ORTA VE DOĞU KARADENĠZ BÖLGESĠ DOĞAL FLORASINDAKĠ BÖĞÜRTLEN GENOTĠPLERĠ
ARASINDAKĠ BĠYOÇEġĠTLĠLĠĞĠN MOLEKÜLER BELĠRTEÇLERLE SAPTANMASI
Derya KARAKOÇ
Yüksek Lisans Tezi
Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı DanıĢman
Yrd. Doç. Dr. Çetin ÇEKĠÇ 2011
T.C.
GAZĠOSMANPAġA ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ BAHÇE BĠTKĠLERĠ ANABĠLĠM DALI
YÜKSEK LĠSANS TEZĠ
ORTA VE DOĞU KARADENĠZ BÖLGESĠ DOĞAL
FLORASINDAKĠ BÖĞÜRTLEN GENOTĠPLERĠ ARASINDAKĠ
BĠYOÇEġĠTLĠLĠĞĠN MOLEKÜLER BELĠRTEÇLERLE
SAPTANMASI
Derya KARAKOÇ
TOKAT 2011
TEZ BEYANI
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahribat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
ii ÖZET Yüksek Lisans Tezi
Orta ve Doğu Karadeniz Bölgesi Doğal Florasındaki Böğürtlen Genotipleri Arasındaki Biyoçeşitliliğin Moleküler Belirteçlerle Saptanması
Derya KARAKOÇ Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı
Danışman : Yrd. Doç. Dr. Çetin ÇEKİÇ
Bu çalışmada Orta ve Doğu Karadeniz bölgesinde sekiz ili (Sinop, Samsun, Ordu, Giresun, Trabzon, Rize, Artvin ve Tokat) kapsayan survey çalışmaları sonucunda toplanan 55 yabani böğürtlen genotipi kullanılmıştır. Genotiplerden Mini-CTAB yöntemi kullanılarak izole edilen DNA‟larla ISSR-PCR çalışmaları yürütülmüştür. Çalışmada UBC-ISSR primeri kullanılarak genotipler arası polimorfizm düzeyleri incelenmiştir. Kullanılan 15 adet primer böğürtlen genotiplerinde toplam 85 adet band oluşturmuştur. 85 banttan 77‟sinin polimorfik olduğu belirlenmiştir. Primer başına elde edilen band sayısı 4 ile 9 arasında değişirken, ortalama band sayısı 5,67 olarak belirlenmiştir. Primer başına ortalama polimorfik bant sayısı ise 5,13 olarak bulunmuştur.
İstatistiki analizlerde kullanılacak veriler, ISSR bantlarının değerlendirilmesi ile elde edilmiştir. Genotipler arası benzerlik ve farklılıklar moleküler düzeyde çalışılmış, benzerlik katsayısı kullanılarak Temel Koordinatlar Analizi yapılmış ve UPGMA dendrogram elde edilmiştir. Elde edilen dendrograma göre genotipler biri küçük ve diğeri büyük olan iki ana grup altında toplanmıştır. Küçük ana grup özellikle bitkisel özellikler bakımından araştırıldığında morfolojik yönden diğer genotiplerden farklı olduğu kaydedilmiştir. Bu grup 1000 m rakım üzeri alınan genotiplerden oluşmakta, özellikle tüysü yapıda yumuşak ince dikenleri ile diğerlerinden ayrılmaktadır. Yine büyük ana grup incelendiğinde bunların da istisnalar olmakla birlikte bitkilerin orijini olan coğrafik bölgelere göre, Karadeniz kıyı şeridi ve iç kesimler olarak ikiye ayrıldığı belirlenmiştir.
Anahtar Kelimeler: Böğürtlen, moleküler, genotip, markör, ISSR
iii ABSTRACT Master Thesis
Determination of Bio-diversity Among Blackberry Genotypes in Natural Ecosystem of Middle and Eastern Blacksea Region by Molecular Markers
Derya KARAKOÇ Gaziosmanpaşa University
Institute of Science Department of Horticulture
Supervisor: Asst. Prof. Dr. Çetin ÇEKİÇ
In this study, 55 wild blackberries genotypes collected from eight provinces in central and eastern Black Sea (Sinop, Samsun, Ordu, Giresun, Trabzon, Rize, Artvin and Tokat), were used. ISSR-PCR analyses were carried on the DNA of genotypes isolated using mini-CTAB extraction method. The levels of polymorphism between genotypes were determined using the UBC-ISSR primers. A total of 85 bands were obtained from 15 UBC ISSR primers. Out of 85 bands, 77 bands were polymorphic. The number of bands obtained from per primer ranged between 4 and 9, the average number of bands were determined as 5.67. The average number of polymorphic bands per primer was 5.13.
Similarities and differences between genotypes studied at the molecular level. The data for statistical analysis used were obtained by the evaluation of ISSR bands Similarity coefficient and UPGMA dendrogram were built using the Basic Coordinates Analysis. According to the dendrogram, the genotypes divided in two main groups, one small and space other large group. The small group, especially in terms of plant characteristics in morphology, was different from the other genotypes. This group consist amit of genotypes obtained from over 1000 m altitude, especially in soft plumose structure with fine spines separated from others. On the other hand, the main group with exceptions, were divided into two groups one is consist of the genotypes obtained from the Black Sea coastline and other form interior Black sea region.
Keywords: Blackberry, molecular, genotype, marker, ISSR
iv ÖNSÖZ
Araştırma konusunun belirlenmesinden tezin tamamlanmasına kadar geçen sürede, bilgi ve tecrübeleriyle her zaman yardımlarını gördüğüm sayın hocam Yard. Doç. Dr. Çetin ÇEKİÇ‟e en içten teşekkür ve saygılarımı sunarım. Çalışmanın yürütülmesi ve elde edilen verilerin değerlendirilmesinde katkı sağlayarak çalışmalarımda yardımlarını esirgemeyen arkadaşlarıma ve ayrıca hayatım boyunca her zaman yanımda olan sevgili anne ve babama teşekkür ederim.
Derya KARAKOÇ
v ĠÇĠNDEKĠLER Konu Sayfa ÖZET ……….……… ii ABSTRACT ……….………. iii ÖNSÖZ ……….………. iv ĠÇĠNDEKĠLER……….. v ġEKĠLLER DĠZĠNĠ ………... vi ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ ………...………... vii
SĠMGE VE KISALTMALAR DĠZĠNĠ ………. viii
1. GĠRĠġ………. 1
2. KAYNAK ÖZETLERĠ………. 5
3. MATERYAL ve YÖNTEM ……… 8
3.1. Materyal …………..……… 8
3. 2. Yöntem ... 11
3.2.1 Yaprak Örneklerinin Alınması………... 11
3.2.2 DNA İzolasyonu………. 11
3.2.3 ISSR-PCR (İnter Simple Sequence Repeat)……….. 13
3.2.3.1 Projede Kullanılan ISSR Primerler……… 14
3.2.4 Agaroz Jel Elektroforezi ……… 15
3.2.5 Moleküler Sonuçların İstatistiki Analizinde Kullanılan Verilerin Elde Edilmesi………. 17
3.2.5.1 Temel Koordinatlar Analizi (Principal Coordinate Analysis)………… 17
3.2.5.2 Kümeleme Analizi (Cluster Analysis-UPGMA)………. 18
4. BULGULAR ……….………...………. 19
4.1 DNA İzolasyonu 19 4.2 PCR Optimizasyonu 25 4.3. ISSR Primerleri ve Poliformizm Seviyeleri 26 4.4. İstatistiki Analizlerde Kullanılacak Verilerin Elde Edilmesi 26 4.5.Temel Koordinatlar Analizi (Principal Coordinate Analysis) 27 4.6. Kümeleme Analizi (Cluster Analysis-UPGMA) 29 4.7. ISSR Analizleri Sonucu Elde Edilen Dendogramın Değerlendirilmesi 31 5. SONUÇ ... 32
6. KAYNAKLAR ... 33
vi
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ
ġekil Sayfa
Şekil 3.1. Koleksiyon bahçesinin kurulması ve bir yıl sonraki görünümü 8 Şekil 3.2. Böğürtlen genotiplerinin alındığı noktalar 10
Şekil 3.3. Araziden yaprak örneklerinin toplanması 11
Şekil 3.4. Mini CTAB DNA izolasyonun bazı aşamaları 12 Şekil 3.5. Örneklerin yüklenmesi ve görüntüleme cihazı 16 Şekil 3.6 DNA iolasyonu ve PCR çalışmalarında kullanılan Ladder‟ler 16 Şekil 4.1 Kırılan DNA fragmentlerinin sıvama şeklinde görülmesi 20
Şekil 4.2.Tek bant şeklinde görülen DNA‟lar 20
Şekil 4.3 Primer 807‟nin genotiplerdeki band profili 23 Şekil 4.4 Primer 808‟nin genotiplerdeki band profili 23 Şekil 4.5 Primer 810‟nin genotiplerdeki band profili 24 Şekil 4.6 Primer 826‟nin genotiplerdeki band profili 24 Şekil 4.7 Primer 835‟nin genotiplerdeki band profili 25 Şekil 4.8 Primer 841‟nin genotiplerdeki band profili 25 Şekil 4.9 Primer 856‟nin genotiplerdeki band profili 26 Şekil 4.10 Primer 888‟nin genotiplerdeki band profili 26 Şekil 4.11 Primer 891‟nin genotiplerdeki band profili 27 Şekil 4.12. Böğürtlen genotiplerinin SM katsayısı kullanılarak elde edilmiş 1.
