldı.

8. Herhangi bir aglütinasyon görülmemesi üzerine ayrılan 45 ml koyun kanı benmaride 50°C’ye kadar soğuyan besiyerlerinin içine karıĢtırıldı.

9. Hazırlanan besiyeri steril plastik petrilere kalınlığı 4 mm olacak Ģekilde eĢit olarak dağıtıldı. Besiyerleri soğuduktan sonra toplam iki besiyeri sterilite kontrolü açısından biri 37°C’lik normal etüve, diğeri 37°C’lik %5 CO2’li etüve kaldırıldı. Bir hafta

boyunca etüvlerde bekletilen bu besiyerlerinde herhangi bir üreme olmadı.

10. Üreme kontrolü için daha önce Bolu Gerede’de iki hastadan izole edilen ve -80°C derin dondurucuda saklanan F. tularensis suĢu kullanıldı.

11. Dondurucudan çıkarılan skimmed milk’e ekilmiĢ bakterinin yarısı bir besiyerine diğer yarısı da baĢka bir besiyerine dökülerek ekim yapıldı. Petrinin bir tanesi 37°C’lik normal etüve, diğeri de 37°C’lik %5 CO2’li etüve kaldırıldı. Her gün bir kez kontrol

edilen besiyerlerinin %5 CO2’li etüvde olanda daha belirgin olmak üzere üçüncü

günde üremenin baĢladığı gözlemlendi (ġekil 11). Kolonilerden Gram boyama yapıldığında üreyen bakterinin çok küçük Gram negatif koklar olduğu görüldü (ġekil 12). Katalaz testi zayıf pozitif, oksidaz testi ise negatifti.

26

Şekil 11. %5 koyun kanlı Francis besiyerinde üreyen F. tularensis kolonileri (37°C’de %5 CO2’li etüvde inkübe edilen kültürün 6. gündeki görünümü)

Şekil 12. %5 koyun kanlı Francis besiyerinde üreyen F. tularensis kolonilerinden yapılan Gram boyamanın mikroskoptaki görünümü (x1000)

27 Dokulardan Tularemi Kültürü

1. Sahaya çıkmadan bir gün önce hazırlanan %5 koyun kanı eklenmiĢ Francis besiyerleri bir gece boyunca ultraviyole (UV) ıĢık altında bekletildi.

2. Sahadan dönüldüğü günün akĢamı hayvan dokuları çıkartılıp kültür iĢlemine geçildi. 3. Kültür için ayrılan doku örnekleri (her hayvan için birer adet karaciğer ve dalak

dokusu) saklandıkları ependorf tüplerden sırayla alınıp sınıf-2 güvenlik kabini içinde steril küçük plastik zipli torbalar içine aktarıldı.

4. Torbaların içine 0.5 ml kadar brain heart infusion broth eklendikten sonra torbanın ağzı kapatılarak havanla dokunun tamamen ezilmesi yine sınıf-2 güvenlik kabini içinde sağlandı.

5. OluĢan süspansiyon iki adet Francis besiyerine eĢit Ģekilde aktarıldı ve steril halka uçlu disposible öze yardımıyla azaltma ekimi uygulandı.

6. Her bir besiyeri özel olarak isimlendirildikten sonra laboratuvar kazalarında olası bir kontaminasyonu önlemek amacıyla besiyerlerinin ağzı parafilm ile oksijenle teması kesilmeden kapatıldı.

7. Ekim yapılan bu iki Francis besiyerinin bir tanesi 37°C’lik normal etüve, diğeri de 37°C’lik %5 CO2’li etüve kaldırıldı.

8. Aynı iĢlem aynı hayvandan alınan dalak dokusu için de gerçekleĢtirildi. Böylece her hayvan için dört adet besiyeri kullanılarak toplamda 76 besiyeri ilk ekimler için kullanılmıĢ oldu.

9. Bir hafta boyunca hergün besiyerleri etüvden çıkartılıp tek tek incelendi ve F. tularensis kolonileri arandı.

10. Morfolojik olarak benzeyen kolonilerden önce Gram boyama yapıldı.

11. Gram negatif boyanan ve mikroskobik incelemede kokobasil olduğu saptanan bakteri kolonilerine katalaz ve oksidaz testleri yapıldı.

