Sitokin Antikor Array Bulguları

Sitokin antikor array yöntemiyle ölçülen ve istatistiksel olarak anlamlı değişim gösteren sitokinlerin miktarlarındaki değişim Tablo 4.3 ve 4.4’de verilmektedir.

28

Tablo 4.3: OVCAR-3 hücre hattında 48 saat serum açlığının ardından 24 saatlik 50 ng/ml leptin uygulanmış hücrelerde, leptin uygulanmamış hücrelere göre sitokin miktarlarındaki değişimler (kat olarak, pozitif değerler sitokin değişimlerindeki artışı, negatif değerler azalmayı göstermektedir).

Sitokinin Adı Değişim Miktarı

GM-CSF 3,1 Gro a/b/g 1,95 Gro alfa (CXCL1) 2,2 IL-1 (IL-1 F1) 2,9 IL-2 -2,1 IL-3 -1,8 IL-5 -2,4 IL-8 (CXCL 8) 1,6 IL-10 2,3 IL-12 (p40/p70) 1,7 IL-13 1,7 MIG (CXCL9) -2,3 MIP-1 delta -2,1 TNF beta (TNFSF 1B) -1,8 EGF 1,9 PDGF-BB 2,1 BDNF 1,7 BLC (CXCL 13) 1,8 Ck beta 8-1 (CCL23) -1,8 Eotaxin-1 (CCL11) 1,7 FGF-6 1,8 GCP-2 (CXCL6 ) 1,7 IGFBP-1 1,9 IGFBP-3 2,4 LIGHT (TNFSF14) 1,6 MCP-4 (CCL13) 3,7 NT-4 3,3 PLGF 2,9 TGF beta 3 6,6

29

Tablo 4.4: MDAH-2774 hücre hattında 24 saat serum açlığının ardından 72 saatlik 25 ng/ml leptin uygulanmış hücrelerde, leptin uygulanmamış hücrelere göre sitokin miktarlarındaki değişimler (kat olarak, pozitif değerler sitokin değişimlerindeki artışı, negatif değerler azalmayı göstermektedir).

Sitokinin Adı Değişim Miktarı

ENA-78 (CXCL5) -3,6 G-CSF -2,1 IL-2 -2,6 IL-3 -2,5 IL-10 -2,3 IFN-gamma -1,9 MCP-2 (CCL8) -2,4 MCP-3 (CCL7) -2,2 MIG (CXCL9) 8,8 PDGF-BB -2,2 BDNF -1,6 Eotaxin-1 (CCL11) -2,3 FGF-4 1,7 FLT-3 Ligand -2,1 IGFBP-2 -2 IL-16 1,8 MCP-4 (CCL13) -1,7 NAP-2 (CXCL7) -1,7 OPN (SPP1) -1,9 PLGF -1,9 TGF beta 3 2

30

TARTIŞMA

Son yıllarda insidansı hızlı bir artış gösteren obezite gelişmiş ülkeler için önemli bir sağlık problemidir. Diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, prostat, meme, özafagus, kolon ve akciğer kanserleri için risk faktörü olarak kabul edilmektedir (55). Epidemiyolojik araştırmalar, obezitenin over kanseri insidansını arttırdığını, yaşam süresini ve nüks riskini arttırdığını göstermektedir (56-60). Ancak klinik gözlemlerin altında yatan moleküler mekanizmalar henüz aydınlatılamamıştır.

Çok fonksiyonlu peptid bir hormon olan leptin, iştah düzenlenmesi, kemik oluşumu ve anjiyogenez gibi çeşitli biyolojik aktivitede rol alır. Leptin helikal sitokin familyasına ait adipositler tarafından salgılanan bir hormondur. Leptinin yapısı interlökin (IL)-6 ve IL-11 ile benzerlik gösterirken, leptin reseptörü de IL-6 reseptörü ile homoloji göstermektedir (31). Hormon olarak yiyecek alımı, bazal metabolizma gibi görevler görür. Sitokin olarak timik homeostazı ve IL-1 ve tümör nekroz faktör gibi akut faz reaktanlarının sekresyonlarını etkiler. Diğer proinflammatuvar sitokinler gibi T helper 1 (TH1)- hücre diferansiyasyonuna yardımcı olur ve hayvanlarda deneysel olarak oluşturulmuş hastalıklarda otoimmün yanıtların başlatılmasında ve modülasyonunda rol oynar (32).

