GİRİŞ
İpekböceğinde ovaryum politrofik tipteki 4 uzun ovariolden oluşmuştur. Her ovariol germ hücrelerinin çoğalması ve foliküllerin şekillenmesiyle oluşan germarium ile foliküllerdeki yumurta sarısı proteinlerinin oluştuğu ve koryogenezin gerçekleştiği vitellarium-dan meyvitellarium-dana gelmektedir [1].
Böceklerde görülen sentrolesital tip yumurtanın özelliği bol mik-tarda vitellüs içermesidir. Oositlerde depolanan yumurta sarısı pro-teinlerinin embriyoların gelişiminde başlıca besin kaynağı olduğu bildirilmiştir [2,3].
Birçok böcek türünde, hemolenfteki bazı proteinler gelişen oositlerin yumurta sarılarıyla seçici olarak birleşerek, total yu-murta proteinlerinin %70-90’ını oluşturmaktadır [4,5,6]. Vitello-genezde gerekli olan bu proteinler sadece ergin dişilerin yumurta-larında bulunduğu için vitellojeninler, vitellojenik dişi proteinleri veya dişiye özel proteinler olarak adlandırılmaktadırlar [7,8,9]. Vitellojeninler, ovarioller dışında sentez edilen özel bir grup pro-teinin genel adı olup, birçok böcekte, iki veya daha çok alt bi-rimli büyük oligomerik glikolipofosfoproteinlerden oluşmaktadır [8,9,10,11,12,13,14].
Bombyx mori’de vitellojenin, larva-pupa deri değişimi sıra-sında dişilerin yağ cisimcikleri hücreleri tarafından sentezlenerek hemolenfe verilmektedir [7,15]. Sentez sonrası etkili mekaniz-malarla tüm hemolenf proteinleri tutularak sadece seçilen vitel-lojeninler oosite alınmaktadır [1,10,11]. Vitellinler, böceklerde yumurta yapılanmasında yumurta sarısı proteinlerinin başlıca bileşeni olarak kabul edilmekte [16,17] ve olgun yumurtaların ürünü olarak gelişen oositlerde vitellojeninlerin birleşimini içer-mektedirler [9].
Vitellojeninlerin doğal moleküler ağırlıklarının 210.000-652.000 dalton arasında değiştiği belirtilmektedir [1,12,14,18].
Yumurta sarısı proteinleriyle birleşen vitellojeninlerin oluş-turduğu vitellin kompleksi ise 400.000-600.000 dalton moleküler ağırlığa sahiptir. Vitellin %1-14 karbohidrat ve %7-16 lipid içe-ren bir glikolipoproteindir ve aynı vitellojeninlerde olduğu gibi çözülebilir yumurta sarısı proteinlerinin %60-90’ını meydana getirmektedirler [8].
İpekböceği Bombyx mori’nin vitellojenini, her biri sırasıyla ağır zincir ve hafif zincir olarak adlandırılan farklı alt birimli iki
İpekböceği (Bombycidae: Bombyx Mori)’nin Farklı Genomik İçerikli Yumurtalarında Vitellin
Proteini Özelliklerinin Araştırılması
Gamze TURGAY İZZETOĞLU1 Beria FALAKALI MUTAF2
1Ege Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Zooloji Anabilim Dalı, 35100 Bornova-İzmir 2Akdeniz Üniversitesi, Su Ürünleri Fakültesi, Temel Bilimler Bölümü, 07059 Yerleşke-Antalya
Özet
İpekböceği (Bombyx mori) yumurtalarından, haploid, diploid ve özel uygulamalarla poliploid yumurta elde edilebilmektedir. Bu çalışmanın amacı; genomik özelliklere sahip yumurtalarda yumurta sarısı proteini vitellini karşılaştırmaktır. Bursa İpekböcekçiliği Araştırma Enstitüsü (BİAE)’den temin edilen yumurtaların farklı genomik ölçüt ve fi zyolojik aşamalarında olanlarından ekstraktlar hazırlayıp, toplam protein miktarlarına bakılmış ve yumurta sarısı proteini olan vitellin standardına göre PAGE yöntemiyle vitellin fenotipleri incelenmiştir. Oluşturulan yumurta gruplarında iki bant halinde gözlenen vitellin proteini bakımından önemli bir farklılığa rastlanmamıştır. Çok az farklı olmak koşuluyla bazı gruplarda daha yoğun bazı gruplarda ise az yoğun ikinci bantların belirmesi, bu proteinin embriyonik gelişim sırasında kullanıldığına dair bir fi kir vermektedir. Yapılan çeşitli uygulamalara karşın fenotipik farklılıkların az olması, vitellinin yumurtada oldukça kararlı bir yapıda bulunduğunu ve bu nedenle benzer çalışmaların daha önceki safhalarda yani daha vitellogenez aşamasında yapılması gerektiğine işaret etmektedir.