12. Katalazı pozitif oksidazı negatif olduğu belirlenen Ģüpheli Gram negatif kokobasil kolonilerinin karbonhidratları kullanma, gaz oluĢturma, fenilalanin dekarboksilaz, lizin dekarboksilaz, ornitin dekarboksilaz, üreaz enzim varlıkları, sitratı tek karbonhidrat kaynağı olarak kullanımı, hareket ve indol özelliklerine bakıldı.

SEROLOJİ TESTLERİ

Tularemi mikroaglütinasyon testleri patentli tularemi antijeni (patent no: TPE-2008 01623 B-ġaban Gürcan) ile çalıĢıldı. Onbir adet hayvan canlı olarak yakalanmasına rağmen

28

Kaynarca’dan yakalanan bir tarla faresinden cerrahi iĢlem sırasında kan alınamadığı için sadece on adet hayvandan serolojik inceleme yapılabildi.

1. Hayvanların kanlarının alındığı ve dokularının çıkarıldığı gün kanlar steril kuru tüplere alınarak 3500 rpm’da 5 dk santrifüj edildi ve serum kısımları ayrıldı.

2. Ayrılan serumlar etiketlenmiĢ ependorf tüplerine aktarıldıktan sonra testin yapılacağı güne kadar iki gece +4°C’de buzdolabında saklandı.

3. Testin yapılacağı gün serumlar bozdolabından çıkarıldı.

4. V plate’in on adet çukuruna 22,5 µl %0,9’luk serum fizyolojik koyuldu.

5. Bunların üzerine sırayla on adet hayvanın 2,5 µl serumu eklenerek 25 µl 1/10’luk dilüsyon hazırlandı.

6. Dilüe edilmiĢ serumların olduğu her bir kuyucuğa 25 µl tularemi antijeni eklendi ve pipetle iyice karıĢtırıldı.

7. Bu aĢamadan sonraki toplam 50 µl’lik 1/20 tarama dilüsyonu hazırlanmıĢ oldu. 8. 18-24 saat sonra sonuçlar gözle değerlendirildi.

9. Kaynarca’dan yakalanan bir adet farenin tularemi mikroaglütinasyon testinde Ģüpheli pozitiflik saptanması üzerine dilüsyon yeniden hazırlanarak 1/160’a kadar ilerletildi.

10. Aynı Ģekilde üzerlerine eĢit miktarda antijen eklendi ve test tekrar edildi.

DNA İZOLASYONU

1. Hayvanların kanlarının alındığı ve dokularının çıkarıldığı gün her hayvandan birer adet karaciğer ve birer adet dalak dokusu (19 adet hayvandan toplam 38 adet doku) DNA izolasyonu için ayrıldı ve bir gece +4°C’de buzdolabında saklandı.

2. Ertesi gün buzdolabından çıkarılan dokular steril petri içinde steril bistüri yardımıyla mekanik olarak küçük parçalara bölündü ve tekrar steril ependorflara alındı. 3. DNA izolasyonu için peq GOLD Tissue DNA Mini Kit (peqlab, Almanya) kullanıldı.

4. Ependorflara geri alınan küçük parçalara ayrılmıĢ doku parçaları üzerine kit içinden çıkan tissue lysis bufferdan 400’er µl koyuldu.

5. Daha sonra her bir tüpe 20’Ģer µl proteinaz K ve 15’er µl RNAse eklenerek yaklaĢık 1,5 saat 50°C ısı bloğunda bekletildi.

6. Bu süre boyunca tüpler 15 dk aralarla 10-15 sn vortekslenerek dokunun erimesi kolaylaĢtırıldı.

29

7. Süre sonunda bütün dokuların tamamen eridiği gözlemlendi.

8. Daha sonra tüpler ısı bloğundan alınarak 30 sn 10.000 rpm’de santrifüj edildi. 9. Üstte kalan (süpernatan) kısım önceden etiketlenmiĢ baĢka ependorflara aktarıldı. Dipte kalan çökelti tüple birlikte atıldı.

10. Süpernatanlı sıvıların olduğu tüplerin her birine 200 µl DNA binding buffer eklendi ve pipetle iyice karıĢtırıldı.

11. Ayrı bir kolon ve toplama tüpü hazırlandı ve etiketlendi.

12. Hazırlanan bu sıvıdan 750’Ģer µl alınarak kolonlara sırasıyla aktarıldı.

13. Ġki dakika 10.000 rpm’de santrifüj edilerek DNA’nın kolonda kalması, sıvının toplama tüplerinde birikmesi sağlandı.