Overde leptin reseptörü eksprese olması ve foliküler sıvıda leptin bulunması leptinin over fonksiyonlarında rolü olduğunun göstergesidir (61). Leptin seviyesinin vücut yağ içeriği ile güçlü bir ilişkisi olduğu ve obez bireylerdeki miktarının normal kilolu bireylerdekine oranla çok daha yüksek olduğu gösterilmiştir (62, 63). Plazma leptin seviyelerinin fazla kilolu ve obez kadınlarda (37.7 ng/ml) normal kadınlara oranla daha yüksek olduğu belirlenmiştir (3.92–16.9 ng/ml).

Leptinin doğal ve edinsel immünitede önemli rol oynadığı bilinmektedir. İnfeksiyon / inflamasyon sırasında leptin düzeyinin artmasının konağın inflamasyona verdiği yanıtta önemli bir faktör olduğunu düşündürmektedir. Enfeksiyonların seyri sırasında görülen anoreksinin konağın akut faz yanıtı olduğuna inanılmaktadır. Bakteri/virüs ürünleri de proinflamatuvar sitokinlerin (IL’ler, tümör nekroz faktörü-alfa-TNF α, interferonlar) yapımını uyarır. Sitokinler de yağ dokusunda leptin ekspresyonunu artırır. Hem mikrobik ürünler, hem de oluşan sitokinler ve leptin gıda alımını azaltır. Bu nedenle, inflamasyon ve enfeksiyon sırasında gelişen anoreksiden özellikle TNF-α, IL-1 ve IL-6’nın sorumlu olduğu ve sitokinlerin bu etkilerinde kısmen leptinin aracılık ettiği düşünülmektedir (30). Leptinin lökosit sentezi üzerine stimüle edici etkisinin yanı sıra, eritropoietinin eritrositler üzerindeki uyarıcı etkisini kuvvetlendirdiği gösterilmiştir. Bakteriyel antijenlere benzer şekilde leptin, makrofajları da aktive eder, makrofajların fagositik aktivitelerini artırır ve makrofajlardan

31

proinflamatuvar ve anti-inflamatuvar sitokinlerin sekresyonunu uyarır. Leptin yara iyileşmesini de hızlandırmaktadır, eksikliği infeksiyona ve inflamasyona yatkınlığı artırmaktadır. Leptin-eksikliği veya leptin-reseptör-eksikliği immün ve inflamatuvar yanıtları değiştirmektedir. Malnütrisyonun immün yetmezliğe ve enfeksiyonun ölümcül olmasına yol açtığı bilinmektedir. Açlık özellikle T-lenfosit yanıtlarını baskılar ve infeksiyona rezistansı azaltır. T lenfositlerin proliferasyonu ve gelişmesi için gerekli olan leptin, T hücre yanıtlarını da düzenler.

Metabolizmadaki önemli rollerinin yanı sıra leptinin meme, prostat ve gastrointestinal kanserlerde mitojen etkisinin olduğu bilinmektedir. Leptinin kanser hücrelerinin çoğalmasını, migrasyonunu, invazyonunu ve anjiyogenezi indüklediği gösterilmiş olup, bu durumun agresif kanser fenotipini tetiklediği düşünülmektedir (64,65). Obezite geni ürünü olan leptinin over kanserindeki muhtemel rolünü araştıran pek çok çalışma mevcuttur ancak moleküler mekanizmaları henüz aydınlatılamamıştır.