Anahtar Kelimeler: Bombyx mori, yumurta, poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE), vitellin.
A Comperative Study of The Vitellin Protein Phenotypes of The Silkworm
(Bombycidae: Bombyx Mori) Eggs With Different Genomic Content
Abstract
The eggs of silkworm (Bombyx mori), are naturally diploid or haploid and, are easily inducible into polyploidy. The present work deals with the comparison of yolk protein, vitellin, of the eggs with different genomic contents. The eggs obtained from Silkworm Research Institute of Bursa (BIAE) manipulated to make them differ in genome size and physiological conditions, were homogenized to measure total amount of proteins and especially to scan their vitellin phenotypes by means of PAGE. There were two bands of vitellin standart solution but there observed no eminent differences on the samples. Only slight variations on the density of second band of vitellin were postulated as a reference to the utilization of these yolk proteins during the embryonic development. Those small dispairments of the phenotypes, although reckoning with the large array of manipulations, suggest that vitellin reaches stability in amount after uptake into the egg. So, similar survey should be carried on much earlier, during vitellogenesis.
Key words: Silkworm, egg, polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), vitellin.
*Sorumlu Yazar Geliş Tarihi: 07 Mayıs 2008
molekülden meydana gelen 440kDa moleküler ağırlıklı bir tetramerdir [15].
İpekböceği’nin vitellojenini ile vitellini moleküler özellikleri bakımından birbirinden güçlükle ayırt edil-mektedir. Çünkü her ikisinin de moleküler ağırlığı hemen hemen aynıdır ve her ikisi de iki alt birimden oluşmak-tadır [3].
Vitellojeninler ve vitellinler farklı elektroforez yön-temleri kullanılarak birçok türde tanımlanmıştır. Mevcut yöntemler arasından, PAGE yumurta sarısı proteini ön-cüsü ve son ürünü hakkındaki çalışmalar için birçok yön-den oldukça yararlı olup, PAGE ile proteinlerin yüklerine ve boyutlarına göre ayrıldıkları belirtilmektedir [19].
Mevcut kaynaklarda bilhassa bu proteinlerin sentez mekanizma ve depolanma aktiviteleri üzerinde duruldu-ğu ancak fizyolojik ve genetik açıdan ele alınmadığı gö-rülmüştür. O nedenle bu çalışmada PAGE yöntemi kul-lanılarak, ipekböceği Bombyx mori haploid, diploid ve poliploid yumurtalarının eldesi ile bu yumurtaların farklı fizyolojik aşamalarında ekstraktlar hazırlanarak, protein miktarları ve temel yumurta sarısı proteini olan vitellinin elektroforetik görünümünün karşılaştırılması ve embri-yonik gelişimde bu proteinin fizyolojik katkısının öğre-nilmesi temel amaçtır.
MATERYAL VE YÖNTEM İpekböceğinin Yetiştirilmesi
Kültür odasının kireç ve %3’lük formaldehit ile steri-lizasyonu yapılmıştır. İpekböceğinin normal gelişmesi ve
besleme için gerekli optimum 25±1°C sıcaklık, yaklaşık
%70 nem, hava sirkülasyonu gibi kültür odası koşulları sağlanmış [20,21], kullanılacak malzemeler de sterilize edilmiştir.
Çalışma materyalini oluşturan evcil ipekböceği
Bombyx mori hibrid yumurtaları Bursa İpekböcekçiliği
Araştırma Enstitüsü (BİAE)’nden temin edilmiştir. Yu-murtadan çıkan larvaların beslenmeleri için Ege Üniver-sitesi Kampüsü’ndeki dut ağaçlarının yaprakları kullanıl-mıştır [20,21].
