T.C.
EGE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ
KADIN HASTALIKLARI VE DOĞUM ANABİLİM DALI
BAŞKAN: PROF. DR. İSMAİL METE İTİL
LEPTİN HORMONUNUN OVCAR-3 VE MDAH-2774 OVER KANSERİ HÜCRE SERİLERİNDE HÜCRE ÇOĞALMASINA ETKİLERİ VE SİTOKİN/BÜYÜME
FAKTÖRÜ DEĞİŞİMLERİ
UZMANLIK TEZİ DR. FATİH DİNÇER
DANIŞMAN
PROF. DR. M. COŞAN TEREK
ii
ÖNSÖZ
Uzmanlık eğitimim boyunca iyi yetişmem için bana her konuda destek veren, bilgi ve deneyimlerini aktaran ana bilim dalı başkanımız Sayın Prof. Dr. İsmail Mete İtil’e teşekkür ederim.
Uzmanlık eğitimim ve tezimin her aşamasında desteğini gördüğüm, bu tezin gerek fikir gerekse sürdürülme aşamasında çok büyük pay sahibi olan, her konuda içtenlik ve samimiyetle yardımlarını esirgemeyen değerli hocam ve tez danışmanım Sayın Prof. Dr. M. Coşan TEREK’e teşekkür ederim.
Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı’nda uzmanlık eğitimim boyunca bilgi, deneyim ve yardımlarıyla bu alanda yetişmemde katkısı olan tüm değerli hocalarıma, başta Sayın Prof. Dr. Teksin ÇIRPAN, Doç. Dr. Ahmet Mete ERGENOĞLU ve Doç. Dr. Ahmet Özgür YENİEL, Yard. Doc. Dr. Ali AKDEMİR, Yard. Dr. Levent AKMAN ve Uzm. Dr. Nuri Yıldırım’a ayrıca birlikte çalışmaktan mutluluk duyduğum tüm araştırma görevlisi arkadaşlarıma ve servis, doğumhane, poliklinik, ameliyathane hemşire ve personeline teşekkür ederim.
Çalışmanın yürütülmesi sırasındaki katkılarından dolayı Tıbbi Onkoloji Bilim Dalı’ndan, Doç. Dr. Şaziye Burçak Karaca’ya, Harika Atmaca ve Latife Merve Oktay’a teşekkürlerimi bir borç bilirim.
Beni yetiştiren ve bugünlere ulaşmamı sağlayan aileme sonsuz teşekkür ederim.
iii
İÇİNDEKİLER
ÖNSÖZ... ... ii
İÇİNDEKİLER ... iii
ŞEKİLLER VE TABLOLAR LİSTESİ ... iv
ÖZET……… ... v ABSTRACT ... vi KISALTMALAR ... vii GİRİŞ ... ... 1 GENEL BİLGİLER... ... 2 GEREÇ ve YÖNTEM ……... ... 16 BULGULAR... ... 25 TARTIŞMA... ... 30 SONUÇ... ... 36 KAYNAKLAR……… ... 37
iv
ŞEKİLLER VE TABLOLAR LİSTESİ
Şekil 2.1: Leptin hormonunu kimyasal yapısı (a) ve 3 boyutlu protein yapısı (b). ... 9 Şekil 2.2: Leptin sinyal yolakları ... 11 Şekil 3: OVCAR-3 (a) ve MDAH-2774 (b) hücre hatlarının inverted mikroskop
Görüntüleri ... 17 Şekil 4: OVCAR-3 hücre hattında 48 saat serum açlığı sonrası 24. saatte ve MDAH- 2774 hücre hattında 24 saat serum açlığı sonrası 72. saatte hücre canlılığındaki
değişim miktarları. ... 27
Tablo 2.1: Over kanserlerinin histolojik özellikleri, öncüleri ve ayırıcı
moleküler özellikleri. ... 6 Tablo 3.1. Human Cytokine Antibody Array kitinin içerdiği 80 adet sitokin ... 23 Tablo 4.3: OVCAR-3 hücre hattında 48 saat serum açlığının ardından 24 saatlik
50 ng/ml leptin uygulanmış hücrelerde, leptin uygulanmamış hücrelere göre sitokin miktarlarındaki değişimler (kat olarak, pozitif değerler sitokin
değişimlerindeki artışı, negatif değerler azalmayı göstermektedir). ... 28 Tablo 4.4: MDAH-2774 hücre hattında 24 saat serum açlığının ardından 72 saatlik
25 ng/ml leptin uygulanmış hücrelerde, leptin uygulanmamış hücrelere göre
sitokin miktarlarındaki değişimler (kat olarak, pozitif değerler sitokin değişimlerindeki artışı, negatif değerler azalmayı göstermektedir). ... 29
v
KISALTMALAR
AKT protein kinaz B
AMPK AMP ile aktive olan protein kinaz BRCA1/2 meme kanseri geni 1/2
CA125 kanser antijeni 125 EGF epidermal büyüme faktörü ER östrojen reseptörü
GSK3A/B glikojen sentaz kinaz3 A/B HGSC ileri derecede seröz karsinoma
IFN interferon
IGFR insülin benzeri büyüme faktörü reseptörü
IGFRBP insülin benzeri büyüme faktörü reseptörü bağlanma proteini
IL interlökin
JAK/STAT janus kinaz / transkripsiyonun sinyal ileticileri ve aktivatörleri KRAS Kirsten fare sarkoma virüsü geni
LPA lizofosfotidik asit
MAPK mitojenle aktive olan protein kinaz MCP monosit kemoatraktan proteini NF-kB nüklear faktör kappa-B
NK doğal öldürücü
ng/ml nanogram / mililitre
Ob obezite geni
Ob-R obezite geni reseptörü PI3K fosfotidilinozitol-3 kinaz
PLC fosfolipaz C
PTEN fosfataz ve tensin homoloğu RB retinoblastoma geni
TGF transforme edici büyüme faktörü TNF tümör nekroz faktör
vi
ÖZET
Obezite çeşitli kanser tiplerinin gelişimiyle sıkı bağlantılı bir hastalıktır. Obezitenin, kanser riskini hangi biyolojik mekanizmalarla ve nasıl etkilediğine dair yapılan çalışmalar; farklı kanser türleri için farklı mekanizmaların söz konusu olabileceğini göstermektedir. Obez hastalarda leptin seviyelerinin normal populasyona göre daha yüksek olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada leptinin over kanseri hücrelerinde (OVCAR-3 ve MDAH-2774) hücre çoğalmasına ve sitokinlerin seviyeleri üzerindeki etkileri ortaya koymak amaçlanmıştır.
24 ve 48 saat serum açlığına bırakılan OVCAR-3 ve MDAH-2774 hücre hatlarında artan konsantrasyonlarda leptin uygulamasının (0.5-400 ng/ml) 24, 48 ve 72 saat sonunda hücre çoğalması üzerindeki etkilerini belirlemek amacıyla XTT testi, sitokin miktarlarındaki değişimleri belirlemek amacıyla sitokin array (Human Cytokine Array C5, RayBiotech) yöntemi kullanılmıştır. Elde edilen bulgular ANOVA ve ardından Dunnett’s istatistiksel analizleriyle değerlendirilmiştir.
Çalışmamızda 24 ve 48 saat serum açlığına bırakılan hücre hatlarında leptin uygulamasının hücre çoğalmasını artırdığı gözlenmiştir. 48 saat serum açlığına bırakılan OVCAR-3 hücre hattında 50 ng/ml leptin uygulaması ile 24. saatte hücrelerin kontrol hücrelerine göre %187.4 oranında çoğalması ile maksimum etki görülmüştür. 24 saat serum açlığına bırakılan MDAH-2774 hücre hattında ise 25 ng/ml leptin uygulaması ile 72. saatte hücrelerin kontrol hücrelerine göre %127.1 oranında çoğalması ile maksimum etki gözlenmiştir.
Leptin uygulaması sonucu her iki hücre hattında da interlökin ailesinden IL-3 ve IL-10 seviyelerinde artış, IL-2 seviyelerinde azalma, kemokinlerden MCP-2/CCL8 ve MCP-3/CCL7 seviyelerinde azalma ve insülin benzeri çoğalma faktörü bağlanma proteinleri (IGFBP) IGFBP-1, IGFBP-2 ve IGFBP-3 miktarlarında artış görülmüştür. OVCAR-3 hücre hattında leptin uygulaması ile interlökin ailesinden IL-1 seviyesinde artış belirlenmiştir. MDAH-2774 hücre hattında ise antianjiyojenik özellikteki IFN- γ miktarında azalma, inflamatuvar bir sitokin olan TGF- β miktarında artış görülmüştür.
Epidemiyolojik araştırmalar, obezitenin over kanseri insidansını arttırdığını, yaşam süresini ve nüks riskini arttırdığını göstermektedir. Bu çalışma klinik gözlemlerin altında yatan ve henüz tam olarak aydınlatılmamış olan moleküler mekanizmalar açısından bir kaynak oluşturmaktadır.
vii
ABSTRACT
Obesity is closely linked to the development of various cancer types. Studies on which biological mechanisms and how obesity affects the cancer risk showed that there may be different mechanisms for different types of cancer. It is known that leptin levels in obese patients are higher than in normal population. The objective of the present study is to reveal the effects of leptin on cell proliferation and cytokine levels in human ovarian cancer cell lines OVCAR-3 and MDAH-2774.
XTT test was used to evaluate the effect of increasing concentrations of leptin treatment (0.5 – 400 ng/ml) on cell proliferation in OVCAR-3 and MDAH-2774 cell lines at 24, 48 and 72 hours after 24h and 48h serum starvation, respectively. Human Cytokine Array was used to determine the changes in cytokine levels. The findings were evaluated by ANOVA followed by Dunnett’s statistical analyzes.
In our study it was observed that leptin treatment increased the cell proliferation after 24h and 48h serum starvation.