14. Santrifüj iĢleminden sonra her tüp tekrar kontrol edildi, sıvısı tamamen toplama tüplerine geçmeyenlere santrifüj iĢlemi tekrarlandı. Bu iĢlem bir doku için en fazla üç kere tekrar edildi.

15. Toplama tüplerinde biriken sıvı ve tüp atıldı yeni toplama tüpleri hazırlandı. Kolonlar bu yeni toplama tüpleri içine yerleĢtirildi.

16. Kolonlara 650’Ģer µl DNA wash buffer koyuldu (DNA wash buffer, kit içinden çıkan DNA wash buffer stok solüsyonunun %96’lık etil alkolle 1’e 1,5 oranında karıĢtırılmasıyla elde edildi).

17. Bir dakika 10.000 rpm devirde santrifüj edildi.

18. Dipte kalan sıvı toplama tüpüyle birlikte atıldı ve yeni toplama tüpleri koyuldu. 19. Bu yıkama iĢlemi bir kez daha tekrar edilip aynı santifüj iĢlemi yapıldıktan sonra dipteki toplama tüpleri atılarak yeni toplama tüpleri koyuldu.

20. Kolonlar yeni toplama tüpleri üzerine yerleĢtirilerek herhangi bir sıvı koyulmadan iki dakika 10.000 devirde santrifüj edildi ve kolonlar kurutuldu.

21. Yeni ependorf tüpleri hazırlandı. Her biri tek tek etiketlendikten sonra kolonlar bu ependorflar içine oturtuldu.

22. Üzerlerine 200’er µl elution buffer eklendi ve üç dakika oda ısısında bekletildi. 23. Daha sonra her tüp bir dakika 6000 rpm’de santrifüj edilerek DNA’nın ependorflara geçmesi sağlandı.

24. Tüm ependorf tüplerinin dipleri tek tek kontrol edildi. Dibe tamamen sıvı inmemiĢ görülen tüplere santrifüj iĢlemi tekrarlandı.

25. Elde edilen yaklaĢık 160-180 µl’lik DNA’lar dört eĢit parçaya ayrılarak önceden etiketlenmiĢ küçük steril ependorflara aktarıldı.

30

26. Bunlardan birer parçası elektroforez için ayrıldı. Her doku için hazırlanan üçer adet diğer DNA’lar, moleküler testlerin yapılacağı güne kadar -80°C derin dondurucuda saklandı.

27. DNA izolasyonu %2’lik jel kullanılarak değerlendirildi (ġekil 13).

Şekil 13: DNA izolasyonundan sonra elektroforezde yürütülen doku DNA’larından bir kısmının görüntüsü

MOLEKÜLER TESTLER

Dokulardan tulareminin moleküler tayini, Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı AraĢtırma Laboratuvarı’nda yapıldı.

1. Ġçinde ISFtu2 genine yönelik primerlerin ve prob'un bulunduğu Türkiye Halk Sağlığı Kurumu’nun Tularemi Real Time PCR (RT TaqMan PCR) kiti kullanıldı (ġekil 14). 2. 200 µl’lik PCR tüpleri test öncesi otoklavda steril edildi.

31

4. 1.5 ml’lik ependorf tüpü içine her 4 örnek baĢına 30 µl KarıĢım A solüsyonundan, 30 µl KarıĢım B solüsyonundan, 30 µl KarıĢım C solüsyondan, 1 µl Hot Start DNA polimeraz koyuldu ve pipetle iyice karıĢtırıldı.

5. Her örnek baĢına 22.5 µl PCR karıĢımı PCR tüplerine dağıtıldı ve üzerlerine 2.5 µl doku DNA’sı eklendi. Reaksiyonlar 2,5 µl DNA içeren toplam 25µl volümde çalıĢıldı. 6. Amplifikasyon iĢlemleri Exicycler™ 96 Quantitative Real-Time PCR System’de gerçekleĢtirildi (ġekil 15).

7. PCR döngüsü 95°C de 10 dakika denaturasyon sonrasında 40 siklus 95°C de 15 saniye, 60°C’de 1 dakika Ģeklinde uygulandı.