ve 2. temel koordinat eksenleri (A) ve 1. ve 3. temel koordinat eksenleri (B) üzerinde dağılımı
28
Şekil 4.13. Böğürtlen genotiplerinde benzerlik katsayısı kullanılarak elde edilmiş UPGMA dendrogram
vii
ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ
Çizelge Sayfa
Çizelge 3.1. Böğürtlen genotiplerinin alındığı yer, koordinat ve yükseltiler 9 Çizelge 3.2 Çalışmada kullnılan ISSR primerleri ve baz dizilimleri 15
Çizelge 3.2 Veri matriksi 17
Çizelge 4. 1. Böğürtlen genotiplerinde toplam band ve polimorfik band sayıları, polimorfizm oranları
viii KISALTMALAR
B Böğürtlen
D Doğu
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
GPS Global Positioning System, Küresel Konumlama Sistemi ISSR Inter Simple Sequence Repeat
K Kuzey
NTSYS Numerical Taxonomy System PCR Polymerase Chain Reaction
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SDS sodium dodecyl sulfate
STS Sequence Tagged Sites
TBE Tris-borate-EDTA
TDPCR Touchdown Polymerase Chain Reaction TEAC Troloks eşdeğer antioxidan kapasitesi TKoA Temel Koordinatlar Analizi
1. GĠRĠġ
Ülkemiz dünyada yetişen birçok meyve ve sebze türünün gen merkezi veya gen merkezleri sınırları içinde bulunmakta olup, çok geniş bir genetik zenginliğe sahiptir. Florasında 163 familyaya bağlı 1225 cins ve 9000 tür bulunan ve bunlardan 3000 türü endemik nitelikte olan Türkiye‟nin; 203 familyaya ilişkin 2500‟ü endemik 12000 türe sahip Avrupa ile karşılaştırıldığında bitkisel gen kaynakları bakımından ne kadar zengin bir ülke olduğu kolaylıkla görülmektedir (Özgen ve ark., 1995). Gen merkezleri incelendiğinde, dünyadaki sekiz gen merkezinden ikisi (Yakın Doğu ve Akdeniz Havzası Gen merkezleri) Anadolu topraklarını da kapsamaktadır (Vavilov, 1951). Yapılan kazılar ve çalışmalara göre 4-5 bin yıl önce Anadolu' da çoğu meyve türlerinin yetiştirildiği anlaşılmaktadır. Bitki genetik kaynakları, aynı zamanda, içerdikleri genetik çeşitlilik nedeniyle son yıllarda hızla ilerleme kaydeden fizyoloji ve biyoteknoloji alanlarında, üstün nitelikli bitki çeşitlerinin geliştirilmesi için gerekli hammadde niteliğindedir.
Bugün, meyvecilik kültüründe önem kazanmış olan elma, armut, ayva, fındık, antepfıstığı, vişne, kiraz, erik, ceviz, badem, kestane, incir, üzüm ve nar gibi bir çok meyve türleri bu topraklarda ortaya çıkmıştır. Kültürü yapılan meyve türlerimizden başka kuşburnu, geleboru, karayemiş, kocayemiş, alıç, üvez, ahududu, böğürtlen, çilek, mürver, muşmula, melengiç, keçi boynuzu ve idris (mahlep) gibi bir çok meyve türünün kökeni yine Anadolu olarak gösterilmektedir (Ağaoğlu ve ark., 2001; Ercişli, 2004 ).
Orijini Anadolu olan kültür meyve türlerinin çoğunluğu ticari olarak ülkemizde yetiştirilmekte olup, şu anda yüzlerce çeşide sahip türlerimiz bulunmaktadır. Ancak eski kaynaklarda birçok hastalıklara iyi geldiği bildirilen, günümüzde ise herbaristlerin raflarını süsleyen ve belki de hemen yanı başımızdaki bir ormanın kuytu köşesinde bulunabilen orijini Anadolu olan öyle yabani meyve türleri vardır ki hak ettiği değeri görememektedir.
2
Ülkemizde uzun yıllar yabanileri toplanıp sevilerek tüketilen ama üzerinde fazla çalışma yapılmayan bir çok üzümsü meyve türleri gibi böğürtlen de üzerinde fazla çalışılmamış türlerden bir tanesidir. Ülkemiz, böğürtlen meyve türünün anavatanı olup, halen bir çok bölgemizin doğal florasında özellikle Karadeniz sahil ve geçiş bölgelerinde yaygın olarak yetişmektedir. Bu türün yabani formlarının ülkemizin diğer bölgelerinde de geniş alanlarda ve yoğun olarak bulunmaları, bunların toplanarak değerlendirilmelerini kolaylaştırmış, bu nedenle çeşit ıslahı çalışmaları diğer birçok meyve türüne göre daha geç başlamıştır (Onur, 2006). Halbuki doğada yaygın olarak bulunan bu gen kaynakları ülkemizin sahip olduğu en büyük zenginliklerden birisi olup, bu genotiplerin üstün özelliklerinin tanımlanarak yeni çeşitlerin ortaya çıkarılmasında kullanılması gerekmektedir. Ayrıca, böğürtlenin de bulunduğu sağlık meyveleri grubu olarak adlandırılan bu meyvelerin dünyada üretimi ve buna bağlı olarak tüketimi de yaygınlaşmakta ve beslenme uzmanları tarafından tavsiye edilmektedir.
Son onbeş yılda bu tür üzerinde lokal veya ülke genelinde çalışmalar başlatılmış, yeni çeşitlerin ve bazı yabani tiplerin adaptasyon çalışmaları yapılmıştır (Onur, 1999; Kaplan ve ark., 2003; Cangi ve İslam, 2003). Fakat hem adaptasyon hem de ıslah amaçlı çalışmaların hemen hemen tamamında morfolojik karakterterlerin tanımlanması yapılmış, moleküler düzeyde çalışmalar çok sınırlı kullanılmıştır.
Bir çok ürüne kotaların uygulandığı günümüzde, çiftçilere ek gelir getirecek bu grup meyveler alternatif ürün arayışlarının en karlı ve şanslı adayları konumundadır. Burada görülen eksiklik bu ürünlerin avantajlarının üreticilere aktarılamaması ve aynı zamanda yöreye uygun çeşitlerin geliştirilememesidir. Üzümsü meyveler içerdikleri bileşikler yanında, kısa sürede meyveye yatmaları bakımından da diğer birçok meyve türünden daha avantajlıdır.
Bir yöreye uygun çeşit ıslahında birinci ve en önemli başvurulacak kaynak sahip olduğumuz doğal gen kaynaklarına başvurmaktır (Şehirali ve Özgen, 1987). Yöreye adapte olmuş ve uzun süredir yaygın olarak yetişen yabani tipler olumsuz doğa koşulları ve hastalıklara dayanım kazanmışlardır. Bu özellikler yeni çeşitlere aktarıldığı müddetçe bölgede yaygınlık kazanacaklardır. Bu amaçla sahip olduğumuz doğal
3
floranın taranarak korumaya alınması, değişik tekniklerle tanımlanması ve gen havuzlarının oluşturulması gerekmektedir. Karadeniz bölgesini kapsayan bu çalışma tüm Anadolu gen kaynaklarındaki çeşitliliğin modern tekniklerle belirlenmesine bir adım olacaktır.
Öte yandan, yurtdışından gelen araştırıcılar, ülkemizin bütün bölgelerinden topladıkları bir çok bitkiyi yasal ya da yasal olmayan yollarla yurtdışına çıkarmışlardır ve hala da bu durum devam etmektedir. Ancak son yıllarda benzer çalışmaları yapmak üzere talepler bulunmaktadır. Bu da, ülkemizin sahip olduğu zenginliğin (büyük bir kısmının yurtdışına çıkartılmış olmasına rağmen) öneminin gün geçtikçe arttığını göstermektedir.