The maximum effect was observed with a proliferation of 187.4% compared to control cells in OVCAR-3 cell line with 50 ng/ml leptin treatment at 24h after 48h serum starvation. The maximum effect was observed with a proliferation of 127.1% compared to control cells in MDAH-2774 cell line with 25 ng/ml leptin treatment at 72h after 24h serum starvation.
As a result of leptin treatment, an increase in IL-3 and IL-10 levels, decrease in IL-2 level of interleukin family and decrease in MCP-2/CCL8 and MCP-3/CCL7 levels of chemokine family, an increase IGFBP-1, IGFBP-2 and IGFBP-3 levels of insulin-like growth factor binding protein family has been found in both of cell lines. An increase in IL-1 level in OVCAR-3 cell line, a decrease in antiangiogenic IFN-γ level and an increase TGF-β level that is inflamatuar cytokine has been detected in MDAH-2774 cell line.
Epidemiological studies have shown that obesity increased the ovarian cancer incidance, life span and risk of relapse. This study is a reference for the molecular mechanisms, which are not fully identified, underlying clinical observations.
1
1.GİRİŞ
Over kanseri jinekolojik kanserler içinde en ölümcül olanıdır. Bunun nedeni erken dönemde herhangi bir semptom vermemesi ve erken tanı için günümüzde etkili bir tarama yönteminin olmamasıdır (1,2). Over kanseri heterojen bir hastalıktır. Bu nedenle farklı jinekolojik dokulardan gelişen, farklı klinik tablo çizen, genetik farklılıklara sahip olan ve tedavi şekillerine farklı yanıtlar veren alt tiplere ayrılır. Over kanserleri başladıkları hücre tiplerine göre epitelial, germ hücreli ve stromal tümörler olarak adlandırılmaktadır. (3). Bunlar arasında over kanseri vakalarının %90’ını oluşturan epitelial over tümörleri; en sık görülenden en az görülene doğru sırasıyla; ileri derecede seröz (HGSC), berrak hücreli (CCC), endometrioid (EC), müsinöz (MC) ve düşük derecede seröz (LGSC) over kanseridir (4).
Hastaların küçük bir bölümünde yakınma olmadan jinekolojik muayene ve ultrasonografik inceleme sırasında overde değişik büyüklükte kitle saptanabilir. Hastaların büyük bir kısmında tümör karın içerisine yayılmıştır ve ileri evre olgularından oluşur. Bu hastalarda yapılan muayene, ultrasonografik inceleme veya diğer görüntüleme yöntemlerinde, batın içerisinde kitle ve assit saptanabilir. Serum CA125 düzeyi çoğu ileri evre olguda yüksek saptansa da, serum tümör belirteç düzeyinin düşük olması, olgunun malign olmadığını göstermez. Serum tümör belirteç düzeyi tanıdan çok, hastalığın izlemi için kullanılır.
Over kanseri hastalarında, başarılı sitoredüktif cerrahi ve platin bileşenleri ve taksanlarla kombine kemoterapi uygulamaları sayesinde 5 yıllık sağ kalım oranı son otuz yılda %37’den %45’e yükselmiştir (3). Tümör dokularının cerrahi müdahale ile çıkarılması ve kemoterapi sonrasında hastalarının %60-70’inde hastalık tekrarlamakta ve platin bazlı kemoterapiye direnç gelişmektedir (5). Bu nedenlerle over kanseri tedavisinde etkili yeni ajanların belirlenmesine ve yeni tedavi yaklaşımlarına ihtiyaç vardır.
Literatüre göre obezite geni (Ob) ürünü olan leptin hormonu ve over kanseri gelişimi arasında anlamlı bağlantılar bulunmaktadır. Leptin’in hücre çoğalmasını tetikleyen ve tümör oluşumuna katkıda bulunan mekanizmasının ortaya konulması ve bu yolların baskılanması alternatif bir tedavi yaklaşımı olarak düşünülebilir.
Bu amaçla bu tez çalışmasında, leptinin farklı konsantrasyonlarının, insan over kanserinin HGSC alt tipi olan OVCAR-3 ve EC alt tipi olan MDAH-2774 kültürlerinde hücre çoğalmasına etkileri ve ilgili olduğu sitokin molekülleri araştırılmıştır.
2
2. GENEL BİLGİLER
Adneksiyal kitle tanısı ile ilk akla gelen, overe ait kitle lezyonları ve sıklıkla da neoplazileridir. Fakat işlevsel kistler, yangısal kitleler, endometriozis ya da dış gebelik olasılığı daima akılda tutulmalıdır. Fizik muayene sırasında pelviste palpe edilen kitle overlere, uterusa, tubalara, barsaklara ya da üriner sisteme ait olabilir.
Pelvik muayenede kitlenin lokalizasyonu, büyüklüğü, şekli, kistik ya da solid kıvamda oluşu, hareketli ya da fikse oluşu, hassasiyetin tek ya da iki taraflı oluşu ve birlikte assit varlığı gibi özellikler belirlenmelidir. Kitlenin 5 cm’den küçük ya da büyük olması, benign veya malign olma olasılığı açısından önemlidir. Benign lezyonlar daha çok mobil olma eğiliminde olup, çevre dokuyla yapışık değildir. Tek taraflı lezyonların benign, çift taraflı lezyonların ise malign olma olasılığı yüksektir. Assit varlığına sıklıkla malign patolojilerde rastlanır.
2.1. Over Kanseri
Over kanseri jinekolojik kanserler arasında dünya çapında kanser ile ilişkili ölüm oranı en yüksek olan jinekolojik malignitedir. Bilinen 225.500 yeni vaka ve tahmini 140.200 ölüm oranına sahiptir (3). Over kanserindeki en önemli prognostik faktör, tanı anındaki hastalığın evresidir. American Cancer Society’nin 2016 yılı verilerine göre 22.280 yeni vaka ve 14.240 ölüm tespit edilmiştir (6). GLOBOCAN (WHO) 2008 verilerine göre Türkiye’de her yıl yaklaşık 1800 kadının over kanseri teşhisi aldığı, 1200 kadının da bu hastalık nedeniyle hayatını kaybettiği görülmektedir. Beş yıllık sağ kalım oranı yaklaşık %30’dur. Hastalığın mortalitesinin yüksek olmasının sebebi erken dönemde herhangi bir belirti vermemesi ve erken tanı için günümüzde etkili bir tarama yönteminin olmamasıdır (2). Olgularda belirgin bir yakınma ortaya çıkmadığı için çoğu ileri evrede tanı almaktadır. Belirtilerinin spesifik olmaması nedeniyle de hastaların çoğunda metastaz olmadan önce fark edilememektedir (1).
2.1.1. Over Kanseri Risk Faktörleri
Over kanseri gelişiminde; ilerlemiş yaş, genetik, erken menarş, yüksek yumurtlama döngüsü sayısı, geç menopoz, infertilite, beslenme alışkanlığı, obezite (özellikle BMI 30 ve üzeri olanlar), sigara kullanımı, virüsler, coğrafi alanlar ve ırksal varyasyonlar etkili olan faktörlerdir (2). Genetik profil bakımından özellikle BRCA1, BRCA2 ya da germline TP53 mutasyonları etkisiyle olan over, meme, corpus ve kolon kanserleri ile ilgili pozitif aile öyküsü görülmesi önemli risk faktörlerini oluşturmaktadır. Over kanserlerinin yaklaşık %15'i ailesel, %85’i sporadiktir (3).
3
Hamilelik ve oral kontraseptif kullanımının, ovulasyonu erteleyerek over yüzey epitelinin tamirini ortadan kaldırdığından, over kanserini azalttığı kabul edilmektedir (7).
Hankinson ve arkadaşlarının 121.700 kadın üzerinde yaptığı araştırmada, her doğumun over kanseri riskini azalttığı tespit edilmiştir. Whittemore, tek doğumun over kanseri riskini azalttığını (olasılık oranı 0.47), birden fazla doğumun bu riski daha da azalttığını, altıncı doğumda ise risk oranının oldukça düştüğünü tespit etmiştir (8). Oral kontraseptiflerin over kanseri riskini azalttığı bildirilmiştir (9).
Çağımızın önde gelen sorunlarından olan obezitenin, meme ve endometrium gibi hormon ile ilişkili kanserlerde anlamlı risk faktörü olduğu ortaya konulmuştur. Epidemiyolojik çalışmalarda obezite, artmış over kanseri riski ile ilişkili bulunmuştur. Yüksek vücut kitle indeksi (BMI) over kanseri oluşumu ile anlamlı ilişki göstermektedir (10,11). Olsen ve arkadaşlarının çalışmasında normal vücut kitle indeksi olan kadınlar ile karşılaştırıldığında obez kadınlarda epitelial over kanser riski %30 artmaktadır (12). Obesite ayrıca over kanserinde hastalıksız ve genel sağkalım üzerine olumsuz etkide bulunmaktadır (13).
2.1.2. Tarama ve Klinik Bulgular
Günümüzde over kanseri için yeterince etkili bir tarama yöntemi bulunmamaktadır. Ancak 40 yaşından itibaren, menapoz sonrası ve genetik olarak yatkınlığı bulunan ailesel meme ve over kanseri öyküsü olan kadınların düzenli olarak kontrol yaptırmaları önerilir.
Over kanseri erken evrelerde spesifik belirtiler vermemesine rağmen abdomenin alt ya da yan kısmında ağrı, karında doygunluk/şişlik hissi, iştahsızlık, bulantı/kusma, kabızlık, yorgunluk, sık idrara çıkma gibi şikayetler görülebilmektedir (14).
2.1.3. Tanı
Tanıda en çok kullanılan biomarker Cancer-antigen 125 (CA125)’tir. CA125, 3 ya da 4. evre epitelial over kanserlerinde %80 duyarlılık ve %97 spesifiteye sahiptir. Ancak evre 1’deki duyarlılığı %30 oranındadır ve artışı başka fizyolojik durumlarla ve benign olgularla ilişkilendirilebilir (2). Bu nedenle etkili tanı için farklı biomarker araştırmaları devam etmektedir.