8. Pozitif kontrol olarak F. tularensis NCTC 10857’in 10 kat dilüsyonları, negatif kontrol olarak Pseudomonas DNA’sı kullanıldı.

32

Şekil 15. Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuvarı’ndaki Exicycler™ 96 Quantitative Real-Time PCR System

33

BULGULAR

Tez çalıĢmasına ait araziden örnek temin aĢamasının kıĢ dönemine denk gelmesi ve olumsuz hava koĢullarından dolayı 126 adet kapandan sadece 19’unda tarla faresi yakalanabildi. Demirköy’e 38 fare kapanı kuruldu. Bunlardan 3 tanesinde fare yakalanabildi, fare yakalama oranı 3/38 (%7.89) olarak hesaplandı. Kaynarca’da 25 adet kapan kuruldu, 12’sinde fare yakalandı. Fare yakalama oranı 12/25 (%48) olarak hesaplandı. Muzruplu’da 44 fare kapanı kuruldu, 2 fare yakalanabildi. Fare yakalama oranı 2/44 (%4.54) olduğu görüldü. Sinanlı’ya 19 fare kapanı yerleĢtirildi, 2 tanesinde fare yakalanabildi. Fare yakalama oranı 2/19 (%10.52) olarak bulundu. Sonuç olarak bu 19 tarla faresinin üçü Demirköy’den, onikisi Kaynarca’dan, ikisi Muzruplu’dan, ikisi Sinanlı’dan yakalandı (Tablo 1).

Tablo 1. Köylere kurulan kapan ve yakalanan fare sayıları

Köyler Kurulan Kapan Sayısı Yakalanan Fare Sayısı Yakalama Oranı (%)

Demirköy 38 3 7.89

Kaynarca 25 12 48

Muzruplu 44 2 4.54

Sinanlı 19 2 10.52

Toplam 126 19 15.07

Demirköy’den yakalanan üç farenin ikisi sarı boyunlu orman faresi (Apodemus flavicollis Melchior, 1834), biri Makedonya ev faresi (Mus macedonicus Petrov & Ruzic,

34

1983) olarak tespit edildi. Apodemus flavicollis’lerden biri erkek diğeri diĢi cinsiyetteydi. Mus macedonicus olan fare ise erkek cinsiyetteydi. Yakalanan her üç fare de ölüydü. Kaynarca’dan yakalanan oniki farenin ikisi ev faresi (Mus musculus Linnaeus, 1758), beĢi Mus macedonicus, diğer beĢi de Apodemus flavicollis olarak tanımlandı. Mus musculus’ların her ikisi de erkek, beĢ Mus macedonicus’un üçü erkek ikisi diĢi, diğer beĢ Apodemus flavicollis ise ikisi erkek üçü diĢi olarak saptandı. Kaynarca’dan yakalanan bu oniki farenin ikisi ölü diğer onu canlıydı. Muzruplu’dan Apodemus flavicollis türüne ait iki erkek tarla faresi yakalandı. Bunlardan biri ölü diğeri ise canlıydı. Sinanlı’dan yakalanan iki farenin biri Apodemus flavicollis türüne ait bir diĢi, diğeri ise Mus macedonicus türüne ait bir erkekti ve her ikisi de ölü olarak yakalandı. Toplamda 19 adet tarla faresinin onu Apodemus flavicollis, yedisi Mus macedonicus, ikisi ise Mus musculus’tu. Bu 19 tarla faresinin onbir tanesi canlı sekiz tanesi ölü olarak yakalandı. Yine 19 tarla faresinin onikisi erkek, yedisi ise diĢiydi.