Tüm dünyanın sorunu haline gelen bitkisel gen kaynaklarının korunması, özellikle son yıllarda gündemde en çok kalan konulardan biri olmuştur. Bitkisel gen kaynaklarının, özellikle yabani türlerin korunması, gelecekte yapılacak olan bitki ıslahı çalışmaları için son derece önemlidir. Tarımsal biyolojik çeşitliliğin insanlar tarafından yönetiminin derecesi, üretim sistemleri içinde korunması sürdürülebilir kullanım ile bağlantılıdır. Biyolojik çeşitliliğin çoğunluğu gen bankalarında veya ıslahçı materyalleri olarak yeri dışında (ex-situ) korunmaktadır. Tarımsal ekosistemlerde yerinde (in-situ) meydana gelen çevre, genetik kaynaklar ve yönetim uygulamaları arasındaki etkileşim genel olarak tarımsal biyolojik çeşitliliğin dinamiklerinin idamesine katkı sağlamaktadır. Bunun için de ilk önce sahip olduğumuz çeşitliliği belirlemek gerekmektedir. Bu amaçla değişik çevre koşullarındaki bitkilerin morfolojik, biyokimyasal karakterlerin analizi ve moleküler markörlerinin (belirteçler) belirlenmesi gerekir. Çeşitliliğin belirlenmesinde günümüze kadar yapılan çalışmaların çoğunluğunda teknolojik eksikler nedeni ile koordinat belirleme sistemi kullanılmamıştır. Bunun yerine bazı bilinen yer, yöre ve dağ isimleri kullanılmış bu da daha sonra tekrar o genotipe ulaşma şansını azaltmıştır. Günümüzde gelişen teknoloji sayesinde nokta belirleme yöntemi ile tekrar aynı yeri bulmak çok daha kolaydır. Diğer taraftan ıslah ve karakterizasyon çalışmalarında bitkilerin sadece morfolojik özelliklerden yararlanılmıştır. Bu özelliklerin çevre ve iklim faktörlerinden kolayca etkilenmesi nedeniyle yanıltıcı sonuçların çıkma ihtimali yüksektir. Son yıllarda kullanımı yaygınlaşan fitokimyasal analizler ve moleküler markörlerin taksonomik varyasyonların belirlenmesinde
4
kullanılması, sadece morfolojik karakterlere göre yapılan çalışmaların eksik kalan kısmını tamamlayıcı nitelikte olacaktır.
Türkiye‟de genetik çeşitliliğin çok fazla olduğu Karadeniz bölgesinde gen kaynağı Anadolu olan böğürtlen meyve türündeki genetik varyasyonun saptanması ve moleküler markörlerin (belirteçler) kullanması açısından bu konuda yapılan bir ilk çalışma niteliğindedir.
5
2. KAYNAK ÖZETLERĠ
Rosales takımının Rosaceae familyası, Rosaideae alt familyası, Rubus cinsi ve Eubautus alt cinsinde yer alan böğürtlen, zengin vitamin ve mineral madde içerikleri, yine zengin antioksidant kapasitesi ile son yıllarda özel bir önem kazanan meyve türüdür. Anavatanı Güney, Batı ve Orta Avrupa (Gerçekçioğlu, 1999) olarak belirtilen böğürtlenlerin kültür çeşitlerinin hemen hepsi Kuzey Amerika kökenli olduğu bildirilmektedir (Ağaoğlu, 1986). Ülkemiz de böğürtlen meyve türlerinin anavatanı içinde olup, halen bir çok bölgemizin doğal florasında özellikle karadeniz sahil ve geçiş bölgelerinde yaygın olarak doğada yetişmektedirler. Ülkemizde böğürtlen çok geniş bir alanda yayılım göstermekle birlikte, gerek genotipik farklılık ve gerekse çevre faktörleri nedeniyle bitki ve meyve özelliklerinde farklılıklar görülmektedir (Çekiç ve ark., 2009).
Gen merkezi konumunda olan ülkemizde halen böğürtlen yetiştiriciliğinde istenilen ilerleme sağlanabilmiş değildir. Sayılı birkaç bahçe dışında kapama bahçeler bulunmamaktadır. İnsanlar doğada yabani olarak yetişen meyveleri toplayıp severek tüketmesine rağmen, bunun kültür formunu yetiştirip ekonomik girdi sağlamayı düşünmemektedir. Halbuki sağlık meyveleri grubu olarak adlandırılan bu meyvelerin dünya üretimi ve buna bağlı olarak tüketimi yaygınlaşmakta ve beslenme uzmanları tarafından tavsiye edilmektedir. Bu türlerin yabani formlarının ülkemizde geniş alanlarda ve yoğun olarak bulunmaları, bunların toplanarak değerlendirilmelerini kolaylaştırmış, bu nedenle çeşit ıslahı çalışmaları diğer birçok meyve türüne göre daha geç başlamıştır (Onur, 2006). Doğada yaygın olarak bulunan bu gen kaynakları ülkemizin sahip olduğu en büyük zenginliklerden birisi olup, bu genotiplerin üstün özelliklerinin tanımlanarak yeni çeşitlerin ortaya çıkarılmasında büyük katkı sağlayacaktır. Son on beş yılda bu türlerde lokal veya ülke genelinde çalışmalar başlatılmış, yeni çeşitlerin adaptasyon çalışmaları yapılmıştır (Fidan ve ark., 1976; Onur, 1999; Erenoğlu ve ark., 2003; Gerçekçioğlu ve ark, 2003). Fakat hem adaptasyon hem de ıslah amaçlı çalışmaların hemen hemen tamamında morfolojik karakterlerin tanımlanması yapılmış, moleküler düzeyde tanımlanmasına girilmemiştir.
6
Aynı zamanda, çoğu bitki türlerinde yapılan çalışmaların büyük bir kısmı seleksiyon ıslahı olup; sahip olduğumuz biyoçeşitlilik üzerinde çalışmalar çok azdır. Seleksiyon kriterlerinde kullanılan morfolojik ve fitokimyasal özellikler çevre ve iklim koşullarına göre kolayca değişmekte olup, biyoçeşitliliğin belirlenmesinde çevreden etkilenmeyen biyokimyasal ve genetik özelliklerin tek başına kullanılması veya morfolojik karakterlerle birlikte kullanılması daha güvenilir sonuçlar verecektir (Rafalski ve ark., 1996).
Bitkilerin genetik potansiyellerinin amaca uygun biçimde yönlendirilmesi açısından son yıllarda protein, izoenzim ve DNA markörleri gibi moleküler belirleyicilerin gerek araştırma gerekse uygulamada kullanımı büyük önem kazanmakta ve bitki ıslahında bunlardan yararlanma olanakları araştırılmakta olup, gelişmiş bir çok ülkede bu tekniklerin bu amaçla kullanımı son bir kaç yıldır yaygınlaşmıştır (Şehirali ve Özgen, 1987).
Moleküler belirleyiciler genel olarak kalitatif ve kantitatif özelliklerin ıslahında ıslah projelerinin sürelerini kısaltarak maliyetlerini düşürmekte ve seleksiyonda, genetik ve linkage haritalamalarında, çeşit tanımlaması ve korunmasında, genotipler arası genetik uzaklığın belirlenmesinde de yararlanılmaktadır (Lowe ve ark., 1996).
Moleküler genetiğin araştırmacılar tarafından kullanımı Türkiye‟de son yıllarda başlamıştır. Daha önceki yıllardaki ıslah ve karakterizasyon çalışmalarında bitkilerin sadece morfolojik özelliklerden yararlanılmasına rağmen, bu özelliklerin çevre ve iklim faktörlerinden kolayca etkilenmesi nedeniyle yanıltıcı sonuçların çıkma ihtimali yüksektir. Buna karşılık moleküler belirleyicilerinin çevreden etkilenmeyişleri, bitkinin gelişme devrelerinin her aşamasında kullanılabilmeleri, geniş bir varyasyon göstermeleri ve daha güvenilir bilgi verebilmeleri bu tekniklerin son yıllarda taxonların ayrılmasında, genetik haritalamalarda ve türlerin teşhisinde kullanılmasının yaygınlaşmasına neden olmuştur (Rafalski ve ark., 1996;Vos ve ark, 1995). Bu markörler kullanılarak, genetik varyasyon araştırılmakta ve türlerin taksonomik tanımlaması yapılarak, filogenetik akrabalıkları bulunabilmektedir (Lowe ve ark., 1996).