Bu çalışmada, leptinin over kanseri hücreleri üzerindeki moleküler mekanizmalarının aydınlatılması amacıyla, leptinin OVCAR-3 ve MDAH-2774 over kanseri hatlarında hücre proliferasyonu ve sitokinler üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Elde edilen veriler incelendiğinde leptinin her iki over kanseri hücre hatlarının proliferasyonunu arttırdığı görülmektedir. Ptak ve arkadaşları, benzer şekilde leptinin OVCAR-3 over kanseri hücrelerinin proliferasyonu üzerine etkilerini doza bağlı olarak incelemişler ve leptinin (2 ng/ml-100 ng/ml) OVCAR-3 hücrelerinin proliferasyonunu arttırdığını göstermişleridir (66). Uddin ve arkadaşları ise leptinin MDAH-2774 hücre hatlarının çoğalmaları üzerindeki etkilerini incelemiş ve bizim çalışmamızdaki sonuçlara paralel olarak leptinin stimüle edici etkileri olduğunu tespit etmişlerdir (67). Literatürdeki diğer in vitro çalışmalarda leptinin BG- 1 over kanseri hücrelerinde proliferasyonu arttırdığı, SKOV-3 ve MDAH-2774 over kanseri hücrelerindeyse apoptozu inhibe ettiği gösterilmiştir (68-70). Choi ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada ise leptinin 1 ve 10 ng/ml dozlarının insan over kanseri hücre hattı olan BG-1 hücrelerinin proliferasyonuna etkisi olmadığı, 100 ve 1000 ng/ml dozların ise proliferasyonu arttırdığı belirlenmiştir (61). Aynı çalışmada araştırmacılar BG-1, OVCAR-3, SKOV-3 ve IOSE-80PC hücre hatlarında leptin reseptörlerinin eksprese edildiğini, buna rağmen tüm hücre hatlarının leptine aynı şekilde cevap vermediğini tespit etmişlerdir. Leptinin SKOV3 ve IOSE-80PC over kanseri hücre hatlarının proliferasyonu üzerinde etkilerinin olmadığı tespit etmişlerdir. Bu durum leptin reseptörlerinin olmasına rağmen leptinin her hücreye aynı şekilde etki etmediğinin göstergesi olarak yorumlanmıştır. Over hücrelerindeki östrojen reseptörlerinin (ER) varlığıyla leptinin etkilerinin araştırıldığı bir çalışmadaysa, ERα reseptör

32

sentezinin fazla olduğu ancak ER β sentezinin olmadığı OVCAR-3 ve A2780 hücre hatlarında leptin uygulamasının bu hücrelerin proliferasyonunu arttırdığı gösterilmiştir. BG-1 hücrelerindeyse ERα reseptör sentezinin siRNA ile susturulması sonucu leptinin proliferasyonu arttırıcı etkisinin baskılandığı gözlenmiştir (61). Bu durum ER-pozitif over kanserlerinde leptinin daha etkin rol aldığını göstermektedir.

Leptin sinyalizasyonunun beslenmeye bağlı olarak değiştiği bilinmektedir. Yetersiz beslenmenin hipoleptinemiye, obeziteninse hiperleptinemiye neden olduğu çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir. Bu sonuçlar kısmen de olsa leptin fonksiyonuna bağlı olarak immun sistem hücrelerinde ters etkilere neden olmaktadır. Örneğin yetersiz beslenen çocuklarda belirli sitokinlerin üretiminde azalmalar saptanmıştır (71-74). Yetersiz beslenmenin tersine obezitede ise inflamasyon cevabında genel olarak artış gözlenir. Son yıllarda yapılan çalışmalar leptinin sadece hücresel fonksiyonları düzenleyen bir molekül değil aynı zamanda proinflamatuar bir molekül olduğunu ve immün hücrelerin farklılaşmasında rol aldığını ortaya koymuştur.