Tablo: 2. Yakalanan hayvanlara ait tür, cinsiyet ve canlılık durumu

No Yakalandığı Köy Tür adı Cinsiyet Ölü/Canlı

1 Demirköy Apodemus flavicollis Erkek Ölü

2 Demirköy Apodemus flavicollis DiĢi Ölü

3 Demirköy Mus macedonicus Erkek Ölü

4 Kaynarca Mus musculus Erkek Canlı

5 Kaynarca Mus macedonicus Erkek Canlı

6 Kaynarca Apodemus flavicollis Erkek Canlı

7 Kaynarca Mus macedonicus Erkek Canlı

8 Kaynarca Mus macedonicus DiĢi Ölü

9 Kaynarca Apodemus flavicollis DiĢi Canlı

10 Kaynarca Mus macedonicus DiĢi Canlı

11 Kaynarca Apodemus flavicollis Erkek Ölü

12 Kaynarca Mus macedonicus Erkek Canlı

13 Kaynarca Mus musculus Erkek Canlı

14 Kaynarca Apodemus flavicollis DiĢi Canlı

15 Kaynarca Apodemus flavicollis DiĢi Canlı

16 Muzruplu Apodemus flavicollis Erkek Canlı

17 Muzruplu Apodemus flavicollis Erkek Ölü

18 Sinanlı Apodemus flavicollis DiĢi Ölü

35 KÜLTÜR SONUÇLARI

Farelerin her birinden alınan karaciğer ve dalak dokularından yapılan kültürde 13 karaciğer ve 11 dalak örneğinde üreme belirlendi. Kültürde üreyen kolonilerden yukarıda tanımlandığı Ģekilde isimlendirme iĢlemleri yapıldığında besiyerlerinde üreyen bakterilerin hiçbiri F. tularensis değildi. Üreyen kolonilerin tamamının Enterobacteriacea ailesi üyelerinden olduğu belirlendi.

SEROLOJİ SONUÇLARI

Yakalanan 19 adet tarla faresinden onbir tanesi canlı olmasına rağmen cerrahi iĢlem sırasında Kaynarca’dan yakalanan bir farenin kanı alınamadığı için sadece on adet hayvandan serolojik inceleme yapılabildi. Testin uygulanmasından 18-24 saat sonra sonuçlar gözle değerlendirildi. Testin yapıldığı V platelerin hepsinde diplerinde çökelti olduğu görüldü ve testlerin negatif olduğu gözlemlendi. Kaynarca’dan yakalanan bir farenin tularemi mikroaglütinasyon testinde Ģüpheli pozitiflik saptanması üzerine ileri dilüsyonlar da hazırlanarak test tekrar edildi. Ertesi gün yapılan değerlendirmede bu farenin de seroloji sonucunun negatif olduğu görüldü.

MOLEKÜLER TEST SONUÇLARI

On dakika 95°C de denaturasyon iĢlemi sonrasında 95°C de 15 saniye, 60°C’de 1 dakika Ģeklinde düzenlenen 40 döngülük Tularemi RT TaqMan PCR testi sonucunda iki adet pozitiflik tespit edildi. Bu sonuçların her ikisi de Kaynarca’dan yakalanan iki adet farenin dalak dokusuna aitti. Bu farelerden birisi Mus macedonicus türüne ait bir diĢi fareydi ve canlı olarak yakalanmıĢtı. Diğeri ise Apodemus flavicollis türüne ait bir erkek fareydi ve ölü olarak yakalanmıĢtı. Bu farelerin karaciğer dokularında ve diğer tüm hayvan dokularında pozitiflik tespit edilmedi (ġekil 16).

36

Şekil 16. Pozitif kontrollerle birlikte pozitif saptanan doku DNA’larının PCR eğrileri (1: 105 cfu/ml pozitif kontrol, 2: 104 cfu/ml pozitif kontrol, 3: 103 cfu/ml pozitif kontrol, 4: 102 cfu/ml pozitif kontrol, 5: 101 cfu/ml pozitif kontrol, 6: Fare dalak doku DNA’sı, 7: Fare dalak doku DNA’sı

Kantitasyon amacıyla PCR testi esnasında çalıĢılan F. tularensis NCTC 10857’in 10 kat dilüsyon sonuçları ile fare dokularından izole edilen DNA sonuçları karĢılaĢtırıldığında Mus macedonicus türüne ait olan canlı diĢi farenin dalak dokusunun 103 cfu bakteri, Apodemus flavicollis türüne ait olan ölü erkek farenin dalak dokusunun 104 cfu bakteri içerdiğitespit edildi (ġekil 16). ÇalıĢmanın baĢında farelerden çıkarılan karaciğer ve dalak dokuları dörde bölünmüĢ, PCR için bu parçalardan sadece bir tanesi çalıĢmaya alınmıĢtı. Bu sebeple canlı diĢi farede 4x103 _{cfu/dalak, ölü erkek farede 4x10}4

cfu/dalak bakteri olduğu saptandı.