2.1.4. Over Kanseri Alt Tipleri ve Moleküler Hücre Biyolojisi
Normal over dokusu gonadal sırttan gelişir ve farklı hücre tiplerinden meydana gelmiştir. Temelde 3 tip hücre içerir;
1) Endodermden türeyen, yumurtalığın iç kısmını örten ve çoğalıp oositlere farklılaşan germ hücreleri,
4
3) Müller kanalından türeyen, yumurtalığın dış kısmını örten ve over yüzeyinin hemen altındaki inklüzyon kistleri sınırını çizen epitelial hücreler (3, 15).
Bu 3 hücre tipinden herhangi birinden benign ya da malign tümörler gelişebilir. Germ hücreli tümörler (genellikle 20-30’lu yaşlarda) over kanserlerinin %3-5’inden sorumluyken, seks-kord-stromal tümörler (her yaşta görülebilir) %7’lik bir kısmı oluşturur. Genellikle 40 yaş ve üzerinde (menapoz sonrası) görülen epitelial over kanseri ise tüm over kanseri vakalarının %90 gibi çok büyük kısmından sorumludur (3).
Dünya Sağlık Örgütü (WHO) over tümörlerini histolojik farklılaşmalarına göre epitelial, seks-kord stromal ve germ hücreli tümörler olarak sınıflandırmaktadır. Tüm vakaların %90’nını oluşturan en büyük grup olan epitelial over tümörleri; seröz, müsinöz, endometrioid, berrak hücreli, geçiş hücreli ve Brenner tümörler olmak üzere alt gruplara bölünmüştür (16).
Klinik, hücresel ve moleküler olarak over kanserleri histolojik düzeye, moleküler fenotipe ve genotipe göre tip 1 ve tip 2 olmak üzere iki ana gruba ayrılır. Tip 1 over kanserleri; düşük dereceli seröz (LGSC), müsinöz (MC), endometrioid (EC) ve berrak hücreli (CCC) karsinomlardır. Bunlar genellikle yavaş büyüyen, erken evrede (I ya da II) tanı konulan tiplerdir ve konvensiyonel kemoterapiye dirençlidirler ancak hormonal tedaviye yanıt verebilirler. Daha yaygın olarak görülen tip 2 grubu ise ileri derecede seröz (HGSC), ileri derecede endometrioid ve farklılaşmamış olarak adlandırılan histotipleridir. Bu kanserler geç evrede (III-IV) ortaya çıkar, agresif olarak büyür ve konvensiyonel kemoterapiye, daha az olarak da hormonel tedaviye yanıt verir (3).
Over kanseri oluşumunda gen amplifikasyonu, germline ve somatik mutasyonlar, hipermetilasyonlar ve çok sayıda kromozomal delesyon ile tümör baskılayıcı genlerin ve onkogenlerin rol oynadığı bulunmuştur. Bu genler, kanser hücre çoğalması, canlılığını sürdürmesi, yayılması ve metastazında merkezi rol oynayan hücre sinyal ileti yolakları ile doğrudan bağlantılıdır.
Over kanseri ile ilişkili olan sinyal ileti yolakları; nükleer faktör kappa B (NF-kB) yolağı, Janus protein kinaz/ sinyal iletici ve transkripsiyon aktive edici protein 3 (Jak-STAT 3) yolağı, mitojen-aktive protein kinaz (MAPK) yolağı, proto-onkogen tirozin protein kinaz Src yolağı, ErbB aktivasyon yolağı, lizofosfotidik asit (LPA) yolağı, fosfatidilinositol 3 kinaz (PI3K) yolağı, Müllerian inhibitör madde reseptör yolağı, epidermal büyüme faktörü (EGF) yolağı, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VGEF) yolağı ve östrojen reseptör (ER) beta yolağıdır (2).
5
Tip 1 kanserlerde p53 ve BRCA1/2 genleri yabanıl tiptedir, ancak IGFR ekspresyonu ve PI3K yolağının aktivasyonu ile birlikte Ras ve Raf’ta sık mutasyonlar görülür. Tip 2 kanserlerin hemen hemen hepsinde p53 mutasyonu vardır, neredeyse yarısında BRCA1/2 mutasyonu ya da fonksiyon bozukluğu mevcuttur, ancak diğer mutasyonlar nadirdir. Bunlarda onkogenezin, Ras/MAPK ve PI3K yolaklarını aktive eden birçok çoğalma düzenleyici genin amplifikasyonu tarafından tetiklendiği görülmektedir (3).
Tip 2 HGSC’ler tüm over karsinomlarının %70’ni oluşturur ve bu hastalıktan ölümlerin %90’ınından sorumludur. Tedavi için klasik yaklaşım cerrahinin ardından platin bileşenleri ve taksanlarla kombine kemoterapidir. Ancak tedavinin ardından 6 ay içinde hastaların yaklaşık %25’inde platine dirençli kanser tekrarlamakta ve genel olarak 5 yıl hayatta kalma oranı %31 olarak bilinmektedir (4).
Over kanserinin belirli alt tipleri farklı jinekolojik dokular gibi göründüğünden, farklı klinik tablo çizdiğinden ve genetik farklılıklara sahip olabildiğinden çalışmamızda iki farklı alt sınıfa ait hücre hatları kullanıldı. Tercih ettiğimiz model hücre hatlarımızdan OVCAR-3, tip 2 HGSC sınıfına; diğer hücre hattı MDAH-2774, tip 1 endometrioid karsinom (EC) sınıfına dahildir.
Over kanserinin alt tiplerine göre histolojik yapıları ve moleküler özellikleri Tablo 2.1’de gösterilmiştir.
6
Tablo 2.1: Over kanserlerinin histolojik özellikleri, öncüleri ve ayırıcı moleküler özellikleri (3).
Moleküler
tip Histoloji Öncü Moleküler özellikler
I Düşük derecede seröz
karsinoma (LGSC)
Border-line
karsinoma sekans KRAS ve BRAF mutasyonları
I
Düşük derecede endometrioid
karsinoma
Endometriozis CTNNB1, PTEN mutasyonları ve mikrosatellit instabilitesi
I Müsinöz karsinoma
Cystadenoma-borderline sekans KRAS mutasyonları
I Berrak hücreli
karsinoma
Endometriozis olabilir
PTEN mutasyonları ve LOH*, PIK3CA mutasyonları
II İleri derecede seröz karsinoma (HGSC) İnklüzyon kistlerinden yeniden oluşum p53 mutasyonları, BRCA 1/2 mutasyonları ve BRCA1 metilasyonu II İleri derecede endometrioid karsinoma Epitelial inklüzyon kistleri p53 mutasyonları, BRCA 1/2 mutasyonları ve BRCA 1 metilasyonu II Farklılaşmamış karsinosarkoma - -
*LOH: heterozigosite kaybı
2.1.4.1. İleri Derecede Seröz Karsinom (HGSC) Moleküler Biyolojisi
HGSC’lerde %97 oranında p53 mutasyonları görülür (17). P53 hücre döngüsünün düzenlenmesinde ve DNA tamirinde anahtar bir rol oynar. Hücresel replikasyon meydana gelmeden önce p53 hücre döngüsünün G2 kontrol noktasında etki ederek hücre büyümesini durdurup DNA hasarının onarılması için hücreyi teşvik eder. Hasar onarılamayacak ise apoptozisi başlatır. Bu nedenle p53 mutasyonları DNA hasarının yayılmasına ve kromozomol instabiliteye yol açar (4).
Kalıtsal BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları HGSC’lerin %15’inden daha fazlasında görülürken, somatik BRCA1/2 mutasyonları ya da BRCA1 promotor metilasyonu %14-22’sinde görülür (18). Bu genlerin her ikisi de DNA tamir proteinlerini kodlar. Bu proteinlerin eksikliği homolog rekombinasyon sırasında DNA çift zincir kırıklarının onarımında kusura ve böylece kromozomal instabiliteye sebep olur. Normalde BRCA1/2 işlev kaybı hücreler için
7
ölümcüldür, ancak bu hücrelerde p53 mutasyonlarının varlığı hücrelerin hayatta kalmasını sağlar (4).
HGSC’lerin %50 ya da daha fazlasında bulunan homolog rekombinasyon kusurları; EMSY amplifikasyonu (olguların %8’inde), PTEN delesyonu (%7), RAD51C hipermetilasyonu (%2) ya da diğer nadir mekanizmalar sonucu da meydana gelebilir (4,19).
Kanser Genom Atlası (TCGA)’nda 400’den fazla HGSC ile yapılan derinlemesine moleküler araştırmalar, HGSC’de p53 ve BRCA1/2 hariç tek gen mutasyonlarının nadir olduğunu, istatistiksel olarak anlamlı düzeyde sadece altı gende tekrarlayan mutasyonların bulunduğunu ve bunların tümünün %10’dan daha az bir oranda görülen düşük frekanslı olaylar olduğunu göstermiştir (4).
HGSC’nin ayırıcı özelliği yalnızca tekrarlayan mutasyonlar değil aynı zamanda 100’den daha fazla sayıda tekrarlayan amplifikasyonlar ve delesyonların teşhis edilmesiyle ortaya konan çok sayıdaki somatik kopya sayı değişiklikleri (SCNA)’dir(4).
TCGA çalışmalarından elde edilen bilgiler retinoblastoma (RB), PI3K/RAS, NOTCH ve FoxM1 yolaklarının HGSC oluşumuna katkısı olduğunu göstermektedir. Bu yolaklar hastalığın tedavisi için yeni stratejiler geliştirilmesine adaydırlar (4).
HGSC oluşumunda rol oynayan bu mutasyon ve değişimler şunlardır: Kromozomal instabilite / anöploidi (%100)
P53 mutasyonları (> %90), BRCA kaybı (%30-45) Birkaç mutasyon, çok sayıda SCNA*
Homolog rekombinasyon defektleri
FoxM1 (vakaların %84’ü), RB (%67), PI3K/RAS (%45), NOTCH (%22) sinyal ileti değişiklikleri
*SCNA: somatik kopya sayısı değişiklikleri (4).