Ekstraktların Hazırlanması
Aynı miktarlarda ependorf tüplerine alınan yumurtalar Lityum-Borat ve Tris-Sitrat (9:1) (pH 8.2) karışımından 0.5ml ve 0.43M sükrozdan 0.5ml (ekstrakt tamponu) ko-nularak, homojenizatörde parçalanıp, yumurtaların tüm içeriklerinin yumurta dışına çıkmaları sağlanmıştır [22]. Bu şekilde hazırlanan materyal daha sonra kullanılmak üzere -20°C’deki soğutucuda saklanmıştır. Kullanılma-dan bir saat önce soğutucuKullanılma-dan oda sıcaklığına çıkarılan homojenatlar 30 dakika +4°C’de 14.000rpm’de santrifüj-lenerek, süpernatantlar önceden numaralandırılmış ayrı ependorf tüplerine alınmıştır.
Uygulamalar
a) Haploid (partenogenetik) yumurta eldesi ve iş-lemleri
Haploid yumurta eldesi için çalışmada denenen yön-temler, incelenen kaynaklarda önerilen uygulamalardır.
• Yumurtalar doğrudan kozadan çıkan dişinin ovaryu-mundan alınıp, ekstraktı hazırlanmıştır (1H).
• İki farklı dişi kelebeğin ovaryumlarından alınan yu-murtalar oda sıcaklığında karanlıkta (2H) ve aydınlıkta (3H) 48 saat bekletilip 46°C’deki sıcak suda 18 dakika tutulduktan sonra ekstraktları hazırlanmıştır.
• Yine iki farklı dişi kelebekten alınan yumurtalar karanlıkta (4H) ve aydınlıkta (5H) +5°C’de 4-8 gün buz-dolabında bırakılma sonrasında, oda sıcaklığında 4 saat bekletilmiştir. Daha sonra 46°C’deki sıcak suda 18 dakika tutulup, ekstraktları yapılmıştır [23,24] (Çizelge 1).
b)Diploid yumurta eldesi ve işlemleri
Kozadan çıkan dişi ve erkek kelebekler cinsiyet ayırı-mı yapıldıktan sonra loş bir ortamda çiftleşmenin olması için erken saatlerde karton kağıtlar üzerine alınmışlardır. Karanlıkta tutulan çiftlerden erkek kelebekler
öğle saatlerinde ayrılmış, dişi kelebeklerin yumurta bırakmaları sağlanmıştır.
• Döllenmiş dişinin ilk yarım saat içinde bıraktığı yu-murtalardan ekstrakt hazırlanmıştır (1D).
• Döllenmiş dişinin 2-3 saat içinde bıraktığı yumurta-lardan ekstrakt hazırlanmıştır (2D).
• Döllenmiş iki dişi kelebeğin bıraktıkları yumurtala-rın 18-24 saat oda sıcaklığında bekleme sonrasında diya-pozları kırdırılmış ve bir dişiye ait yumurtalardan hemen ekstrakt hazırlanmış (3D), diğer dişiye ait yumurtaların ise 1 hafta gelişimlerine izin verilme sonrasında ekstraktı hazırlanmıştır (4D).
• BİAE’den gelen 1.döl yumurtalardan (diyapozlu) eks-trakt hazırlanmıştır (5D) (Çizelge 1).
c)Poliploid yumurta eldesi ve işlemleri
Çiftleştirilmiş dişilerin bıraktığı yumurtalara gruplar halinde yumurta bırakımı bitirinceye kadar devam edil-miştir.
•-10°C’de 24 saat bekleyen yumurtalardan ekstrakt hazırlanmıştır (1P).
•-10°C’de 24 saat bekledikten sonra 24 saat de oda sıcaklığında gelişimlerine izin verilme sonrasında diya-pozu kırdırılan yumurtalardan ekstrakt hazırlanmıştır (2P).
•-10°C’de bir hafta bekleyen yumurtalardan ekstrakt hazırlanmıştır (3P).
•-10°C’de bir hafta bekledikten sonra 24 saat de oda sıcaklığında gelişimlerine izin verilme sonrasında
diya-pozu kırdırılan yumurtalardan ekstrakt hazırlanmıştır (4P) (Çizelge 1).
d)Diyapoz kırdırılması
Döllenmiş dişinin bıraktığı yumurtalar en az 18-24 saat sonra HCl ve saf su ile yoğunluğu 1.075’e ayarlanan
46°C’deki solüsyon içerisinde 5 dakika bekletilerek
di-yapozları kırdırılmıştır. Daha sonra yumurtalar 10 dakika akar su altında asidinden arındırılıp ekstrakt hazırlığına geçilmiştir [23,27] (Çizelge 1).