7
Moleküler belirleyicilerden en önemlilerini hibridizasyona dayalı olan restriksiyon parça uzunluğu polimorfizmi (RFLP) (Bolstein ve ark., 1980) ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) dayalı rasgele çoğaltılmış polimorfik DNA (PAPD)( Welsh ve McClelland, 1990), basit dizi tekrarları (mikrosatellitler) (Hamada ve ark., 1982), çoğaltılmış parça uzunluğu poliformizmi (AFLP) (Vos ve ark., 1995), dizisi etiketlenmiş alanlar (STS) (Talbert ve ark., 1994) gibi belirleyiciler oluşturmaktadır. PCR esaslı teknikler karakterizasyon çalışmalarında zamanı işgücü ve girdi tasarrufu sağladığından daha çok tercih edilmektedir (Devos ve Gale, 1992). Projede kullanılacak olan ISSR-PCR (İnter Simple Sequence Repeat) tekniğinde markörler dominant olması bir dezavantaj oluşturmasına karşılık; tüm canlıların genom dizilerinde yaygın olan bölgelerine bağlanabilen primerların geliştirilmesi sonucu, genom hakkında ön bilgi olmasa bile kullanılabilmektedir (Çekiç ve ark., 2001). Dolayısıyla genetik çeşitliliğin ve akrabalıkların belirlenmesinde kullanımı son yıllarda yaygınlık kazanmıştır. Dolayısıyla bu çalışmada da daha önceki çalışmalarda başarılı olarak kullanılan ISSR metodu kullanılmıştır.
Bu çalışma çerçevesinde gen kaynağı Anadolu olan ve Karadeniz bölgesinde geniş bir doğal yayılım alanı bulan böğürtlen türünün genetik biyoçeşitliliği ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats) moleküler markörleri kullanılarak saptanmıştır.
8
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1 Materyal
Çalışmada, Orta ve Doğu Karadeniz bölgesindeki Sinop, Samsun, Ordu, Giresun, Trabzon, Rize, Artvin ve Tokat ili ve çevresinden TUBİTAK 107 O 209 nolu proje çerçevesinde toplanan 55 böğürtlen genotipi kullanılmıştır. Köklü bitki materyali olarak toplanan genotiplerle Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi Araştırma Uygulama bahçesinde Koleksiyon bahçesi kurulmuş ve çalışmada kullanılan DNA‟lar bu bitkilerden alınan yapraklardan izole edilmiştir.
9
Çizelge 3.1. Böğürtlen genotiplerinin alındığı yer, koordinat ve yükseltiler
Örnek kodu
il
Ġlçe veya yerleĢim yeri
adı Yükseklik(m) Enlem Boylam
B1 Trabzon Zigana 1796 40o 38.183K 039o 23.861D B2 Trabzon Sümela 558 40o 45.226K 039o 37.395D B3 Artvin Borcka 687 41o 23.535K 041o 32.169D B4 Artvin Karagöl 1476 41o 23.239K 041o 51.173D B5 Rize Ayder 1579 40o 56.141K 041o 08.232D B6 Rize Merkez 14 41o 11.331K 040o 46.772D B7 Giresun Dereli 132 40o 47.849K 038o 28.148D B8 Ordu Cambaşı 1405 40o 44.610K 037o 56.498D B9 Giresun Bektaş yaylası 898 40o 48.838K 040o 40.526D B10 Giresun İnişdibi 1136 40o 43.322K 038o 18.733D B11 Giresun Fatsu altı 358 40o 46.045K 038o 18.674D B12 Giresun Merkez 8 40o 56.593K 038o 15.325D B13 Rize Ayder 519 40o 01.331K 041o 02.903D B14 Rize Pazar 17 41o 10.141K 041o 55.486D B15 Rize Çayeli-Limanköy 8 41o 04.525K 040o 40.526D B16 Artvin Ortacalar 45 41o 18.973K 041o 18.267D B17 Artvin Merkez 222 41o 10.510K 041o 50.336D B18 Artvin Erenköy- Murgul 252 41o 18.261K 041o 36.513D B19 Artvin Borçka 432 41o 24.046K 041o 30.772D
B20 Artvin Hopa 25 41o 23.260K 041o 26.067D
B21 Rize İkizdere 514 40o 46.835K 040o 33.545D B22 Rize Çağırankaya yaylası 1597 40o 48.035K 040o 36.759D B23 Trabzon Merkez 118 40o 59.350K 039o 41.004D B24 Trabzon Arsin 526 40o 54.156K 039o 55.360D B25 Trabzon Beşikdüzü 16 41o 02.707K 039o 12.171D B26 Trabzon Sisdağı 1295 40o 50.816K 039o 11.293D B27 Trabzon Düzköy 1487 40o 51.049K 039o 26.016D B28 Trabzon Akca 128 40o 57.942K 039o 31.272D B29 Ordu Bolaman 94 40o 58.937K 037o 45.557D B30 Ordu Ünye 166 41o 05.361K 037o 13.299D B31 Ordu Akkuş 1134 40o 52.481K 037o 02.532D B32 Samsun Yukarıdikencik 22 41o 14.719K 036o 41.130D B33 Samsun Salıpazarı 46 41o 07.113K 036o 47.333D B34 Samsun Asarcık 77 41o 12.502K 036o 18.207D B35 Sinop Dikmen 167 41o 40.594K 035o 20.970D B36 Sinop Gerze 25 41o 47.000K 035o 11.824D B37 Sinop Erfelek 132 41o 53.953K 034o 56.986D B38 Sinop Gökçebel 640 41o 52.222K 034o 45.748D B39 Sinop Yenikonakçısı 316 41o 48.838K 034o 37.675D B40 Sinop Gökçukur 864 41o 38.792K 034o 40.240D B41 Sinop Durağan 209 41o 24.695K 035o 04.208D B42 Sinop İncesu 300 41o 11.676K 035o 19.123D B43 Samsun Havza 681 40o 59.410K 035o 42.781D B44 Samsun Kızlan 927 41o 29.760K 035o 34.331D B45 Samsun Kolay 74 41o 23.165K 035o 48.245D B46 Samsun Taflan 19 41o 25.648K 036o 08.597D B47 Tokat Zile 670 40o 18.793K 035o 58.075D B48 Tokat Turhal 530 40o 22.036K 036o 05.993D B49 Tokat Pazar 551 40o 18.420K 036o 15.759D B50 Tokat Artova 1117 40o 05.329K 036o 17.924D B51 Tokat Reşadiye 427 40o 25.479K 037o 10.005D B52 Tokat Başçiftlik 1016 40o 31.002K 037o 05.078D B53 Tokat Niksar 272 40o 34.431K 036o 55.144D B54 Tokat Erbaa 230 40o 40.171K 036o 38.196D B55 Tokat Merkez 612 40o 19.855K 036o 28.559D
10
Şekil 3.2. Böğürtlen genotiplerinin alındığı noktalar
Sinop Samsun Ordu Giresun Trabzon Rize Hopa Artvin Tokat
11
3.2 Yöntem
3.2.1 Yaprak Örneklerinin Alınması
Genotiplerden DNA izolasyonu amacıyla bitkilerde yaklaşık 1-2 gr taze yaprak örnekleri alınıp, ependorf tüplere konarak, taşınabilir sıvı azot tankı içine atılmış ve gezi süresince sıvı azot içerisinde bekletilmiştir (Şekil 3.3). Gezi sonunda sıvı azottan çıkarılan yapraklar -80 oC‟de muhafaza altına alınmıştır. Bitkilerden canlı materyal
alınması yanında arazide taze yaprak alınmasının nedeni, alınan canlı köklü materyalin tutmama ve kuruma ihtimaline karşılık birinci yıl moleküler analizlerin gecikmesini önlemek amaçlıdır. Nitekim, köklü bitki materyallerinin kontrollü şartlarda tutmaları sağlanması sonucunda bunlardan tekrar taze yaprak materyali alınarak DNA izolasyonlarında taze yaprak kullanılmıştır.
Şekil 3.3. Araziden yaprak örneklerinin toplanması
3.2.2 DNA Ġzolasyonu
DNA izolasyonu Doyle ve Doyle (1987) yöntemi modifiye edilerek kullanılmıştır. Örneklerden alınan taze yapraklar sıvı nitrojen içinde dondurulup – 80 oC‟de depolanmış yada taze yaprak bulunması durumunda taze yapraklar alınarak DNA izole edilmiştir.