2.1.4.2. Endometrioid Karsinom (EC) Moleküler Biyolojisi
Endometrioid karsinoma (EC) over kanserlerinin yaklaşık %10’nunu oluşturur ve genellikle düşük dereceli olarak ve erken evrede ortaya çıkar (ileri derecede karsinoma dönüşebilir). Overdeki EC endometriumdaki EC’de gözlemlenen benzer morfolojik özelliktedir. Skuamoz farklılaşma ile glandüler görünümü karşılaşılan en yaygın modeldir (4).
AT’ce zengin etkileşim domaini içeren protein 1A (ARID1A) ve protein fosfataz 2’nin yapısal ve düzenleyici alfa altünitesi (PPP2R1A) mutasyonları hem berrak hücreli karsinoma hem de endometrioid karsinoma da görülür. EC’lerin %30’unda ARID1A mutasyonu, %12’sinde PPP2R1A mutasyonu vardır (4,20).
8
EC’lerin %38-50’sinde somatik mutasyonlar beta-katenin 1 (CTNNB1) geninin 3. ekzonunda meydana gelir ve vakaların %80’ninden fazlasında nüklear beta-katenin proteini tespit edilmiştir. PTEN geninin 3. ve 8. ekzonları arasında oluşan mutasyonların görülme sıklığı ise %20’dir (4).
PIK3CA mutasyonları da EC’de görülen bir mutasyon tipidir, ancak CCC’de görüldüğünden daha az rastlanır (21).
EC vakalarının yaklaşık %10’u yanlış eşleşme tamir proteinlerinin (MLS1, MSH2, MSH6 ve PMS2) ekspresyonunun kaybı ile ilişkilidir (4).
EC oluşumunda rol oynayan bu mutasyon ve değişimler şunlardır: PTEN, CTNNB1, ARID1A, PPP2R1A mutasyonları
Mikrosatellit instabilite (MSI) / yanlış eşleşme tamir proteini ekpresyonu kaybı (4). 2.2. Leptin
Yağ dokusu sadece enerji depolanması işi görmemekte aynı zamanda endokrin doku olarak çalışmaktadır. Yağ dokusundan östrojen, progesteron ve androjenler salınmaktadır. Cinsiyet hormonları dışında yağ dokusundan salınan majör hormon leptindir. Leptin vücutta enerji homeostazının sağlanmasında anahtar bir rol oynamaktadır.
Vücuttaki leptin düzeyi vücut ağırlığıyla bağlantılı olarak değişkendir ancak bu bağlantı lineer değildir katlanarak değişir (22,23). Kandaki leptin düzeyleri gece yarısı ve sabahın erken saatleri arasında daha yüksektir ve bu durum belki de gece boyunca açlığı baskılıyor olabilir (24). Kandaki leptin seviyesinin günlük ritmi yemek zamanları ile düzenlenebilir (25).
Kandaki leptin seviyesini etkileyen bazı özel durumlar vardır. Kısa süreli açlık-diyet (24-72 saat) durumunda kandaki leptin seviyesi düşer (26,27,28). Leptin açlığa adaptif yanıtın gelişmesinde kritik bir rol oynamaktadır (29,30).
Leptinin merkezi görevi hipotalamus üzerinden enerji metabolizmasını düzenlemek olsa da bunun dışında periferal etkileri de vardır. Perifer leptin fetal ve maternal metabolizma arasında bir modülatör, ergenlik döneminde seçimsel faktör, immün hücre ve beta adacık hücreleri aktivatörü ve büyüme faktörü olarak da işlev görür. Ayrıca insülin, glukagon, insülin-benzeri büyüme faktörü, büyüme hormonu, glukokortikoidler, sitokinler ve metabolitler gibi çeşitli hormonlar ve enerji düzenleyicilerle de etkileşir (32).
Leptin kadınlarda ve erkeklerde fertilite için gereklidir. Kadınlardaki ovulasyon döngüsü enerji dengesiyle bağlantılıdır. Enerji dengesi yüksek derecede negatif olduğunda (yani açlık durumunda) veya enerji akışı çok yüksek olduğunda (aşırı egzersiz yapıldığında) over döngüsü ve menstruasyon durur. Leptin düzeyleri ideal aralığın dışında olduğunda
9
yumurta kalitesini ve in vitro fertilizasyon sonucunu negatif olarak etkileyebilir (32). Ayrıca leptin hipotalamustan gonadotropin-salgılatıcı hormonu tetikleyerek üremede de rol alır (33).
Plesanta leptin üretir (34). gebelik boyunca leptin seviyeleri fetusun kilosuyla orantılı olarak artar ve doğumdan sonra düşer. Ayrıca leptin fetal membranlardan da eksprese olur. Uterin kontraksiyonlar leptin tarafından engellenir (35). Bunun dışında leptin hiperemezis gravidarum ve polikistik over sendromunda(36-37) rol oynar.
Leptin primer olarak beyaz adipoz dokudaki adipositler tarafndan üretilir. Bununla birlikte kahverengi adipoz doku, plasenta (sinsitiyotrofoblast), overler, iskelet kasları, mide (fundik glandların alt bölümünde), meme epitel hücrelerinde, kemik iliğinde (31), gastrik hücrelerde ve P/D1 hücrelerinde de üretilir (38).
Ob (leptin) geni insanlarda 7. kromozom üzerinde yerleşiktir. (39). Leptin obesite geni (OB) tarafından kodlanan 16-kDA ve 167 amino asitlik bir adipokin’dir. Moleküler formülü C87H138N22O28S2’dir. Leptin’in kimyasal yapısı şekil 1a’da ve 3 boyutlu protein yapısı şekil 1b’degösterilmiştir (Şekil 2.1) (40).
Şekil 2.1: Leptin hormonunu kimyasal yapısı (a) ve 3 boyutlu protein yapısı (b). b. Leptin hormonunun 3 boyutlu yapısı
10
Kanda plazma proteinlerine bağlanarak veya serbest formda dolaşır ve etkisini membran reseptörü olan obesite reseptörü (OB-R) üzerinden göstermektedir. Leptin reseptörünün alterntif kesim (alternative splicing) ile oluşan altı tip izoformu vardır (Ob-Ra, Ob-Rb, Ob-Rc, Ob-Rd, Ob-Re ve Ob-Rf) ve bunların hepsi tek bir genden (Ob-R) kodlanır (41). Ob-Rb hücre içi sinyalizasyonu gerçekleştirebilen tek izoformdur ve bu sinyalizasyon hipotalamik çekirdekte (42) Jak-Stat ve MAPK yolakları üzerinden olur (43). Leptin reseptörü sınıf 1 sitokin reseptörleri ailesine aittir ve bunlar tipik olarak membranın hücre dışındaki bölgesinde ‘sitokin reseptör homolog domain’i içerirler. Ligand bu bölgeye bağlanır. Diğer sınıf 1 sitokin reseptörleri gibi leptin sinyalizasyonunun da temelde JAK/STAT yolağı ile gerçekleştiği düşünülmektedir. Bugüne kadar ki verilere göre leptin sinyalizasyonu başlıca JAK/STAT, MAPK ve PI3K yolakları üzerinden gerçekleşmektedir (44). Sharma ve arkadaşlarının çalışmasında JAK/STAT ve AKT yolaklarının leptinin etki mekanizmasında anahtar rol oynadıkları gösterilmiştir (45).
2.2.1. Leptin Sinyal Yolağı
Ob-Rb (LEPRb) homodimer form oluşturur ve leptinle 1:1 sitokiometri ile bağlanır. Bu tetramerik reseptör/ligand kompleksi sinyal iletimi için temeldir. Leptin reseptörü hücre içi kinaz aktivitesinden yoksundur. Bu nedenle Janus Kinaz 2 (JAK2) gibi sitoplazmik kinazlara bağlanarak çoklu sinyal yolaklarına aracılık eder. JAK2’nin leptin tarafından aktivasyonu Ob-Rb’nin tirozin fosforilasyonunu tetikleyerek onun aktive olmasını sağlar. Leptin reseptörünün aktivasyonu da JAK/STAT, RAS/RAF/MAPK, IRS1/PI-3K, PLCγ ve AMPK/ACC gibi sinyal modüllerini aktive eder.
Aktive olmuş STAT’lar nukleusa geçerek sitokin sinyal supresörü 3 (SOC3) ve TIMP metalopeptidaz inhibitör 1 (TIMP 1) gibi genlerin ekspresyonlarını indükler. SOC3, Ob-R’nin tirozin rezidüsüne bağlanarak geri bildirim yoluyla leptin yolağının inhibisyonuna aracılık eder. Sitozolik PTP1B, JAK2 ve STAT3’ü defosforilleyerek leptin yolağını negatif yönde düzenler.
Leptinin reseptörüne bağlanması PTPN1’in fosforilasyonuyla sonuçlanır. Fosforillenmiş PTPN1, GRB2 için bir bağlanma bölgesi sunar. Bu bağlanma sonucunda RAS-RAF-MEK sinyalizasyonuyla ERK modülü aktive olur.
Leptin SH2B/JAK2/IRS kompleksinin etkileşimi ve oluşumunu tetikleyerek PI-3K aktivasyonunu indükler. PI-3K aktivasyonu da protein kinaz B (AKT1) ve bunun downstream sinyal kaskadındaki memeli rapamisin hedefi (mTOR), nitrik oksit sentaz 3 (NOS3) ve fosfodiesteraz 3A (PDE3A)’nın aktivasyonuna aracılık eder. Aktive olmuş AKT ayrıca
11
glikojen sentaz kinaz 3 alfa/beta (GSK3A/B) proteinlerini düzenler. İnhibitör KappaB kinazlar (IKK’lar) AKT aktivasyonuna yanıt olarak aktive olurlar. Aktive olmuş IKK’lar NF-kappaB’nin nuklear translokasyonunu indükler.