Protein Tayini
Lowry metoduna göre benzer uygulama ürünü
olduk-ları için seçilen 1H, 3H, 2D, 5D, 1P ve 2P grupolduk-larında toplam protein tayini yapılmıştır [28].
Elektroforez Yönteminin Uygulanması
Örneklere %3 ve %7’lik akrilamid içeren iki jel PAGE uygulanmıştır. Elektroforez sırasında sürekli tampon sis-temi (0,05M Tris, 0,38M Glisin, pH 8.9) kullanılmıştır. Örnekler eşit hacimde ekstrakt tamponu ile birlikte jele yüklenmiş, elektroforez işlemi yaklaşık 30mA 10 dakika ve 45mA’de 4-5 saatte gerçekleştirilmiştir. Protein bantla-rı Coomassie Brillant Blue R-250 (Sigma, St Louis, MO, USA) ile 1,5 saat süreyle boyanmıştır. Boyanan jeller %5 asetik asit ve %10 metanol ile hazırlanan solüsyon içeri-sinde boya uzaklaşıncaya kadar yıkanmıştır [29]. Mole-küler işaretleyici olarak vitellin proteini (Sigma/V-3001) kullanılmıştır. Elektroforez işlemi Biogen marka ve jel boyutları 18x16x0.15 olan cihaz ile gerçekleştirilmiştir. İşlem sonunda jellerin fotoğrafları çekilmiş ve değerlen-dirmeye alınmıştır.
BULGULAR
Çalışmada, ipekböceği Bombyx mori’nin (her uygula-ma için ayrı bir dişi kelebeğin yumurtaları kullanılarak) dişi kelebeklerinden haploid için doğrudan ovaryumdan alınan yumurtalar (Şekil 1), diploid ve poliploid için ise önceden hazırlanmış kağıtlar üzerine kelebeklerin yapış-tırdıkları yumurtalar (Şekil 2) kullanılmıştır.
Şekil 1. Yumurtaların ovariol tüplerinde dizilimleri.
Şekil 2. Kağıt üzerine bırakılmış yumurta topluluğu.
Diploid ve poliploid yumurtalar serozal hücrelerin bo-yutlarına göre ayırt edilmiştir (Şekil 3).
Şekil 3. Diploid (d) ve poliploid (p) yumurta farkı.
a) Protein Tayini Bulguları
Haploid, diploid ve poliploid grupların birbirine benzer uygulamalar yapılmış yumurtalarına uygulanan
Lowry metoduna göre toplam protein tayininden elde
edilen sonuçlar; haploid grubu yumurtaların yüksek oranda protein konsantrasyonuna sahip olduğunu
gös-Çizelge 1. Haploid, diploid ve poliploid yumurtalarla oluúturulan gruplar Haploid yumurtalar
24°C’de
bekletme bekletme 5°C’de
Diploid yumurtalar Poliploid yumurtalar Yumurta
gruplarÕ Do÷rudan ekstrakt
KaranlÕk AydÕnlÕk KaranlÕk AydÕnlÕk saat2-3 18-24 saat 1 hafta 24 saat 24°C 1 hafta -10°C 1 hafta -10°C + 24 saat 24°C Diyapoz kÕrdÕrma 1H + - 2H + + 3H + + 4H + + 5H + + 1D + - 2D + - 3D + + 4D + + 5D + - 1P + - 2P + + 3P + - 4P + +
termektedir. Diploid ve poliploid grubu yumurtaların hemen hemen birbirine eşit fakat haploid grup yumur-taların içerdiği protein konsantrasyonlarına göre yarıya yakın oranda daha düşük protein konsantrasyonuna sahip olduğu belirlenmiştir (Çizelge 2, Şekil 4).
Çizelge 2. Lowry metoduna göre toplam protein tayini sonuçları. Örnek Grup No Ortalama Absorbans ± Standart Sapma Ortalama Konsantrasyon ± Standart Sapma 1 H 0,688 ± 0,002 0,1392 ± 0,0006 3 H 0,617 ± 0,015 0,1226 ± 0,0034 2 D 0,367 ± 0,012 0,0647 ± 0,0029 5 D 0,304 ± 0,060 0,0500 ± 0,0142 1 P 0,333 ± 0,018 0,0566 ± 0,0043 2 P 0,311 ± 0,006 0,0516 ± 0,0015 0,0000 0,0200 0,0400 0,0600 0,0800 0,1000 0,1200 0,1400 0,1600 1 H 3 H 2 D 5 D 1 P 2 P Konsantrasyon (mg)
Şekil 4. Toplam protein tayini sonuçlarının grafikte gösterimi.