Mini CTAB DNA Extraksiyon Metodu: Yapraklar sıvı nitrojen ile dondurulduktan sonra ezilerek toz haline getirilerek ependorf tüplere transfer edildikten sonra
12
13
hazırlanan izolasyon tampon, proteinase K ve SDS konularak 65 oC‟de sıcak su banyosunda 30 dakika süreyle 10 dakikada bir yavaşça ters yüz edilelerek inkübe edilir. Tüplerin her birine çeker ocakta 2/3 hacim (400 μl) kloroform : isoamil alkol (24:1) eklenir ve alt-üst ederek 15 dk. alt üst ederek karıştırılır (Şekil 3.8). Sıcak su banyosundan çıkarılan her tüpün üst kısmına kadar kloroform:izoamilalkol (24:1) ilave edildikten sonra yavaşça karıştırılıp 15 dakika karıştırıcıya konulur. Tüpler 15 dakika 2800 rpm sanrifüj edildikten sonra tüplerin üst fazları yeni falkonlara aktarılır (Alt fazlar da uygun şekilde depolandıktan sonra imha edilir). Her tüpe 8.6 mg/ml‟lik RNaz‟dan 23 μl eklenir, yavaşça karıştırılıpve 15 dakika 37 oC‟de inkübe edilir. Pipet kullanılarak her tüpe eşit hacimde fenol ilave edilerek yavaş yavaş ters düz edilerek karıştırılır. Santrifüjden sonra pipet kullanılarak üst fazlar yeni tüplere transfer edilir. Yine her tüpe eşit hacimde kloroform:izoamil alkol (24:1) ilave edilerek yavaşça karıştırılıp 2800 rpm‟de santrifüj edilir. % 95‟lik soğuk EtOH‟dan 2X hacim eklenip, DNA‟lar tortu halinde beyaz renkte görülmeye başlanıncaya kadar yavaşça karıştırılıp, – 20 oC‟de bir gece boyunca bekletilir. Bir sonraki gün DNA‟lar ependorf tüplere aktarılarak 1,2 ml % 70‟lik EtOH‟de temizlenir. Steril kurutma kağıtları kullanılarak kurutulan DNA‟lara 250 μl TE eklenir. Tüpler 65 C‟de sıcak su banyosuna alınarak çözülene kadar vorteks ile karıştırılıp, 12000 rpm‟de spin edilir. DNA kalitesinin kontrolü için agaroz jelde elektoforez yapılır UV altında incelenir ya da spektofotometre ile DNA miktarları belirlenip, daha sonraki PCR işlemi için örneklere ait DNA içeren tüpler derin dondurucuda (- 20 oC) muhafaza edilir.
3.2.3 ISSR-PCR (Ġnter Simple Sequence Repeat)
ISSR, PCR temelli bir teknik olup; bu teknikte, karşıt yönde ilerleyen iki benzer mikrosatellit tekrar bölgeleri arasında bir büyüme mesafesinde DNA parça amplifikasyonunun başlatılmasını gerektirmektedir. Farklı boyuttaki inter SSR dizilerinin büyütülmesi için genellikle 16-25 bp uzunluğunda çoklu genomik lokulusu hedefleyen bir tekli primer PCR reaksiyonunda primerler olarak mikrosatellitler kullanılır. Mikrosatellit tekrarları di-nükleotid, tri-nükleotid, tetra-nükleotid ve penta-nükleotid olabilen primerler kullanılır. Kullanılan primerlerin her ikiside bağlanmaz
14
veya genellikle 3‟ ve 5‟ uçlarının sonlarına yan zincirlerin içine uzamış 1 ile 4 baz ile bağlanırlar.
Projedeki PCR reaksiyonları Charters, (1996) ve Cekic ve ark, (2001)‟ deki sabit yapışma sıcaklıklı PCR metotları ve Sargent ve ark, (2003)‟te belirtilen Touchdown PCR metodu modifiye edilerek yürütülmüştür.
Reaksiyonlar, 2 μL DNA (25 ng/μL) ve 23 μL reaksiyon karışımı [5 μL 10X PCR tampon çözeltisi (SİGMA), 2 μL 25 mM Mg+2(SİGMA), 1.25 μL 2.5 mM dNTP
(LAROVA), 0.1 μL Taq DNA Polimeraz (SİGMA), 1 μL 0.5 μM primer ve 13.65 μL PCR suyu] ile gerçekleştirilmiştir.
Çalışmamızda, primer erime sıcaklıklarının 7 oC üzerinden başlanan yapışma
sıcaklıkları her bir ardışık döngüde 0,5 oC düşerek gerçek erime sıcaklığına ulaştıktan
sonra sabit yapışma sıcaklığında 30 döngü yapılmıştır. PCR çalışmalarında 3 dakika 94
oC‟de sıcak başlangıçla başlanmış, takip eden döngülerde 94 oC „de 30 saniye (sn)
denaturation (ayrışma), primer erime sıcaklıklarına göre 57-62 oC‟den başlayıp 50-55 oC‟de sabitlenen 30 sn annealing (yapışma) ve 72 oC‟de 30 extention (uzama) şeklinde
yürütülmüş ve döngüler tamamlandıktan sonra 72 oC‟de 5 dakikalık son uzama ile PCR
tamamlanmıştır.
3.2.3.1 Projede Kullanılan ISSR Primerler
Çalışmada aşağıda baz dizileri verilen ISSR primerleri kullanılmıştır. Bu primerler iki veya üçlü basit dizilimlere sahip olup en sonunda bir, iki ya da üç baz uzama bazı olarak bulunmaktadır.
15
Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan ISSR primerleri ve baz dizilimleri
No Primer Dizi Baz sayısı
1 807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 17 2 856 ACACACACACACACACYA 18 3 881 GGGTGGGTGGGTGGGT 16 4 888 BDBCACACACACACACA 17 5 889 DBDACACACACACACAC 17 6 890 VHVGTGTGTGTGTGTGT 17 7 891 HVHTGTGTGTGTGTGTG 17 8 808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 17 9 810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 17 10 811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 17 11 826 ACACACACACACACACC 17 12 835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 18 13 841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 18 14 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 18 15 844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 18 Y= ( C, T ), R= ( A, G ), B= ( C, G, T ), D= ( A, G, T ), H= ( A, C, T ) V= ( A, C, G )
3.2.4 Agaroz Jel Elektroforezi
DNA izolasyonu sonunda elde edilen genomik DNA kalitelerinin belirlenmesinde ve PCR ürünlerideki polimorfizmin belirlenmesinde normal ve metafor agaroz kullanılarak elektroforez işlemi gerçekleştirilmiştir. Jel ve elektrot tampon çözeltisi olarak 1XTBE kullanılmıştır. Genomik DNA için %1‟lik normal agaroz ve PCR ürünleri için % 3‟lük metaphor agaroz jel kullanılmıştır. Eritilen jele 0,064 µl/ml ethidium bromid ilave edilerek solusyon 800C jel tepsisine dökülmüş ve donuncaya kadar oda sıcaklığında bırakılmıştır. Amplifiye olan DNA‟ların bulunduğu tüplere brom fenol blue eklenip, pipetleme yapılarak boyanın iyice karışması sağlanmış ve ardından yine pipet yardımı ile örnek yuvalarına yükleme yapılmıştır. Jel yaklaşık 1-3 saat süresince 100 V‟luk sabit gerilimde tutulan ürünler gel görüntüleme sisteminde görüntülenerek fotoğraflanmıştır (Şekil 3.5).
16
Şekil 3.5. Örneklerin yüklenmesi ve görüntüleme cihazı
DNA fragmentlerinin büyüklüğünü kıyaslamada 125-23130 baz çifti aralığında fragment veren Lambda-HindIII DNA, PCR ürünlerindeki fragment uzunluklarını kıyaslamada ise 100-3000 baz çifti aralığında fragment veren 100 bp ladder kullanılmıştır (Şekil 3.6)
Lambda-HindIII DNA (Vivantis 100 bp LADDER (Vivantis)
17
3.2.5 Moleküler Sonuçların Ġstatistiki Analizinde Kullanılan Verilerin Elde Edilmesi
İstatistiki analizlerde kullanılan veriler, ISSR bantlarının değerlendirilmesi ile elde edilmiştir. Bu teknik kullanılarak yaptığımız tekrarlı uygulamalarda elde edilen PCR ürünlerindeki bantlar kullanılmıştır. Üzerinde çalışılan her bireyde benzerlik ya da farklılıkları belirlemek amacıyla, aynı büyüklükteki bu bantlara bakılarak elde edilen sonuçlar var (1) ya da yok (0) şeklinde skorlanarak
Çizelge 3.2 Veri matriksi
G1 G2 G3 G... Gm M1 1 0 0 ... 1 M2 1 1 0 ... 1 M3 0 0 1 ... 0 M... ... ... ... ... ... Mn 0 1 0 ... 1
kaydedilmiştir. Kaydedilen bu rakamlar sonucu elimizde Çizelge 3.2 ‟ deki gibi bir veri matriksi oluşturulmuştur. Veri matrisinde, “G” üzerinde araştırma yaptığımız bireyleri (G=1,...,m), “M” ise elde ettiğimiz markörleri (bantları) (M=1,...,n) ifade etmektedir.