Ayrıca leptin 5’-AMP-ile aktive olan protein kinaz (AMPK) sinyalizasyonunu düzenler. AMPK enerji sensörü olarak işlev görür ve AMP’den ATP’ye yükselişe yanıt olarak aktive olur. Aktive olmuş AMPK, yağ asidi biyosentez-asetil-CoA karboksilaz (ACC) enziminin aktivitesini düzenleyerek yağ asidi biyosentezini düzenler.
PLC gamma da leptin sinyalizasyonu sonucu aktive olur. Aktive olmuş PLC gamma hücre içi kalsiyum seviyesini ve protein kinaz C aktivasyonunu düzenler. Bu bilgiler Şekil 2.2’de gösterilmiştir (Şekil 2.2) (46).
12
2.2.2. Leptin ve Over Kanseri İlişkisi
Over kanseri gelişmiş ülkelerde en sık görülen jinekolojik kanser tipidir. Obezitenin en önemli sağlık sorunlarından biri olduğu İngiltere’de her yıl yaklaşık 40.000 yeni over kanseri vakası görülmektedir. Sonuç olarak obezitenin over kanseri üzerindeki etkileri bu iki önemli sağlık sorunu arasındaki kritik bir kesişmeyi temsil eder (45).
Multi-fonksiyonel bir peptid hormonu olan leptinin iştah düzenlenmesi, kemik oluşumu, üreme fonksiyonu ve anjiyogenez gibi çok çeşitli biyolojik aktivitelere sahip olduğu bilinmektedir. Bu biyolojik aktiviteleri kanserde proliferasyon, invazyon ve metastazda önemli rol oynadığını göstermektedir (44, 45) Leptin obesite ile over karsinomu arasındaki ilişkiyi oluşturan hormon olabilir.
Uddin ve ark çalışmasında OB-R overekspresyonu over kanserlerinin %59’unda görülmüş ve kötü hastalıksız sağkalım ile ilişkili bulunmuştur. Leptin etkisi ile değişik büyüme faktörleri ve sitokinlerin düzeyleri etkilenmektedir. Yine bu çalışmada endometriyal over kanseri hücre hatlarında leptinin hücre çoğalmasını tetiklediği ve PI3K/AKT yolağını aktive ederek apoptozu inhibe ettiği gösterilmiştir (44).
Sharma ve arkadaşları (45) insan endometrium kanser hücrelerinde leptin’in proliferatif yanıtı ve invazyon yatkınlığını arttırdığı göstermişlerdir.
Yunanistan’da yapılan bir vaka kontrol çalışmasında leptinin endometriyal kanser insidansı ile güçlü pozitif ilişkisinin olduğu belirlenmiştir (45).
Chen ve arkadaşlarının çalışmasında leptinin meme kanseri hücre hattında doza ve zamana bağlı olarak hücre çoğalmasını tetiklediğini göstermişlerdir. Bu indüklemenin hücre döngüsü kritik moleküllerinden siklin D1’in ve proto-onkogen c-Myc ‘i upregülasyonu ile ve tümör süpresör p53 ile p21WAF1/CIP1’in downregülasyonu yoluyla gerçekleştiği belirtilmiştir (47).
Somasundar ve arkadaşlarının çalışmasında ise, leptinin meme, özefagus ve prostat kanseri hücre hatlarında hücre büyümesini tetiklediğini, ancak pankreas kanseri hücre hattında büyümeyi inhibe ettiğini göstermişlerdir. Bu sonuçlar leptinin çoğalma üzerindeki etkisinin organ türevine göre değiştiğini göstermektedir. Leptin ve leptin antagonizmi hücresel orijine göre kanser tedavisi üzerinde potansiyel bir etkiye sahip olabilir (48).
2.3. Over Kanserini Araştırmak İçin Kullandığımız Model Hücre Hatları
Çalışmamızda insan over kanserinin farklı alt tiplerini modelleyen ve farklı özelliklere sahip iki hücre hattı kullanıldı. Tip 1’e dahil olan ileri derecede seröz karsinoma (HGSC)’yı
13
modelleyen OVCAR-3 ve tip 2 sınıfından endometrioid adenokarsinomayı modelleyen MDAH-2774 hücre hatlarının özellikleri aşağıda detaylı olarak açıklanmıştır.
2.3.1. OVCAR-3 İnsan Over Kanseri Hücre Hattı
OVCAR-3 hücre hattı; 60 yaşında, Kafkasya kökenli, ilerlemiş over adenokarsinomlu hastanın asit sıvısından elde edilmiştir. Epitelial morfolojide olan hücreler hem atimik farede tümör hem de agarozda klonlar oluşturabilmektedirler. Kültüre edilen hücreler kendilerine özgü steroid hormon reseptörleri olan sitoplazmik androjen, östrojen (49) ve progesteron (50) bağlama makromolekülleri içermektedir. (49).
Anöploid bir dişiden elde edilen hücre hattı, homojen boyanma bölgesi ve double-minute kromozomu içeren anormal bir karyotipe sahiptir (49). Karyotip analizinde kromozom sayılarının triploidiye yakın değerlerde olduğu gözlenmiştir. Hücrelerde N11, N13, N14, N15, N16, N17 ve N22 kromozomları genellikle bulunmamaktadır. Bu kayıp kromozomların çoğu sitogenetik analizlerde marker olarak kullanılmaktadır. Bunlara ek olarak marker olarak bilinmeyen kromozomların büyük çoğunluğunda yapısal anormallikler görülmüştür. Karyotip analizleri sonucunda hücreler arasında kromozom sayısı ve yapılarının değişkenlik gösterdiği bulunmuştur (51).
Dizi analizleri sonucu OVCAR-3 hücre hattında p53 geninin mutant (248, Arg → Gln) olduğu belirlenmiştir. 743. nükleotidte Guanin’in Adenin’e değişimi nokta mutasyonu, 248. kodonda arjinin yerine glutamin aminoasidinin gelmesine sebep olmuştur (17).
2.3.2. MDAH-2774 İnsan Over Kanseri Hücre Hattı
İnsan over kanseri hücre hattı MDAH-2774; Kafkasya kökenli, endometrioid over adenokarsinomlu hastadan elde edilmiştir. Tümörün derecesi ve evresi ile ilgili bir bilgi bulunmamaktadır. Bu hücre hattının büyüme karakteristikleri ve tümörijenik potansiyeli, endometrioid over adenokarsinomunun klinik özellikleri ile paralellik göstermektedir (52).
MDAH-2774 hücre hattında yüksek derecede Wnt sinyal iletisi düzensizliği olduğu gösterilmiştir. Mutasyon analizlerinde Axis inhibitör 1 (AXIN1) geninde missense mutasyon sonucu sekans değişimi olduğu ve PI3K/Akt sinyal ileti yolağında bulunan K-ras geninin mutasyona uğradığı tespit edilmiştir. Bunların yanı sıra hücre hattının mutant p53 genine sahip olduğu belirtilmiştir (52).
14
2.4. Over Kanserinde Tedavi Yaklaşımları
Sitoredüktif cerrahi ile birlikte platinyum ve taksan kombinasyonları sayesinde over kanseri hastalarının 5 yıllık sağ kalım oranları %37’lerden %45’lere yükselmiştir.
Cerrahi girişim over kanserinin tüm evrelerinde önemli bir yer tutar. Teşhis sırasında sitoredüktif cerrahinin uygulanabilir olmadığı durumlarda neoadjuvan kemoterapiden sonra uygulanabilir. Optimal sitoredüktif cerrahi bağımsız bir prognostik faktör olmakla birlikte, amacı Uluslararası Jinekoloji Obstetri Federasyonu’nun (FIGO) standartlarına uygun evreleme ve sağaltım sağlamaktır. Nükseden hastalığın tedavisinde uygulanan sitoredüktif cerrahide, makroskobik tümörün tamamı alındığında sağ kalımın arttığı bilinmektedir.
Yeni teşhis edilen over kanseri hastalarında, sitoredüktif cerrahi sonrası 6 kür karboplatin ve paklitaksel kombinasyonu standart adjuvan tedavi olarak kabul edilmektedir. Karboplatin DNA’ya kovalent bağlanarak zincir içi ve zincirler arası çapraz bağlar meydana getiren alkilleyici bir ajandır. Paklitaksel mikrotübüllere nonkovalent olarak bağlanır ve mitotik iğ oluşumunu engelleyerek onların stabilitesini artırır. Her iki ajan da apoptozisi indükler (3). Kemoterapi genellikle intravenöz uygulanır ancak sitoredüktif cerrahi uygulanmış hastalarda yapılan çalışmalar intraperiotonel uygulanan terapinin mortalite riskini %20-25 azalttığını göstermiştir.
Primer kemoterapiden altı aydan sonra nükseden over kanserlerinde tekrar uygulanan karboplatin ve paklitaksel ile %20-50 cevap alınmaktadır. Nükseden hastalıkta antikanser ajanların karboplatin, paklitaksel ve cisplatin ile kombine edilmesi hastaların yaşam süresini uzatmaktadır. Platinyum duyarlı hastalıkta ise, karboplatinin paklitaksel, gemsitabin ve liposomal doksorubisinle kombinasyonunun tekli karboplatin uygulamasına göre daha etkin olduğu bilinmektedir. Altı aydan önce nükseden hastalık ise platinyum dirençli kabul edilir. Bu tip hastalarda liposomal doksorubisin, paklitaksel ve totptekan gibi çeşitli kemoterapötiklerin cevap oranları %10-30 arası değişmektedir ve hastaların yaşam sürelerini arttırmaktadır.
Bunların yanı sıra son zamanlarda uygulanan karın içi sıcak kemoterapi (Hyperthermic Intraperitoneal Chemotherapy-HIPEC) etkinliği bakımından başarılı sonuçları olan bir uygulamadır. Sitoredüktif cerrahinin ardından uygulanan HIPEC ve bunu takiben sistemik kemoterapi verilmesi şeklinde yapılan kompleks bir tedavi yöntemidir. Ameliyat sırasında karın içine verilen kemoterapi ilacının ısıtılması dokuya nüfuz etmesini kolaylaştırarak
15
etkinliğini artırır. En sık over kanserlerinde kullanılan HIPEC tedavisi ile 5 yıllık sağ kalım oranı yaklaşık %50’dir.