b)Elektroforez Bulguları
-Haploid yumurta grupları arası karşılaştırmalar Doğrudan ovaryumdan alınıp, ekstraktları hazırlanan (1H) yumurtalarla, uygulama yapılmış diğer haploid gru-bu yumurtalar arasında önemli bir farklılığa rastlanma-mıştır (Şekil 5). Şekilde, standart olarak alınan yumurta-da bulunma yüzdesi oldukça yüksek olan vitellin proteini iki bant halinde gözlenmektedir.
Virjin kelebeklerin uterusundan doğrudan alınıp ekstrakt hazırlanan yumurtalar (1H) dışındaki gruplara uygulanan farklı yöntemler sonrasında ekstraktları hazırlanan gruplar arasında vitellinin, benzer bantlar şeklinde belirdiği ve yo-ğunluk farklılığının olmadığı bulunmuştur (Şekil 5).
-Diploid yumurta grupları arası karşılaştırmalar Çiftleşmeyi takiben elde edilen yumurtalardan bekle-meksizin ekstraktları oluşturulan (1D) ve birkaç saat geç-tikten sonra ekstraktları hazırlanan (2D) gruplarının vitel-lin bakımından büyük benzerlik gösterdiği belirlenmiştir (Şekil 6).
Diyapozu kırdırılmış yumurtaların oluşturduğu 3D grubunun yoğunluğunun 4D grubuna göre daha yoğun vitellin bantına sahip olduğu saptanmıştır (Şekil 6).
Diyapoza girmiş yumurtaların oluşturduğu 5D grubu-nun ekstraktlarıyla ise çok silik bir bant oluştuğu gözlen-miştir (Şekil 6).
-Poliploid yumurta grupları arası karşılaştırmalar -10˚C’de 1 gün bekletilen yumurtaları içeren (1P ve 2P) gruplar arasında farklar belirgin olarak görülmüş-tür (Şekil 7). 1P grubu yumurtalara ait silik, 2P grubu yumurtalarda ise belirgin bir vitellin b bandın oluştuğu görülmektedir.
Şekil 5. Oluşturulan Bombyx mori haploid yumurtalarının farklı
gruplarında vitellin proteinin karşılaştırılması, a; vitellinin ağır alt birimi, b; vitellinin hafif alt birimi, Vt; vitellin proteinine ait moleküler işaretleyici.
Şekil 6. Elde edilen Bombyx mori diploid yumurtalarının farklı
gruplarında vitellin proteinin karşılaştırılması, a; vitellinin ağır alt birimi, b; vitellinin hafif alt birimi, Vt; vitellin proteinine ait moleküler işaretleyici.
Şekil 7. Oluşturulan Bombyx mori poliploid yumurtalarının farklı
gruplarında vitellin proteinin karşılaştırılması, a; vitellinin ağır alt birimi, b; vitellinin hafif alt birimi, Vt; vitellin proteinine ait moleküler işaretleyici.
-10˚C’de 1 hafta bekletilen yumurtalardan elde edilen (3P ve 4P) gruplar göz önünde bulundurulduğunda, 3P grubu yumurtaların daha koyu, 4P grubu yumurtaların ise daha açık bir vitellin (b) bandı oluşturduğu belirlen-miştir (Şekil 7).
-10˚C’de kısa ve uzun süre beklemeli gruplardan benzer uygulamalar yapılmış olanların kendi aralarında karşılaştırılması sonucunda 1P grubu yumurtaların 3P grubu yumurtalara göre, 2P grubu yumurtaların ise 4P grubu yumurtalara göre daha koyu ikinci vitellin bantları oluştuğu belirlenmiştir (Şekil 7).
-Haploid, diploid ve poliploid gruplar arası karşı-laştırmalar
Çalışmanın temelini oluşturan 3 ana sınıfın yumurta-larından seçilen 1H ve 3H, 2D ve 5D, 1P ve 2P grupla-rında karşılaştırma yapılmış ve elektroforez sonucu bo-yanan jelde beliren vitellin proteinine ait olan özellikle ikinci bantlar, 1H ve 2P gruplarında en belirgin, geriye kalan gruplarda ise normal şekilde bulunmuştur (Şekil 8). TARTIŞMA
Böceklerde yumurta hücresi koryon, seroza ve vitellüs içeriği ile karakterize edilmektedir. Vitellüs içeriğini vitello-jeninler denilen yumurta sarısı proteinleri oluşturmaktadır.