Sitokinler, hemen hemen tüm hücreler tarafından üretilen hücre çoğalmasını stimüle edici, hücre farklılaşmasını düzenleyici, hücre kemotaksisini indükleyen ve diğer sitokinlerin ekspresyonlarını düzenleyen proteinlerdir. Leptin sinyalizasyonun proinflamatuar sitokin sinyalizasyonunu arttırdığı bilinmektedir. Obez bireylerde artan leptin miktarına bağlı olarak TNFα ve IL-6 gibi protein sinyallerinin ve faktörlerinin ekspresyonu ve salgılanmasının arttığı gösterilmiştir. (75-77). Leptinle muamele edilen monositlerde de TNF-α, IL-6, IL-1β, ve restin gibi sitokinlerde artış tespit edilmiştir (78). Uzun süreli leptin muamelesinin artan leptin sinyalizasyonuna bağlı olarak doğal öldürücü hücrelerde (NK) inflamatuar özelliklerin baskılandığı gösterilmiştir (79). Obez bireylerde, NK hücrelerinin TRAIL ligandı ve degranülasyon belirteçi olan CD107a ekspresyonlarında azalış tespit edilmiştir (80). Kilo verme öncesi ve sonrası yetişkin bireylerdeki NK hücrelerinin karşılaştırıldığı bir çalışmada, kilo kaybı sonrası NK hücrelerinin kritik efektör bir sitokin olan IFN-γ’yi daha fazla salgıladıkları gösterilmiştir (81). NK hücreleri ile yapılmış bir in vitro çalışmada ise, insan primer NK hücrelerine ve NK-92 hücrelerine kısa süreli uygulanan leptinin perforin, TRAIL ve IFN-γ ekspresyonlarında ve Nk hücrelerinin sitotoksik etkisinde artışa neden olduğu belirlenmiştir (79,82). Uzun süreli (3-4 gün) leptin uygulanan NK hücrelerinin tümör hücrelerini daha az öldürdüğü ve IFN-γ üretiminin azaldığını tespit eden çalışmalar da mevcuttur (81,82). Obez bireylerde tespit edilmiş konsantrasyon olan 100 ng/ml leptin uygulanan NK hücrelerinde perforin üretimi ve sitotoksik etkide azalış belirlenmiştir (81,82).

Adipoz dokunun metabolik olarak aktif olması, östrojenleri, adipokinleri (leptin gibi) ve sitokinleri salgılaması nedeniyle obezite ile kanser arasında sıkı bir bağlantı kurulmuştur

33

(83). Dolayısıyla leptinin kanser hücrelerindeki sitokinler üzerindeki etkilerini araştıran çalışmalar bulunmaktadır. Aleman ve arkadaşları küçük hücreli dışı akciğer kanseri hastalarında leptin serum düzeylerini incelemişler ve sağlıklı bireylerden daha az olduğunu belirlemişlerdir. Bunun yanında CRP, ferritin, TNF-a, IL-6 gibi sitokin seviyelerinin leptin seviyesiyle ters orantılı olduğunu tespit etmişlerdir (84). Benzer sonuçlar başka araştırma grupları tarafından da akciğer kanseri hastalarında belirlenmiştir (85,86). Polikistik over sendromlu obez kadınlarla yapılan bir çalışmada yüksek bulunan leptin seviyelerinin luteinize granuloza hücrelerinde leptin reseptörü ekspresyonunu arttırdığı belirlenmiştir. Bu etki endojen hormon üretimini değiştirmekte ve over epitelinin dengesiz hormonal ve inflamator bir mikroçevreye maruz bırakmaktadır. Bu da malign transformasyonu tetikleyici bir durum olarak kabul görmektedir (87,88). Literatürde primer over tümörlerindeki yüksek leptin veya leptin reseptörü seviyelerinin over kanserinin kötü gidişatıyla ilişkisi olduğunu gösteren çalışmalar mevcuttur (89,90). Leptinin over kanseri hücrelerindeki sitokinler üzerindeki etkileri henüz araştırılmamıştır.

Bu tez çalışmasında leptinin over kanseri hücrelerindeki moleküler etki mekanizmalarının aydınlatılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, leptin uygulanan OVCAR-3 ve MDAH-2774 over kanseri hücrelerinden salgılanan sitokinlerdeki değişimler araştırılmıştır. Leptin uygulamasıyla OVCAR-3 ve MDAH-2774 hücrelerinden salgılanan sitokinlerde anlamlı değişimler tespit edilmiştir. Kato ve arkadaşları yüksek leptin seviyelerinin kanser hücrelerinden çeşitli sitokinlerin salınımını arttırdığını göstermişlerdir. Kanser hastalarının asit sıvılarında pek çok sitokin belirlenmiş ve bu sitokinlerin obez hastalarda daha yüksek olduğu bilinmektedir (91).