16
3. GEREÇ VE YÖNTEM
Çalışmamızda tip 2 ileri derecede seröz over kanserini modelleyen OVCAR-3 ve tip 1 endometrioid over kanserini modelleyen MDAH-2774 hücre hatlarında Leptin hormonunun hüvre çoğalması üzerindeki etkileri ve sitokin düzeylerindeki değişimlerin gösterilmesi amaçlanmıştırç
-Tümör hücre hattı:
OVCAR-3 ve MDAH-2774 hücre hatları Tülay Aktaş Onkoloji Hastanesi Tıbbi Onkoloji Araştırma Laboratuvarı’nın ICLC (Interlab Cell Line Collection, İtalya) ‘den temin ettiği ve çoğaltarak -80 °C’de stokladığı kanser hücre hatları panelinden temin edildi.
-Leptin:
Human Recombinant Leptin PeproTech, USA’dan temin edildi.
3.1. OVCAR-3 ve MDAH-2774 Hücre Hatlarının Çoğaltılması ve Kültür İşlemleri: -80 °C’de dondurucuda kriyotüpler içinde dondurma solüsyonunda muhafaza edilen hücreler 37 °C sıcaklıkta su banyosunda çözüldü. Çözülen hücrelere 10 ml besiyeri eklenerek 1000 devir/dk’da 10 dakika santrifüj edildi. Santrifüj işleminden sonra üstteki kısım atılıp, dipte kalan hücre çökeltisi taze besiyeri ile homojenize edilerek steril hücre kültür flasklarına aktarıldı.
OVCAR-3 hücre hattı, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 besiyeri, MDAH-2774 hücre hattı ise Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F12 (DMEM/Ham’s-F12) besiyeri kullanılarak idame ettirildi. Besiyerlerine ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) %10 oranında eklenerek hücreler için uygun besiyeri ortamı oluşturuldu. Mikrobiyal ve fungal enfeksiyonu önlemek için besiyerine %1 oranında penisilin-streptomisin ve Amphothericin-B ilave edildi. Hücreler 37 °C’de %5’lik CO2’li inkübatörlerde çoğaltıldı. Çalışma sırasında hücreler -80 °C’de dondurularak saklandı.
Hücre kültür işlemleri ultraviyole ile sterilize edilen laminar hava akımlı kabinlerde (NuAire, USA) steril ortamda gerçekleştirildi.
17
Çoğaltılan hücreler canlılık, çoğalma ve enfeksiyon açısından inverted mikroskopta her gün kontrol edildi. Hücre yoğunluğunun %80’nin üzerine ulaştığı belirlendiğinde pasajlanarak çoğaltıldı.
3.1.1. Hücre hattının pasajlanması:
Hücrelerin çoğalma durumları inverted mikroskopta incelenerek flask tabanını monolayer olarak kaplayıp kaplamadıkları kontrol edildi. Pasajlama işlemi için önce flaskların içindeki besiyeri dökülüp, hücrelerin üzerine 4 ml Tripsin–EDTA (Biological Industries, Indianapolis) eklendi. İnkübatörde yaklaşık 5 dakika bekletildikten sonra mikroskopta flask tabanından kalkıp kalkmadıkları kontrol edildi. Tabandan ayrışan hücrelerin üzerine, 4 ml besiyeri eklenerek, Tripsin-EDTA nötralize edildi ve ardından bu karışım, tüplere alınıp santirfüj edildi. Santrifüj sonrası üzerindeki süpernatant atılıp, tabandaki hücre çökeltisi 10 ml besiyeri ile homojenize edildi ve flasklara tekrar ekildi. Her pasaj sırasında yaklaşık 2 milyon hücre/10 ml besiyerinde olacak şekilde pasajlama yapıldı. OVCAR-3 (Şekil-3a) ve MDAH-2774 (Şekil-3b) hücrelerinin inverted ışık mikroskobu görüntüleri Şekil 3’te gösterilmiştir.
a) OVCAR-3 b) MDAH-2774
Şekil 3: OVCAR-3 (a) ve MDAH-2774 (b) hücre hatlarının inverted mikroskop görüntüleri
3.1.2. Hücrelerin Sayımı
Hücreler, deneylerde kullanılacak miktarlarda hazırlanabilmesi için sayım işlemine tabii tutuldu. Bunun için canlı hücrelerin sayımında en çok tercih edilen yöntemlerden biri
18
olan tripan mavisi ile boyama yapıldı. Tripan negatif yüklü bir boyadır. Canlı olan hücrelerin membranı zarar görmediğinden boya hücre içine girmez ve hücreler mikroskopta parlak renkte görünürler. Canlı olmayan hücreler ise boyayı absorbe ederler ve mikroskopta mavi renkli görünürler.
Hücre sayım işlemleri için flasklardaki hücrelerin üzerlerindeki besiyerleri dökülerek 4 ml Tripsin EDTA eklendi. Hücreler flask tabanından ayrılınca 4 ml besiyeri eklenerek steril santrifüj tüplerine alında ve 1000 devir/dk’da 10 dk santrifüj edildi. Üzerinde biriken süpernatant atılarak dipteki hücre pelleti taze besiyerinde homojenize edildi. Bu süspansiyondan 50 μl alınıp 50 μl Tripan mavisi ile 1:1 oranında karıştırıldı. Bu karışım hücre sayım cihazının (Invitrogen / Countess, ABD) lamına aktarıldı ve mililitredeki canlı hücre sayısı belirlendi.
Her deney düzeneği için bu işlemler tekrarlanarak uygun sayıda hücre ekimi yapıldı.
3.2. Leptin’in Çözülmesi ve Stok Solüsyonlarının Hazırlanması
Leptin liyofilize halde PeproTech, USA’dan temin edildi. 1 mg toz leptin, 1 ml steril moleküler grade suda çözülerek 1 mg/ml’lik ana stok hazırlandı. Hazırlanan stok solüsyon 20 ve 50 μl’lik küçük stoklara bölündü ve -20 °C’de saklandı. Her deney için bu küçük taze stoklar kullanıldı.
3.3. Leptin’in OVCAR-3 ve MDAH-2774 Hücre Çoğalmasına Etkilerinin Belirlenmesi
Hücre canlılığının belirlenmesinde deoksiribonükleik asit sentez hızının ölçülmesine dayalı yöntemler, metabolik aktivitenin ölçümüne dayalı testler, proliferasyon işaretleyicilerinin (marker) ölçümüne dayalı testler ve hücrelerdeki ATP miktarının ölçümüne dayalı yöntemler kullanılır (53).
XTT testi metabolik aktivitenin ölçümüne dayalı olarak çalışan bir yöntemdir. 2,3-Bis(2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolyum (XTT) suda çözünen bir tetrazolyum tuzudur. Bu tuz canlı hücre mitokondrilerindeki dehidrojenaz enzimi ile parçalandığında çözülebilir formazana dönüşür ve turuncu renk meydana gelir. Oluşan turuncu rengin
19
yoğunluğu ile metabolik olarak aktif hücrelerin sayısı doğru orantılıdır. Renk değişimi absorbans olarak ELISA okuyucu ya da spektrofotometre ile ölçülür (53,54).
Hücre canlılığının belirlenmesinde kullanılan bir diğer yöntem ise tripan mavisi ile boyamadır. Canlı hücrelerde membran bütünlüğü olduğundan negatif yüklü olan tripan boyası hücre içine giremez. Ölü hücreler ise bu boyayı hücre içine aldıklarından mavi renkte görünürler (54).
Çalışmamızda leptinin over kanseri hücre hatlarında hücre çoğalmasına etkilerini belirlemek amacıyla XTT testi (Roche, Almanya) ve tripan mavisiyle boyama yöntemi kullanıldı.
3.3.1. XTT Yöntemi
Tetrazolium tuzlarından biri olan XTT [ 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] hücre canlılığı ölçümünde sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem, metabolik olarak aktif hücreler tarafından tetrazolyum tuzu olan XTT‘nin suda çözünebilen turuncu renkli formazan tuzuna çevrilmesine dayanır. XTT uygulaması
gerçekleştirildikten sonra örnekler çok modlu plaka okuyucu tarafından analiz edilerek meydana gelen renk değişimine göre çoğalan hücre miktarları belirlenmektedir.
Her iki hücre hattında da Leptin’nin tüm dozları için deneyler 3 kez tekrar edildi ve her deneyde bir doz için 3’er kuyucuk kullanıldı.
OVCAR-3 ve MDAH-2774 hücreleri her bir kuyucukta 100 μl besiyeri içerisinde 104 hücre olacak şekilde 96 kuyucuklu plakalara ekildi.
Her iki hücre hattı da ayrı ayrı 24 saat ve 48 saat serum açlığına bırakıldı. Ardından Leptin’in 0.5, 5, 25, 50, 100, 125, 200 ve 400 ng/ml’lik dozları ile 24, 48 ve 72 saat muamele edildi. Her saat diliminde ve her doz için 3’er kuyucuk kullanıldı.
Leptin’in hücre çoğalması üzerine her saat dilimindeki etkilerini belirlemek için XTT solüsyonu uygulandı. XTT solüsyonu, sodyum 3’-[1-(fenil-aminokarbonil)-3,4-tetrazolyum]-bis (4-methoksi-6-nitro) benzen sülfonik asit hidrat ile N-metil
20
dibenzopirazin metil sülfat’ın (işaretleme ajanı/aktivasyon ajanı) 50:1 oranında karıştırılması ile hazırlandı.
Daha önce 96 kuyucuklu plakaya ekilen ve Leptin’in artan konsantrasyonları ile muamele edilen hücrelerin bulunduğu her bir kuyucuğun üzerine 100 µl XTT solüsyonu eklenerek toplam hacim 200 µl’ye tamamlandı.
Bu işlemden sonra hücre kültür plakaları 37˚C’de ve %5 CO2 içeren inkübatörde 4 saat bekletildi.