İpekböceğinde vitellogenin ve vitellinin moleküler özellikleri bakımından birbirlerine benzerlik gösterdiği bulunmuştur. Her ikisinin de moleküler ağırlığı hemen hemen aynıdır. Vitellojenin sırasıyla ağır zincir ve hafif zincir olarak adlandırılan farklı iki alt biriminden meyda-na gelmektedir [18].
Şekil 8. Lowry metodu ile toplam proteinleri ölçülmüş gruplar arasında
vitellinin karşılaştırılması, a; vitellinin ağır alt birimi, b; vitellinin hafif alt birimi, Vt; vitellin proteinine ait moleküler işaretleyici.
İpekböceğinde proteinlerin sentez mekanizmaları ve depolanma aktiviteleri konusunda ayrıntılı çalışmalar ya-pılmıştır [1,3,9,13,14,18].
Haploid, diploid ve poliploid yumurta grupları top-lam protein miktarları açısından karşılaştırıldıklarında haploid grupların diğer gruplara oranla daha yüksek pro-tein konsantrasyonuna sahip olduğu gözlenmiştir. Bu du-rumun, diploid ve poliploidlerde yumurta proteinlerinin embriyonik gelişim sırasında harcanmasına paralel ola-rak ortaya çıktığı düşünülmektedir.
Vitellin standardı, poliakrilamid jel elektroforezinde genelde silik iki bant halinde gözlenmiştir. Bu bantlardan anoda daha yakın olan ağır alt birimi, katoda yakın olan ve daha hızlı yol alan hafif alt birim olarak değerlendi-rilmektedir.
Haploid yumurtalarda gerçekleştirilen farklı uygulama-lar sonrasındaki karşılaştırmauygulama-larımız grupuygulama-ların kendi içle-rinde benzerlik gösterdiğini, gelişen embriyoların proteini kullanmaları sonucu bant yoğunluğunun az görülmesine neden olduğu tahmin edilmektedir. Ayrıca gruplar üzerinde vitellin bandının görünümünde karanlık veya aydınlık uy-gulamasının önemli bir etkisi bulunmamıştır. Çünkü bu du-rum gelişen embriyoların proteini kesin olarak kullanması nedeniyle yoğunluğun azalmasına neden olmuştur. Çünkü bu durum gelişen embriyoların proteini kesin olarak kullan-ması nedeniyle yoğunluğun azalkullan-masına neden olmuştur.
Diploid grubu oluşturan bir dişi ve bir erkek kelebe-ğin çiftleştirilmesiyle elde edilen diyapoz öncesi, diyapo-zu kırdırılmış ve diyapoza girmiş yumurtaların karşılaş-tırılması sonucunda diyapoz öncesi grupta (1D ve 2D)
diğerlerine göre daha az yoğun vitellin bantı, diyapozu kırdırılmış gruplarda (3D ve 4D) ise daha yoğun vitellin bantlarının olması embriyonik gelişim aşamalarının takibi bakımından önemlidir. Çünkü elde edilen fenotipler diya-poza girmiş yumurtalarda gelişimin belli bir safhadan son-ra durmasıyla protein kullanımının da durdurulabileceğini desteklemektedir. 3D grubunda yumurtada ovipozisyon dışında herhangi bir gelişim olmamıştır. 4D grubu yumur-talarda embriyonik gelişim başlamış, mezoderm ve germ tabakalarının oluşumu gerçekleşmiştir. 4. günden itibaren gerçekleşmekte olan embriyonik hareketlenmenin başla-dığı blastokinezin tamamlanmış olması yumurta sarısı, amniyon ve serozanın hızlı bir şekilde besin olarak tüke-timinin gerçekleşmesiyle vitellin yoğunluğunun azaldığı, bant yoğunluğunun azalışı ile paralellik göstermektedir (Şekil 6).
BİAE’den gelen yumurtalarda (5D) bant yoğunluğu-nun az olması yumurtaların laboratuvarımıza ulaşıncaya kadar ortam koşulları nedeniyle doğal olarak diyapozları-nın kırılmış ve embriyonik gelişimlerinin başlamış olabi-leceğini düşündürmektedir. Bu grupta elde edilen fenotip, diyapoza girmiş yumurtalarda gelişimin belli bir safhadan sonra durmasıyla (embriyogenezin 40. saati) protein kulla-nımının da durdurulabileceğini desteklemektedir.