3.2.5.1 Temel Koordinatlar Analizi (Principal Coordinate Analysis)
Temel Koordinatlar Analizi (TKoA), bireylerin benzerlik ya da farklılıklarının tespit edilmesinde kullanılan çok değişkenli bir istatistiki analiz yöntemidir. Benzerlik yada farklılık matrisleri kullanılarak analiz gerçekleştirilir. Bu teknik moleküler markörlerden yararlanılarak deney ünitelerindeki kümelenmeleri açığa çıkarmak amacıyla da yaygın olarak kullanılmaktadır.
18
Bireyler arasındaki benzerlik/farklılık matrislerinin oluşturulmasında ve TKoA‟de Rohlf (2002) tarafından geliştirilen NTSYS-pc ver. 2.10d (NumericalTaxonomy and Multivariate Analysis System - Sayısal Taksonomi ve Çok Değişkenli Analiz Sistemi) paket programı kullanılmıştır. Genetik markörlerde kayıp veriler olması durumunda bu paket program ile kayıp veriler dikkate alınarak analiz gerçekleştirilebilmektedir.
3.2.5.2 Kümeleme Analizi (Cluster Analysis-UPGMA)
Kümeleme Analizi, dendrogram olarak adlandırılan ve genellikle ağaca benzer diyagram şeklinde gösterilen, benzer bireyleri grup veya küme içinde birleştirmek yoluyla oluşturulan bir metottur. Yaygın olarak biyologlar tarafından kullanılmaktadır. Dendogram oluşturulması bir birey ile başlar, diğer bireyleri bu bireye ilave ederek bütün bireyler bitene kadar devam eder. Dendogramın oluşturulmasına benzerlik yada farklılık matrisi ile başlanır ve aşağıdaki aşamalar gerçekleştirilir.
1. Çiftler halinde, bütün bireyler arasındaki benzerlik/farklılıktan oluşan (rij) R benzerlik/farklılık matrisi hesaplanır.
2. Birbirine en çok benzeyen iki birey arasında ilk küme oluşturulur.
3. Bu küme ve arta kalan bireyler arasındaki benzerlik/farklılık tekrar hesaplanır.
4. Birbirine en çok benzeyen iki birey (yada birey-küme, küme-küme) arasında ikinci küme oluşturulur.
5. Bu işleme bütün bireyler dendograma dahil oluncaya kadar devam edilir.
Kümeleme işleminde birkaç metot vardır. Bunlar arasındaki fark, oluşan küme ile diğer bireyler arasındaki benzerlik/farklılığın nasıl hesaplandığından kaynaklanır.
Bu metotlar: en yakın komşu (nearest neighbour), en uzak komşu (furthest neighbour) ve gurup ortalaması (group average) metotlarıdır. Bunlardan group average dominant markörlerin analizlerinde yaygın olarak kullanılır ve unweighted pair-groups method using arithmetic averages (UPGMA) olarak bilinir. Bu metotta iki küme arasındaki benzerlik/farklılık iki kümenin bütün bireylerinin ortalaması alınarak hesaplanır (Quinn ve Keough, 2002). ISSR PCR markörlerinin dominant olmasından dolayı çalışmalarımızda UPGMA kullanılmıştır.
19
4. BULGULAR 4.1 DNA Ġzolasyonu
Genotiplerin DNA izolasyonlarında CTAB metodu (Doyle ve Doyle, 1987) kullanılmış olup bu metodlarda böğürtlen genotipleri için en kaliteli DNA eldesi amacıyla bazı modifikasyonlar (kullanılan bitki dokusu miktarı, CTAB buffer miktarları, yıkama ve santrifüj süreleri, izolasyondan sonra PCR çalışmaları öncesi sıcak suda inkübasyon vb.) yapılmıştır. Genomik DNA‟lar jeldeki kuyucuklara en yakın bölgede tek bant şeklinde bulunması beklenmektedir. Bant yoğunluğu veya kalınlığı elde edilen DNA‟nın miktarının göstergesidir Bazı durumlarda izolasyon aşamasında DNA fragmentleri kırılmakta ve bantlar tekli olmayıp bandın altında daha küçük bant sıvaması şeklinde görülebilir (Şekil 4.1). Bu izolasyon aşamasında genomik DNA‟nın bir kısmının kırıldığının göstergesidir. Dolayısıyla izolasyon aşamalarında aşırı hassasiyet gerekliliği vardır. Bu amaçla çalışmalarımızda aşırı vortexlerden kaçınılmış, iki defa kloroform:isoamil alkol yıkaması yapılmış, Protenaz K ve RNAse enzimleri ile DNA dışındaki partiküller temizlenerek temiz DNA elde edilmiştir (Şekil 4.2).
DNA izolasyon aşamalarında bazı durumlarda, tüplerin aktarılması sırasında DNA pelleti kaybolabilmektedir. Özellikle az miktarda dokularla çalışılan DNA izolasyon metotlarında DNA pelleti çok küçük olup, DNA‟nın yıkanması ve aktarılması aşamalarında pellet kaybedilebilmektedir. Dolayısıyla tüm aşamalarda aşırı hassasiyet ve dikkat gereklidir. Pelletin kaybedildiği durumlarda jelde DNA bantları görülmemektedir.
20
Şekil 4.1 Kırılan DNA fragmentlerinin sıvama şeklinde görülmesi
Şekil 4.2.Tek bant şeklinde görülen DNA‟lar
4.2 PCR Optimizasyonu
Polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) kullanıldığı çalışmalarda optimizasyon önemlidir. Touchdown PCR (TDPCR), optimizasyonda farklı bir yaklaşımı temsil etmekte olup, optimizasyon primerlerin annealing (yapışma) ısısı üzerine odaklanmaktadır. Annealing ısısı, tek bir döngü seyri süresince, ardışık olarak azalarak düzenlenmektedir.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
21
PCR protokolünde ayrışma (denaturation) ve uzama (extention) safhaları değişmezken primer yapışma sıcaklıklarına (annealing) tedrici olarak inilmesi (Touchdown sistemi) daha iyi sonuçlar verdiğinden tüm genotipler için Touchdown PCR yapılmıştır. Touchdown (İnen) PCR özgün olmayan amplikasyonların oluşmasını engellemektedir. Bu metotta yüksek bağlanma ısısı ile başlanır. Az sayıda da olsa hedef dizinin amplifiye olması sağlanır. Bağlanma ısısı döngü sayısı ilerledikçe düşürülür. Amplifiye olmaya başlayan hedef dizinin kalıp populasyondaki oranı arttığı için düşen ısıda artık yalnızca hedef dizinin çoğalması sağlanır.
Çalışmalarımızda annealing sıcaklığı primerlerin Tm (erime) sıcaklığından 7 o
C daha yüksek olarak başlanmış, her devirde 0.5 oC düşerek Tm derecesinde sabitlenmiş ve
devam eden devirlerde sabit sıcaklık kullanılmıştır. Touchdown PCR çalışmalarında nonspesifik bandların oldukça azaldığı veya kaybolduğu ve istenilen ürünlere ait bandların daha belirgin olduğu gözlenmiştir.
Çalışmaların büyük çoğunluğu iki paralelli olarak yürütülmüş ve paraleller arası band profillerinin aynı olup olmadığı kontrol edilmiştir. Paralellerdeki band profilleri aynı olup, jeldeki EtBr veya Jel görüntüleme sistemindeki küçük ayar değişkenlerinden kaynaklanabilecek bazı minor bandların bazen daha silik veya daha parlak olduğu gözlenmiştir. Ama band profillerinde bir değişkenlik gözlenmemiştir. Bu da ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) PCR tekniğinin tekrarlanabilirliğini teyit etmektedir.