İnkübasyondan sonra her kuyucuğun absorbans değeri çok modlu plaka okuyucuda (Beckman Coulter, multimode detector, ABD), 450-690 nm referans dalga boyu aralığında ölçüldü.
3.3.2. Tripan Mavisi ile Boyama Yöntemi
OVCAR-3 ve MDAH-2774 hücre hatlarında Leptin’in 0.5, 25,50 ve 100 ng/ml dozları için deneyler iki kez tekrar edildi ve her deneyde biz doz için 2’şer kuyucuk kullanıldı.
Hücrelerin bulunduğu flasklardaki besiyerleri döküldü. Üzerlerine 4 ml Tripsin EDTA eklenerek yaklaşık 5 dk 37˚C’de inkübatörde bekletildi. Hücrelerin flask zemininden ayrılıp ayrılmadığı inverted mikroskop ile kontrol edildi. Hücreler flask zemininden kalkınca 1:1 oranında besiyeri ile nötralize edilip, 15 ml’lik steril santrifüj tüplerine alındı. 1000 devir/dk, 10 dakikia santrifüj edildikten sonra üst fazda biriken süpernatantları atıldı. Dibe çöken hücre pelleti 10 ml besiyeri içinde tekrar homojenize edildi.
Her bir kuyucukta 2 ml besiyeri solüsyonü içerisinde 2 x 106 hücre olacak şekilde 6 kuyucuklu plakalara ekildi. Ayrı ayrı 24 ve 48 saat serum açlığına bırakılan hücrelere 0.5,
21
25,50 ve 100 ng/ml leptin eklendi ve 24, 48, 72 saat muamale edildi. (her 48 saatte bir besiyeri yenilendi).
24, 48 ve 72. saatlerin sonunda kuyucuklardaki besiyerleri çekildi ve üzerlerine 500 µl Tripsin EDTA eklenerek yaklaşık 10 dakika inkübatörde bekletildi. Hücreler flask zemininden ayrılınca 1:1 oranında besiyeri ile nötralize edildi ve 2 ml’lik steril mikro santrifüj tüplerine alındı. Santrifüj işlemi sonunda tüplerdeki süpernatantlar atılarak dipte kalan hücre pelleti 2 ml besiyeri içerisinde homojenize edildi.
Oluşan hücre süspansiyonundan 50 µM alınarak 50 µM tripan mavisi ile 1:1 oranında karıştırıldı. Bu karışım otomatik hücre sayım cihazının (Invitrogen / Countess, ABD) lamına aktarıldı ve mililitredeki canlı hücre sayısı (hücre sayısı/ml) belirlendi.
Otomatik sayım cihazı ile paralel olarak Thoma lamı ile ışık mikroskobunda hücre sayımı yapıldı. Mililitredeki canlı hücre sayısının belirlenmesi için tüm sayımların ortalamaları hesaplandı. Leptin eklenen kuyucuklardaki canlı hücre sayısı ve leptin eklenmenmeyen kontrol kuyucuklarındaki canlı hücre sayılarının ortalamaları hesaplanarak karşılaştırıldı.
3.4. Sitokin Array ile Sitokin Miktarlarındaki Değişimlerin Belirlenmesi
OVCAR-3 ve MDAH-2774 hücre hatlarında leptin uygulamasının sitokin üretimi üzerindeki etkisini belirlemek için Human Cytokine Antibody Array (Raybiotech, GA, USA) kullanıldı. Kitin içerdiği protokole göre şuişlem basamakları uygulandı:
OVCAR-3 ve MDAH-2774 hücreleri 25 cm2’lik flasklara her flaskta 2 x 106 hücre olacak şekilde ekildi.
OVCAR-3 hücreleri önce 48 saat serum açlığına bırakıldı. Daha sonra 50 ng/ml leptin ile 48 saat muamele edildi. MDAH-2774 hücreleri de 24 saat serum açlığına bırakıldıktan sonra 50 ng/ml leptin ile 72 saat muamele edildi.
Sadece serumsuz besiyeri uygulanan kontrol hücreleri ve serum açlığına bırakıldıktan sonra leptin ile muamele edilen hücrelerin üzerlerindeki besiyerleri dökülerek kitti bulunan lizis solüsyonu ile muamele edildi ve hücre lizatları elde edildi.
22
Kontrol ve her bir sitokine spesifik olan antikorlar kitte bulunan nitroselüloz membranlarda (array) ikişer spot şeklinde tutunmuş halde bulunmaktadır.
İlk önce bu membranlar blok solüsyonuyla 30 dakika çalkalayıcıda tutularak bloke edildi.
Daha sonra her hücre hattı için leptin eklenmemiş ve leptin ile muamele edilmiş hücrelerden elde edilen protein örnekleri ayrı ayrı membranlara eklendi ve +4˚C’de bir gece boyunca inkübasyona bırakıldı.
Gece inkübasyonunun ardından her array 3 defa 5’er dakika yıkama solüsyonlarıyla yıkanarak bağlanmayan proteinler uzaklaştırıldı.
Yıkama işlemlerinden sonra arraylar hazırlanan biotinlenmiş antikor kokteyli ile oda sıcaklığında 2 saat inkübasyona bırakıldı.
Yıkama basamakları tekrarlandı.
Ardından arrayler streptavidin bağlı horseradish peroksidaz (HRP-streptavidin) ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edilerek sitokin belirlenmesi tamamlandı.
Yıkama basamakları tekrarlandı.
Arrayler plastik sheetlere alınarak üzerlerine hazırlanan deteksiyon buffer karışımı eklendi, oda sıcaklığında ve karanlıkta 2 dakika bekletildi.
Sinyallerin kemilüminesans olarak belirlenmesi için Kodak® Gel Logic 1500 görüntüleme sistemi kullanıldı.
Görüntülemeden elde edilen spotlar Koadaarray® 2.6 bilgisayar yazılım programı ile kantitatif olarak hesaplandı ve analiz edildi.
23
Tablo 3.1. Human Cytokine Antibody Array kitinin içerdiği 80 adet sitokin
Angiogenin BDNF BLC (CXCL13) CK beta 8-1 (CCL23) EGF ENA-78 (CXCL5) Eotaxin-1 (CCL11) Eotaxin-2 (MPIF-2/CCL24) Eotaxin-3 (CCL26) FGF-4 FGF-6 FGF-7 (KGF) FGF-9 Flt-3 Ligand Fractalkine (CX3CL1) GCP-2 (CXCL6) GCSF GDNF GM-CSF GRO alpha (CXCL1) GRO alpha/beta/gamma HGF I-309 (TCA-3/CCL1) IFN-gamma IGF-1
IGFBP-1 IGFBP-2 IGFBP-3 IGFBP-4 IL-1 alpha
(IL-1 F1) IL-1 beta
(IL-1 F2)
IL-2 IL-3 IL-4 IL-5
IL-6 IL-7 IL-8
(CXCL8)
IL-10 IL-12 p40/p70
IL-13 IL-15 IL-16 IP-10
(CXCL10) Leptin LIF LIGHT (TNFSF14) MCP-1 (CCL2) MCP-2 (CCL8) MCP-3 (MARC/CCL7) MCP-4 (CCL13) M-CSF MDC (CCL22) MIF MIG (CXCL9) MIP-1 beta (CCL4) MIP-1 delta (CCL15) MIP-3 alpha (CCL20) NAP-2 (PPBP/CXCL7) NT-3 NT-4 Oncostatin M Osteopontin (SPP1) Osteoprotegerin (TNFRSF11B) PARC (CCL18) PDGF-BB PLGF RANTES (CCL5) SCF SDF-1 alpha (CXCL12 alpha) TARC (CCL17)
TGF beta 1 TGF beta 2 TGF beta 3 Thrombopoietin (TPO)
TIMP-1 TIMP-2 TNF alpha TNF beta
(TNFSF1B)
VEGF-A
3.5. İstatistiksel Analiz
Leptinin 0.5, 5, 25, 50, 100, 125, 200 ve 400 ng/ml dozlarının her biri XTT ve tripan uygulamaları için üçer kuyucukta test edildi ve her bir doz denemesi üç kez tekrarlandı. Her bir doz için üçer kuyucuktaki mikroplaka okuyucudan elde edilen absorbans değerlerinin ortalaması alındı ve ± SD değerleri hesaplandı. Artan dozların her birine ait hesaplanan değerler pozitif kontrol değerleriyle karşılaştırılarak hücre çoğalmasındaki artış miktarı
24
açısından anlamlı bir farklılığın olup olmadığı tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett’s t-test kullanılarak ortaya konuldu. Elde edilen değerler Graphpad Prism 5.0 istatistik yazılımına aktarılarak leptinin artan dozlarına ait doz ve zamana bağlı cevap eğrileri ve grafikleri çizildi. Sitokin arrayden görüntülemesinden elde edilen spotlar Koadaarray® 2.6 bilgisayar yazılım programı ile kantitatif olarak hesaplandı ve analiz edildi.
25
4. BULGULAR
4.1. Leptinin OVCAR-3 ve MDAH-2774 Hücre Hatlarında Hücre Çoğalması Üzerindeki Etkileri ile İlgili Bulgular
Leptinin insan over kanseri hücre kültürlerinde (OVCAR-3 ve MDAH-2774) hücre çoğalması üzerindeki etkileri hem artan doza (0.5, 5, 25, 50, 100, 125, 200, 400 ng/ml) hem de zamana (24., 48., 72. saat) bağlı olarak incelendi ve bulgular Tablo 4.1 ve Şekil 4.1’de gösterildi.