Poliploid grup yumurtalar arası karşılaştırmalarda kısa süreli soğuk uygulaması yapılan gruplarda (1P ve 2P) daha koyu vitellin bantlarının gözlenmesi, soğuk şo-kunun vitellin kullanımı üzerindeki etkilerinin daha ay-rıntılı olarak araştırılması gerektiğini ortaya çıkarmıştır. Kısa süre soğuk şoku sonrasında oda sıcaklığında bekle-tilip diyapozu kırdırılarak, gelişime bırakılan gruplarda vitellin bant yoğunluk farkının (2P) belirlenmesi embri-yonun gelişim için büyük serozal hücrelerini kullanması sırasında yumurta proteinlerinin harcanmasından kay-naklanabileceğine bağlanmaktadır. Uzun süreli soğukta tutmanın (3P ve 4P) ise protein yapısını bozucu yönde bir etki olduğu varsayılmaktadır.
Son olarak haploid, diploid ve poliploidler arasında benzer uygulamalar yapılmış gruplar arası karşılaştırma-larda farklı fizyolojik uygulamalar sonucu elde edilen haploid, diploid ve poliploid yumurtalar içinde haploid-ler ile poliploidhaploid-ler arasında birer grubun benzer yoğun-lukta ve her üçüne ait bazı gruplarda benzer yoğunyoğun-lukta vitellin bantlarının gözlenmesi, her gruba ait alt gruplar arası karşılaştırmaların daha sağlıklı sonuçlar verdiğini düşündürmektedir.
Sonuç olarak; bu çalışmanın poliakrilamid jel elektro-forezi yöntemi kullanılarak, ipekböceği Bombyx mori yu-murtasındaki proteinlerin neler oldukları, hangi seviyede ayrıldıkları, benzer veya farklı allelik formlarının mevcut olup olmadığı, yumurta gelişimi açısından yumurtanın fizyolojik durumuyla bağlantılı ifadelenişlerinde kalitatif ve kantitatif bir farklılığın bulunup bulunmadığının
araş-tırılmasına ışık tutacak bir ön çalışma kapsamında olma-sı önemlidir. Oluşturulan yumurta gruplarında vitellin proteini bakımından genom seviyesinde genel olarak bir farklılığa rastlanamaması, yumurtada vitellinin kararlı bir yapıya ulaştığını ve beklenilen farklılıkların oogenez-de, larval veya pupal safhalarda, belki de larva-pupa deri değişimi sırasında yağ cisimciği hücrelerinde olabilece-ğini düşündürmektedir. Vitellin proteini kullanımlarında kritik dönemlerin olabileceği ileri sürülmektedir.
TEŞEKKÜR
Bu çalışma E.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri 99 Fen 019 no’lu proje kapsamında desteklenmiştir.
KAYNAKLAR
[1]. Raikhel A.S., Dhadialla T.S. 1992. Acumulation of yolk proteins in insect oocytes. Annu. Rev. Entomol., 37:217-251.
[2]. Wojchowski D.M., Parsons P., Nordin J.H., Kunkel J.G. 1986. Processing of pro-vitellojenin in insect fat body: A role for high-mannose oligosaccharide. Developmental Biology, 116:422-430.
[3]. Yano K., Sakurai M.T., Watabe S., Izumi S., Tomino S. 1994a. Structure and expression of mRNA for vitellogenin in Bombyx mori. Biochimica Et Biophysica Acta, 1218:1-10.
[4]. Hagedorn H.H., Kunkel J.G., Wheelock G. 1978. The specifi city of an antiserum against mosquito vitellogenin and its use in a radio-ımmunological precipitation assay for protein synthesis. J. Insect Physiol., 24:481-489. [5]. Elliott R.H., Gillott C. 1979. An electrophoretic study of
proteins of the ovary, fat body, and haemolymph in the migratory grasshopper Melanoplus sanguinipes. J. Insect Physiol., 25:405-410.
[6]. Engelmann F. 1986. Endocrine regulated insect vitellogenesis: A synthesis. Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division) Advaces in Invertebrate Reproduction, 4:31-42.