Bu sitokinlerden interlökin (IL) ailesinin hücre çoğalması, farklilaşması, migrasyonu ve adezyonu gibi kompleks immunomodülatör fonksiyonları mevcuttur. IL-1’in tümör büyümesini arttırdığı ve obezite gibi hücre metabolizmasının değiştiği durumlarda salgılandığı bilinmektedir (92). IL-1 ayrıca proanjiyojenik bir faktör olup VEGF ekspresyonunu arttırır. Leptinin IL-1’in salgılanmasını düzenlediği tespit edilmişitir. Bazı çalışmalar IL-1 reseptörünün bloklanmasıyla leptin bağımlı VEGF artışının da azaldığını göstermiştir. IL-1 artışının leptin aracılı aktive olan JAK2/STAT, PKC, p38, MAPK/ERK1/2, PI-3K/AKT1 sinyal yollarıyla bağlantılı olduğu belirlenmiştir. Bu nedenlerle IL-1 ile leptin arasındaki ilişki tümör büyümesi ve anjiyogenezi için kritik önem taşır (93). Çalışmamızda leptinle muamele edilen OVCAR-3 hücrelerinde IL-1 seviyesinde artış tespit edilmiştir. IL-2 ise temel tümör defans efektörleri olan T ve NK lenfositlerinin farklılaşması için gerekli mitojenik sinyallerin düzenlenmesinde rol alan anahtar bir moleküldür. Bu nedenle kanser

34

tedavisinde hedef molekül olarak ilgi görmüş ve metastatik renal karsinomlarla metastatik melanom tedavilerinde onay almıştır (94). Leptin uygulamasıyla her iki over kanseri hücre hattında IL-2 seviyelerinde azalış tespit edilmiştir. Ayrıca, leptin uygulaması ile her iki over kanseri hücre hattında da IL-3 ve IL-10 ekspresyonları artmıştır. IL-3 endotel hücrelerin yaşamını ve çoğalmasını destekleyici olarak tümor mikroçevresine salınır. Endotel farklılaşma faktörü olarak ta rol alan IL-3 ‘ün tümör damarlanmasında önemli rol aldığı bilinmektedir (95). IL-10 ise immunbaskılayıcı bir sitokin olarak bilinir. IL-10 ve tümör büyümesi arasında korelasyon tespit edilmiş olup, kanserli hastalarda hastalığın kötü gidişatı ile ilişkilendirilmiştir (96) Matte ve arkadaşları, over kanseri asit sıvısında tespit edilen yüksek seviyedeki IL-10 seviyesinin hastaların yaşam süresini azalttığını belirlemişlerdir (97). Kemokinler inflamasyonda ve tümör gelişiminde rol alan moleküllerdir. Bunlardan MCP-2/CCL8 ve MCP-3/CCL7 her iki over kanseri hücre hattında da leptin uygulaması sonucunda azalmıştır. MCP-2/CCL8, CCR1, CCR2, CCR3 ve CCR5 gibi çeşitli reseptörlere bağlanabildiğinden lökositler, NK hücreleri, monositler, bazofiller gibi pek çok hücreyle iletişime geçebilen pluripotent bir kemokindir. MCP-3/CCL7’nin ise T lenfositlerini ve NK hücrelerinin aktivasyonunu sağlayarak tümör oluşumunu baskıladığı bilinmektedir (98). MIG/CXCL9, over kanseri hastalarında önemli bir hedef olarak kabul edilen IL-12’yi baskılayarak anti-tümör cevap oluşturan bir moleküldür (99).

Interferon (IFN) ve reseptörünün etkileşimiyle JAK ailesi kinazları aktive olarak STAT moleküllerini fosforiller ve transkripsiyonun düzenlenmesi sağlanır. Leptinin IFN ile birlikte çalışarak inflamatuvar cevaba yardım ettiği, IFN ekspresyonunu arttırdığı belirlenmiştir. IFN-γ’nın tümör anjiyogenezini inhibe ettiği ve tümör tanınmasında rol alan MHC ekspresyonunu arttırdığı bilinmektedir (100). Leptin uygulamasıyla MDAH 2774 over kanseri hücre hattında bu antianjiyojenik özellikteki molekülde azalış tespit edilmiştir.