OVCAR-3 Leptin
(ng/ml)
24 saat serum açlığı 48 saat serum açlığı
24. saat 48. saat 72. saat 24. saat 48. saat 72. saat
0.5 130.5 80.9 78.5 141.7 8.5 78.5 5 129.2 50.3 64.3 113.1 73.7 86.7 25 137.5 89.6 83.4 142.9 110.7 62.7 50 148.9 76.6 127.4 187.4 117.7 71.8 100 179.2 83.4 96.3 147.6 140.9 82.9 200 125.9 91.9 122.6 123.8 89.5 65.7 400 139.2 104.2 119.4 120.9 107.1 62.1 MDAH-2774 Leptin (ng/ml)
24 saat serum açlığı 48 saat serum açlığı
24. saat 48. saat 72. saat 24. saat 48. saat 72. saat
0.5 109.2 107.1 93.8 101.3 102.1 92.8 5 103.7 108.9 112.9 102.9 107.8 99.1 25 99.4 120.8 127.1 105.7 114.3 101.8 50 113.5 105.5 122.4 100.6 120.2 110 100 96.2 107.2 123.7 104.6 117.3 105.9 200 116.1 92.6 111.7 101.6 109.1 89.5 400 112.6 119.6 108.8 116.2 108.3 93.6
26
1. 24 saat serum açlığına bırakıldıktan sonra leptin uygulanmayan ve leptinin çeşitli dozlarıyla muamele edilen OVCAR-3 hücrelerinde 24. saatte hücre çoğalması yüzdeleri aşağıdaki gibidir: * 0.5 ng/ml leptin % 130.5 * 25 ng/ml leptin % 137.5 * 50 ng/ml leptin % 148.9 * 100 ng/ml leptin % 179.2 * 200 ng/ml leptin % 125.9 * 400 ng/ml leptin % 139.2
2. 48 saat serum açlığına bırakıldıktan sonra leptin uygulanmayan ve leptinin çeşitli dozlarıyla muamele edilen OVCAR-3 hücrelerinde 24. saatte hücre çoğalması yüzdeleri aşağıdaki gibidir: * 0.5 ng/ml leptin % 141.7 * 25 ng/ml leptin % 142.9 * 50 ng/ml leptin % 187.4 * 100 ng/ml leptin % 147.6 * 200 ng/ml leptin % 123.8 * 400 ng/ml leptin % 120.9
3. 24 saat serum açlığına bırakıldıktan sonra leptin uygulanmayan ve leptinin çeşitli dozlarıyla muamele edilen MDAH-2774 hücrelerinde 48. saatteki hücre çoğalması yüzdeleri aşağıdaki gibidir:
* 25 ng/ml leptin % 120.8 * 400 ng/ml leptin % 119.5
4. 24 saat serum açlığına bırakıldıktan sonra leptin uygulanmayan ve leptinin çeşitli dozlarıyla muamele edilen MDAH-2774 hücrelerinde 72.saatteki hücre çoğalması yüzdeleri aşağıdaki gibidir:
* 5 ng/ml leptin % 126.7 * 25 ng/ml leptin % 127.1 * 50 ng/ml leptin % 122.4 * 100 ng/ml leptin % 123.7
27
5. 48 saat serum açlığına bırakıldıktan sonra leptin uygulanmayan ve leptinin çeşitli dozlarıyla muamele edilen MDAH-2774 hücrelerinde 48.saatteki hücre çoğalması yüzdeleri aşağıdaki gibidir:
* 5 ng/ml leptin % 124.1 * 50 ng/ml leptin % 124.5
6. 48 saat serum açlığına bırakıldıktan sonra leptin uygulanmayan ve 50 ng/ml leptin ile muamele edilen MDAH-2774 hücrelerinde 72.saatteki hücre çoğalması yüzdesi % 123.7 olarak belirlenmiştir (p<0.05).
7. Diğer konsantrasyon ve zamanlarda anlamlı bir değişim saptanmamıştır.
Şekil 4: OVCAR-3 hücre hattında 48 saat serum açlığı sonrası 24. saatte ve MDAH-2774 hücre hattında 24 saat serum açlığı sonrası 72. saatte hücre canlılığındaki değişim miktarları.
4.2. Sitokin Antikor Array Bulguları
Sitokin antikor array yöntemiyle ölçülen ve istatistiksel olarak anlamlı değişim gösteren sitokinlerin miktarlarındaki değişim Tablo 4.3 ve 4.4’de verilmektedir.
28
Tablo 4.3: OVCAR-3 hücre hattında 48 saat serum açlığının ardından 24 saatlik 50 ng/ml leptin uygulanmış hücrelerde, leptin uygulanmamış hücrelere göre sitokin miktarlarındaki değişimler (kat olarak, pozitif değerler sitokin değişimlerindeki artışı, negatif değerler azalmayı göstermektedir).
Sitokinin Adı Değişim Miktarı
GM-CSF 3,1 Gro a/b/g 1,95 Gro alfa (CXCL1) 2,2 IL-1 (IL-1 F1) 2,9 IL-2 -2,1 IL-3 -1,8 IL-5 -2,4 IL-8 (CXCL 8) 1,6 IL-10 2,3 IL-12 (p40/p70) 1,7 IL-13 1,7 MIG (CXCL9) -2,3 MIP-1 delta -2,1 TNF beta (TNFSF 1B) -1,8 EGF 1,9 PDGF-BB 2,1 BDNF 1,7 BLC (CXCL 13) 1,8 Ck beta 8-1 (CCL23) -1,8 Eotaxin-1 (CCL11) 1,7 FGF-6 1,8 GCP-2 (CXCL6 ) 1,7 IGFBP-1 1,9 IGFBP-3 2,4 LIGHT (TNFSF14) 1,6 MCP-4 (CCL13) 3,7 NT-4 3,3 PLGF 2,9 TGF beta 3 6,6
29
Tablo 4.4: MDAH-2774 hücre hattında 24 saat serum açlığının ardından 72 saatlik 25 ng/ml leptin uygulanmış hücrelerde, leptin uygulanmamış hücrelere göre sitokin miktarlarındaki değişimler (kat olarak, pozitif değerler sitokin değişimlerindeki artışı, negatif değerler azalmayı göstermektedir).
Sitokinin Adı Değişim Miktarı
ENA-78 (CXCL5) -3,6 G-CSF -2,1 IL-2 -2,6 IL-3 -2,5 IL-10 -2,3 IFN-gamma -1,9 MCP-2 (CCL8) -2,4 MCP-3 (CCL7) -2,2 MIG (CXCL9) 8,8 PDGF-BB -2,2 BDNF -1,6 Eotaxin-1 (CCL11) -2,3 FGF-4 1,7 FLT-3 Ligand -2,1 IGFBP-2 -2 IL-16 1,8 MCP-4 (CCL13) -1,7 NAP-2 (CXCL7) -1,7 OPN (SPP1) -1,9 PLGF -1,9 TGF beta 3 2
30
TARTIŞMA
Son yıllarda insidansı hızlı bir artış gösteren obezite gelişmiş ülkeler için önemli bir sağlık problemidir. Diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, prostat, meme, özafagus, kolon ve akciğer kanserleri için risk faktörü olarak kabul edilmektedir (55). Epidemiyolojik araştırmalar, obezitenin over kanseri insidansını arttırdığını, yaşam süresini ve nüks riskini arttırdığını göstermektedir (56-60). Ancak klinik gözlemlerin altında yatan moleküler mekanizmalar henüz aydınlatılamamıştır.
Çok fonksiyonlu peptid bir hormon olan leptin, iştah düzenlenmesi, kemik oluşumu ve anjiyogenez gibi çeşitli biyolojik aktivitede rol alır. Leptin helikal sitokin familyasına ait adipositler tarafından salgılanan bir hormondur. Leptinin yapısı interlökin (IL)-6 ve IL-11 ile benzerlik gösterirken, leptin reseptörü de IL-6 reseptörü ile homoloji göstermektedir (31). Hormon olarak yiyecek alımı, bazal metabolizma gibi görevler görür. Sitokin olarak timik homeostazı ve IL-1 ve tümör nekroz faktör gibi akut faz reaktanlarının sekresyonlarını etkiler. Diğer proinflammatuvar sitokinler gibi T helper 1 (TH1)- hücre diferansiyasyonuna yardımcı olur ve hayvanlarda deneysel olarak oluşturulmuş hastalıklarda otoimmün yanıtların başlatılmasında ve modülasyonunda rol oynar (32).
Overde leptin reseptörü eksprese olması ve foliküler sıvıda leptin bulunması leptinin over fonksiyonlarında rolü olduğunun göstergesidir (61). Leptin seviyesinin vücut yağ içeriği ile güçlü bir ilişkisi olduğu ve obez bireylerdeki miktarının normal kilolu bireylerdekine oranla çok daha yüksek olduğu gösterilmiştir (62, 63). Plazma leptin seviyelerinin fazla kilolu ve obez kadınlarda (37.7 ng/ml) normal kadınlara oranla daha yüksek olduğu belirlenmiştir (3.92–16.9 ng/ml).
Leptinin doğal ve edinsel immünitede önemli rol oynadığı bilinmektedir. İnfeksiyon / inflamasyon sırasında leptin düzeyinin artmasının konağın inflamasyona verdiği yanıtta önemli bir faktör olduğunu düşündürmektedir. Enfeksiyonların seyri sırasında görülen anoreksinin konağın akut faz yanıtı olduğuna inanılmaktadır. Bakteri/virüs ürünleri de proinflamatuvar sitokinlerin (IL’ler, tümör nekroz faktörü-alfa-TNF α, interferonlar) yapımını uyarır. Sitokinler de yağ dokusunda leptin ekspresyonunu artırır. Hem mikrobik ürünler, hem de oluşan sitokinler ve leptin gıda alımını azaltır. Bu nedenle, inflamasyon ve enfeksiyon sırasında gelişen anoreksiden özellikle TNF-α, IL-1 ve IL-6’nın sorumlu olduğu ve sitokinlerin bu etkilerinde kısmen leptinin aracılık ettiği düşünülmektedir (30). Leptinin lökosit sentezi üzerine stimüle edici etkisinin yanı sıra, eritropoietinin eritrositler üzerindeki uyarıcı etkisini kuvvetlendirdiği gösterilmiştir. Bakteriyel antijenlere benzer şekilde leptin, makrofajları da aktive eder, makrofajların fagositik aktivitelerini artırır ve makrofajlardan