4.3. ISSR Primerleri ve PolimorfizmSeviyeleri
Çalışmada beş adet 3‟ ucunda bir baz anchor, beş adet yine 3‟ ucunda iki anchor, dört adet 5‟ ucunda üç anchor bulunan, bir adet de anchorsuz olmak üzere toplam onbeş adet UBC ISSR primerleri kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan 15 adet primer böğürtlen genotiplerinde toplam 85 bant oluşturmuş bu bantların 77‟si polimorfik olarak olarak belirlenmiştir. Böğürtlen genotiplerinde primer başına band 4 ile 9 arasında değişirken, ortalama band sayısı 5,67 olarak belirlenmiştir. Primer başına ortalama polimorfik bant sayısı ise ise 5,13 olarak bulunmuştur.
22
Cao ve ark. (2000) göre, populasyondaki genotipler arası benzerlik ve farklılıkların başarılı şekilde belirlenmesinde toplam 50 adet polimorfik band yeterlidir. Çalışmamızda 77 polimorfik bant elde edilmiş, belirtilen eşiğin üzerine çıkılmıştır.
Primer başına en fazla band 856 kodlu primerden (9 adet) elde edilirken, en az bant sayıları 810, 888 ve 890 kodlu primerlerden (4 adet) elde edilmiştir. 807, 808, 810 826, 835, 888, 890 ve 891 kodlu primerlerden edilen banların tamamı genotipler arasında polimorfik bulunmuştur. En düşük polimorfizm oranı % 78 ile 856 kodlu primerden elde edilmiştir. Primerlerden elde edilen banların polimorfizm oranlarının ortalaması ise % 91,33 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.1).
Çizelge 4. 1. Böğürtlen genotiplerinde toplam band ve polimorfik band sayıları, polimorfizm oranları ISSR Primer Kodu Primer Dizisi ve Anchorlar Band Sayısı Polimorfik Band Sayısı Polimorfik Band Oranı (%) 1 807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 7 7 100 2 808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 6 6 100 3 810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 4 4 100 4 811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 5 4 80 5 826 ACACACACACACACACC 6 6 100 6 835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 6 6 100 7 841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 5 4 80 8 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 7 6 86 9 844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 5 4 80 10 856 ACACACACACACACACYA 9 7 78 11 881 GGGTGGGTGGGTGGGT 7 6 86 12 888 BDBCACACACACACACA 4 4 100 13 889 DBDACACACACACACAC 5 4 80 14 890 VHVGTGTGTGTGTGTGT 4 4 100 15 891 HVHTGTGTGTGTGTGTG 5 5 100 Ortalama 5,67 5,13 91,33 Toplam 85 77
23
Şekil 4.3 Primer 807‟nin genotiplerdeki band profili
24
Şekil 4.5 Primer 810‟un genotiplerdeki band profili
25
Şekil 4.7 Primer 835‟in genotiplerdeki band profili
26
27
Şekil 4.10 Primer 888‟in genotiplerdeki band profili
Şekil 4.11 Primer 891‟in genotiplerdeki band profili
4.4. Ġstatistiki Analizlerde Kullanılacak Verilerin Elde Edilmesi
İstatistiki analizlerde kullanılacak veriler, ISSR bantlarının değerlendirilmesi ile elde edilmiştir. Bu teknik kullanılarak yaptığımız tekrarlı uygulamalarda elde edilen PCR ürünlerindeki bantlar kullanılmıştır. Üzerinde çalışılan her bireyde benzerlik ya da farklılıkları belirlemek amacıyla, aynı satırdaki bu bantlara bakılarak elde edilen sonuçlar var (1) ya da yok (0) şeklinde skorlanarak kaydedilmiştir.
4.5.Temel Koordinatlar Analizi (Principal Coordinate Analysis)
Bireyler arasındaki benzerlik/farklılık matrislerinin oluşturulmasında ve Temel Koordinatlar Analizi (TKoA)‟de Rohlf (2002) tarafından geliştirilen NTSYS-pc ver. 2.10d (NumericalTaxonomy and Multivariate Analysis System - Sayısal Taksonomi ve Çok Değişkenli Analiz Sistemi) paket programı kullanılmıştır.
28
A
B
ġekil 4.12. Böğürtlen genotiplerinin SM katsayısı kullanılarak elde edilmiş 1. ve 2. temel koordinat eksenleri (A) ve 1. ve 3. temel koordinat eksenleri (B) A
B B
29
üzerinde dağılımı
Temel koordinatlar analizinde B9, B16, B18 ve B23 genotipleri hem PC1-PC2 düzleminde hem de PC1-PC3 düzleminde diğerlerinden çok farklı grupta yer almıştır. Bu genotipler Karadeniz sahil kesimindeki 1000 m ve üzeri rakımlardaki yaylalardan alınmış olup, genotiplerde dikenler tüy şeklindedir. Ayrıca bazı diğer morfolojik özellikler bakımından diğerlerinden farklılıklar göstermektedir. Ayrıca PC1-PC2 düzleminde B35 ile B55 arası genotiplerle diğer genotipler ayrı ayrı kümelenmişlerdir. Bu genotipler Karadeniz bölgesi iç kesimlerden alınan örnekler olup, yine bunlar da sahildeki genotiplerle farklı kümeler oluşturmuştur.
4.6. Kümeleme Analizi (Cluster Analysis-UPGMA)
Kümeleme Analizi, dendrogram olarak adlandırılan ve genellikle ağaca benzer diyagram şeklinde gösterilen, benzer bireyleri grup veya küme içinde birleştirmek yoluyla oluşturulan bir metottur. Kümeleme işleminde birkaç metot vardır. Bunlar arasındaki fark, oluşan küme ile diğer bireyler arasındaki benzerlik/farklılığın nasıl hesaplandığından kaynaklanır. Bu metotlar: en yakın komşu (nearest neighbour), en uzak komşu (furthest neighbour) ve gurup ortalaması (group average) metotlarıdır. Bunlardan group average dominant markörlerin analizlerinde yaygın olarak kullanılır ve unweighted pair-groups method using arithmetic averages (UPGMA) olarak bilinir. Bu metotta iki küme arasındaki benzerlik/farklılık iki kümenin bütün bireylerinin ortalaması alınarak hesaplanır (Quinn ve Keough, 2002). ISSR PCR markörlerinin dominant olmasından dolayı çalışmalarımızda UPGMA kullanılmıştır.
30
ġekil 4.13. Böğürtlen genotiplerinde benzerlik katsayısı kullanılarak elde edilmiş UPGMA dendrogram Coefficient 0.52 0.64 0.75 0.87 0.99 B10MW B1 B14 B22 B4 B10 B13 B3 B8 B6 B15 B5 B26 B7 B12 B2 B19 B20 B21 B29 B34 B24 B28 B25 B30 B44 B38 B39 B43 B52 B17 B33 B40 B35 B36 B45 B37 B50 B51 B54 B41 B42 B46 B47 B55 B48 B53 B49 B31 B32 B9 B16 B18 B23
31
4.7. ISSR Analizleri Sonucu Elde Edilen Dendogramın Değerlendirilmesi
ISSR primerleri ile yapılan PCR analizleri sonucu elde edilen bant profillerinin değerlendirilmesiyle her bir bantın genotiplerdeki durumuna göre var-yok şeklinde programa girilmesi ve analiz sonucu elde edilen dendogram Şekil 4.13‟de görülmektedir. Dendogram önce biri küçük ve diğeri büyük olmak üzere iki ana gruba ayrılmıştır. Küçük ana grup Temel Koordinatlar Analizi sonucu hem PC1-PC2 hem de PC1-PC3 düzlemlerinde farklı bir küme oluşturan B9, B16, B18 ve B23 genotiplerinden oluşmuştur. Bu grupta B9 ve B16 %100 seviyesinde benzer bulunmuştur. B18‟in bu iki genotipe benzerlik derecesi ise %97 seviyesindedir. B23 genotipinin bu üç genotipe yakınlığı ise %86 civarındadır. Dendogramdaki iki ana grubun ayrılma noktası %52 seviyesindedir. Büyük ana grup daha sonra %60 benzerlik noktasında alt gruplara ayrılmaktadır. Dendogram genel olarak ele alındığında birbirine en yakın genotipler B9 ve B16, birbirine en uzak genotipler ise B1 ve B13 olarak belirlenmiştir.