[7]. Hagedorn H.H., Kunkel J.G. 1979. Vitellogenin and vitellin in insects. Ann. Rev. Entomol., 24:475-505. [8]. Ziegler R., Engler D.L., Bartnek F., Van Antwerpen R.,
Bluesteın H.A., Gilkey J.C., Yepiz-Plascencia G.M. 1996. A new type of higly polymerized yolk protein from the cochineal insect Dactylopius confusus. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 31:273-287.
[9]. Mahamat H., Hassanali A., Ferenz H. 1997. Vitellogenin titres in normal and accelerated maturation of gregarious-phase Schistocerca gregaria. Comp. Biochem. Physiol., 116b(4):447-451.
[10]. Giorgi F., Cecchettini A., Locci M.T., Masetti M., Bradley J.T. 1995. A fat body-derived protein is selectively sulfated during transit to ovarian follicles in stick insect Carausius morosus. Developmental Biology, 167:379-387.
[11]. Giorgi F., Cecchettini A., Locci M.T., Masetti M., Peccatori M. 1997. Native vitellins are modifi ed during ovarian development in the stick ınsect Carausius morosus (Br.).
Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 36:335-348.
[12]. Giorgi F., Bradley J.T., Nordin J.H. 1999. Differential vitellin polypeptide processing in insect embryos. Micron, 30:579-596.
[13]. Winter C.E., Penha C., Bluementhal T. 1996. Comparison of a vitellogenin gene between two distantly related rhabditid nematode species. Mol. Biol. Evol., 13(5):674-684.
[14]. Sappington T.W., Raikhel A.S. 1998. Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenins reseptors. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 28:277-300.
[15]. Yano K., Sakurai M.T., Izumi S., Tomino S. 1994b. Vitellogenin gene of the silkworm, Bombyx mori: Structure and sex-dependent expression. Febs Letters, 356:207-211.
[16]. Masetti M., Giorgi F. 1989. Vitellin degration in developing embryos of the stick insect Carausius morosus. J. Insect Physiol., 35(9):689-697.
[17]. Lee J.M., Nishimori Y., Hatakeyama M., Bae T., Oishi K. 2000. Vitellogenin of the cicada Graptopsaltria nigrofuscata (Homoptera): Analysis of its primary structure. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 30:1-7.
[18]. Hiremath S., Eshita S. 1992. Purifi cation and characterization of vitellogenin from the gypsy moth, Lymantria dispar. Insect Biochem. Molec. Biol., 22(6):605-611.
[19]. Engelmann F. 1979. Insect vitellogenin: identifi cation, biosynthesis, and role in vitellogenesis. Adv. Insect Physiol., 14:49-108.
[20]. Shimizu M., Tajima Y. 1972. Handbook of Silkworm Rearing, Agricultural Technique Manual 1, Fuji Publishing Co., LTD., Tokyo, Japan.
[21]. İpekböcekçiliği ve Dutçuluk Seminer Notları, 1985. İpekböcekçiliği Araştırma Enstitüsü Yayınları: 82, Bursa.
[22]. Kai H., Hasegawa K. 1972. Studies on the mode of action of the diapause hormone with special reference to the protein metabolism in the silkworm, Bombyx mori L. III. Effects of acid-treatment and detergents on “Esterase A” in diapause eggs. J. Sericult. Sci. Japan, 41(4):253-262. [23]. Tazima Y. 1978. The Silkworm: An Important Laboratory
Tool., Kodansha Tokyo.
[24]. Shinbo H., Kitazawa T., Imanishi S., Kiguchi K., Murakami A. 1991. Preservation method of genetic stocks of the silkworm (Bombyx mori): Conditions of ovary freezing, thawing and parthenogenetic activation. Bull. Natl. Inst. Seric. Entomol. Sci. 2:47-63.
[25]. Astaurov B.L. 1969. Experimental polyploidy in animals, Annual Review of Genetics. 3:99-126.
[26]. Kawamura N. 1979. Polyploidy and size of serosa nuclei and cells in eggs of the silkworm, Bombyx mori. J. Sericult. Sci. Japan, 48(1):77-85.
[27]. Takei R., Nakagaki M., Kodaira R., Nagashima E. 1990. Factor analysis on the pathenogenetic development of ovarian eggs in the silkworm, Bombyx mori L.
(Lepidoptera: Bombycidae). Appl. Ent. Zool., 25(1):43-48.
[28]. Lowry O.H., Rosbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193:265-275.
[29]. Hames B.D. 1998. Gel Electrophoresis of Proteins. A Practical Approach, 3rd edition, Oxford University Press.