32
5. SONUÇ
Böğürtlen genotiplerinden elde edilen dendrogramda genotipler biri küçük ve diğeri büyük olan iki ana grup altında toplanmıştır. Küçük ana grup özellikle bitkisel özellikler bakımından da morfolojik yönden diğer genotiplerden farklı olduğu kaydedilmiştir. Bu grup 1000 m rakım üzeri alınan genotiplerden oluşmakta, özellikle tüysü yapıda yumuşak ince dikenleri ile diğerlerinden ayrılmaktadır. Yine büyük ana grup incelendiğinde bunlarında istisnalar olmakla birlikte bitkilerin orjini olan coğrafik bölgelere göre, Karadeniz kıyı şeridi ve iç kesimler olarak ikiye ayrıldığı fark edilmektedir. Orijinal yerlerinden alındıktan sonra bu bitkilerden alınan çeliklerden çoğaltılan bitkilerin iki üç yıl sonra bile birbirinden farklı olması ve coğrafik orijinlerine göre farklı gruplarda yer alması, coğrafik orijinlerdeki bir takım çevresel veya iklimsel faktörlerin farklılıklara yol açtığı ve o bölgeden ayrılıp başka bölgelere nakledildiklerinde aynı özellikleri gösterdiği şeklinde yorumlanabilir. Bu farklılıkların kalıcı mutasyon mu ya da geri dönüşebilen çevreden kaynaklanan farklılıklar mı olduğu ilerde yapılacak çalışmaların konusu olabilir.
Farklı bölgelerden toplanan genotipler birbirine daha uzak bulunurken, aynı bölge genotiplerindeki genetik benzerlikler daha fazla olması, bölge içindeki genotiplerin birbirleriyle karşılıklı tozlanmaları sonucu bölge içindeki populasyonda farklılığı gittikçe azalttığı sonucunu gösterebilir. Çevre ve iklim faktörlerinin fenotipteki payları ve bölgeler arası gen akış yönü veya miktarlarının belirlenmesi ilerde yapılacak çalışmaların konusunu oluşturabilir.
Böğürtlen genotiplerinin Karadeniz bölgesinde gösterdigi varyasyon Anadoludaki biyoçeşitliliğin önemli bir göstergesidir. Bu çalışma daha geniş ölçekli olarak devam ettirildiği takdirde genotipler arasındaki çeşitliliğin evrimsel farklılaşmasını aydınlatmaya yardımcı olabilecektir. Bu ve benzeri araştırmalar Türkiye‟deki zengin gen potansiyelinin ortaya çıkarılmasına ve korunmasına katkı sağlayacaktır.
33
6. KAYNAKLAR
Ağaoğlu, Y.S., 1986. Üzümsü Meyveler. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yayınları: 84, Ders Kitabı:290, 377s.
Ağaoğlu, Y. S., Çelik, H., Çelik, M., Fidan, Y., Gülşen, Y., Günay, A., Halloran, N., Köksal, A. İ. ve Yanmaz, R., 2001. Genel Bahçe Bitkileri. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Eğitim, Araştırma ve Geliştirme Vakfı Yayınları, No:4, Ankara, 369 s.
Botstein, D., White, R.L., Skolnick, M. And Davis, R.W., 1980. Construction of a Genetic Map in Man Using Restriction Fragment Length Polimorphisms. American Journal of Human Genet. 32:314-331.
Cangi, R., İslam, A., 2003. Bazı Ahududu Çeşitlerinin Ordu Yöresine Adaptasyonu 2000-2001 Gözlem Sonuçları), Ulusal Kivi ve Üzümsü Meyveler Sempozyumu, 344-348, Ordu.
Çekiç, Ç., 2000. Markers For Positional Cloning Of Seasonal Flowering And Runnerıng Locı In Fragaria vesca L. Doktora tezi. Reading. İngiltere.
Cekic, C., Battey, N.H., Wilkinson, M.J., 2001.The Potential of ISSR-PCR primer pair combinations for genetic linkage analysis using the seasonal flowering locus in Fragaria vesca as a model. Theoretical And Applied Genetics, 103:4, 540-546. Çekiç, Ç., Çalış, Ç., 2005. Tokat Florasında Doğal Olarak Yetişen Yabani Çilek Tipleri
Arasındaki Varyasyonun Moleküler Markörlerle Belirlenmesi. II. Ulusal Üzümsü Meyveler Sempozyumu, 14-16 Eylül 2006, Tokat.
Charters, Y.M., Robertson, A., Wilkinson, M.J., Ramsay. G., 1996. PCR analysis of oilseed rape cultivars (Brassica napus L ssp oleifera) using 5'-anchored simple sequence repeat (SSR) primers, Theoretical and Applied Genetics, 92:3-4, 442- 447. Davis, P.H., 1972. Flora of Turkey and the East Agean Islands, Edinburgh University
pres.
Doyle, J.J., Doyle, J.L., 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue, Phytochemical Bulletin, 19:11-15.
Ercişli, S., 2004. A short review of the fruit germplasm resources of Turkey. Genetic Resources and Crop Evolution 51: 419–435.
Erenoğlu, B., Baş, M., Şarlar, G., Akçay, E., 2003. Bazı Üzümsü Meyvelerin (Ahududu, Böğürtlen, Frenk Üzümü, Bektaşi Üzümü, Yaban Mersini) Marmara Bölgesine Adaptasyonu. Ulusal Kivi ve Üzümsü Meyveler Sempozyumu, Ordu, s. 325-330. Fidan, Y., Ağaoğlu, Y.S., Çelik, H., 1976. Ankara Şartlarında Yetiştirilen Muhtelif
Ahududu ve Böğürtlen Çeşitlerinin Bazı Özelliklerinin Tespiti Üzerinde Araştırmalar. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Yıllığı 25 (4): 904-917.
Gerçekçioğlu, R., 1999. Tokat Yöresinde Doğal Olarak Yetişen Böğürtlenlerin (Rubus fructicosus L.) Seleksiyonu Üzerinde Bir Araştırma. Türk Tarım ve Ormancılık Dergisi, Cilt: 23 (Ek Sayı: 4): 977-981.
34
Kaplan, K., Akbulut, A., Apaydın, A., Çakır, O. 2003. Karadeniz Bölgesinde Ahududu Seleksiyonu Ve Islahı. Ulusal Kivi ve Üzümsü Meyveler Sempozyumu, Ordu, 361-365.
Lowe, A.J, Hinotte, O., Guarino, L., 1996. Standardization of Molecular genetic techniques for the characterization of germaplasm collections: The case of Random amplified Polymorphic DNA (RAPD). Plant Genetic Resources Newsletter. 107:50-54.
Onur, C., 2006.Üzümsü Meyveler Islah Programından Sempozyumlara. II. Ulusal Üzümsü Meyveler Sempozyumu. 14-16 Eylül, Tokat.
Onur, C., Onur, S., Kepenek, K.. 1999. Karadeniz bölgesinde Ahududu (Rubus ideasus L.) seleksiyonu. Türkiye III. Bahçe Bitkileri Kongresi, 14-17 Eylül, Ankara.
Özgen, M., Adak, S., Karagöz, A.., Ulukan, H., Bitkisel gen kaynaklarının korunma ve kullanımı. Türkiye Ziraat Mühendisliği 4. Teknik Kongresi, 9-13 Ocak 1995, Ankara, Ziraat Bankası Kültür Yayınları, 26: 309-343, (1995).
Quinn, G. P., Keough, M. J., 2002. Experimental Design and Data Analysis for Biologists. Cambridge University Press, 488-491.
Rafalski, J.A., Vogel, J.M., Morgante, M., Powell, W., Andre, C., and Tingey, S.V. 1996. Generating new DNA markers in plants. In Non-mammalian genomic analysis: A practical guide. Editedby B. Birren and E. Lai. Academic Press, New York.
Rohlf, F.J., 1992. NTSYS-pc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 1.8. Appl. Biostatistics, New York.
Şehirali, S., Özgen, M., 1987. Bitki genetik kaynakları. Ankara Üniv. Ziraat Fak. Yayınları No: 1020. Ders Kitabı: 294, Ankara.
Talbert, L.E., Blake, N.K., Chee, P.W., Blake, T.K., Magyar, G.M., 1994. Evaluation of "sequence-tagged-site" PCR products as molecular markers in wheat. Theoretical and Applied Genetics, 87(7):789-794.
Vavilov, N.I., 1951. The origin, variation, immunity and breeding of cultivated plants. The Chronica Botanica,Waltham, Mass, (K.S. Chester), 176. 13.
Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M., Zabeau, M., 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid Res 23, 4407-4414.
Welsh, J., McClelland, M., 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids research, 18; 7313-7318.
35
7. ÖZGEÇMĠġ
KiĢisel Bilgiler
Adı Soyadı : Derya KARAKOÇ Doğum Tarihi ve Yer : 04/05/1985 TOKAT Medeni Hali : Bekar
Yabancı Dili : İngilizce Telefon : Faks : e-mail : [email protected] Eğitim ĠĢ Deneyimi
Derece Eğitim Birimi Mezuniyet
Tarihi Lisans Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fak 2008
Lise Mehmet Akif Ersoy Lisesi 2002