MDAH 2774 hücre hattında leptin uygulaması sonrası artış gösteren diğer bir molekül de TGF-β’dır. TGF-β, tümör oluşumunda dual role sahip bir moleküldür. Tümör oluşumunun erken safhalarında epitelyum, endotel ve hematopoetik hücrelerde homeostazı sağlayarak hücre döngüsü ve apoptoz olaylarında tümör baskılayıcı olarak görev yapar. Tümör gelişimi sırasındaysa, bu sinyal yolağında meydana gelen mutasyonlardan ötürü tümör oluşumunu ve metastazı tetikleyici nitelikte çalışır. TGF-β leptinin adipoz ve tümör hücrelerinden salınımını modüle ettiğinden leptinle inflamatuar cevap arasında köprü oluşturan inflamatuar bir sitokindir (93).

Leptin uygulamasıyla her iki hücre hattında da artış gösteren moleküllerden insülin benzeri çoğalma faktörü bağlanma proteinleri (IGFBP) IGFBP-1, IGFBP-2 ve IGFBP-3,

35

IGF’lere bağlanarak hücresel IGF’lerin taşıyıcılığını üstlenirler. IGF’lerin vücutta insülin hormonu gibi görev yaptığı bilinmektedir. IGFBP’ler pek çok hücre tarafından üretildiği gibi pek çok doku sıvısında da tespit edilmişlerdir. IGFBP-1 ve IGFBP-2’nin IGF’nin reseptörlerine bağlanarak aktive olmasını engelleyen proteinlerdir. IGFBP-3 serumda en fazla bulunan protein olup IGF’nin antiapoptotik etkilerini baskılar ve mitojenik aktivitelerini düzenler. IGFBP-3’ün serumda yüksek düzeyde bulunması over kanseri dahil olmak üzere pek çok kanser tipi için yüksek risk anlamı taşımaktadır.

36

SONUÇ

Obezitenin çeşitli kanser tiplerinin gelişimiyle sıkı bağlantılı bir hastalıktır. Epidemiyolojik ve deneysel çalışmalar beslenme ve kanser arasındaki ilişkiyi ortaya koymaktadır. Obezitenin, kanser riskini hangi biyolojik mekanizmalarla ve nasıl etkilediğine dair yapılan çalışmalar; farklı kanser türleri için farklı mekanizmaların söz konusu olabileceğini göstermektedir. Henüz, her bir kanser türü için, bu kanserlere neden olan ana mekanizmalar kesin olarak açıklanabilmiş değildir.

Bu çalışma, leptinin over kanseri hücre hatları üzerindeki etki mekanizmalarına ışık tutabilmek amacıyla gerçekleştirilmiştir. Literatürde ilk kez olmak üzere, leptinin over kanseri hücrelerindeki sitokinlerin seviyeleri üzerindeki etkileri ortaya koyulmuştur. Epidemiyolojik çalışmaların gösterdiği kanser ve obezite arasındaki ilişkilerin biyolojik mekanizmalarının daha net olarak ortaya çıkarılması ve araştırılması gerekmektedir.

37

KAYNAKLAR

1. Parker LP, Taylor DD, Kesterson S, Taylor CG. Gene Expression Profiling in Response to Estradiol and Genistein in Ovarian Cancer Cells. Cancer Genomics & Proteomics 2009;6: 189-194.

2. Longuespée R, Boyon C, Desmons A, Vinatier D, Leblanc E, Farré I, Wisztorski M, Ly K, D’Anjou F, Day R, Fournier I, Salzet M. Ovarian cancer molecular pathology. Cancer and Metastasis Reviews 2012;31(3-4):713-732.

3. Romero I and Bast RC. Minireview: Human Ovarian Cancer: Biology, Current Management, and Paths to Personalizing Therapy. Endocrinology 2012;153(4):1593– 1602.

4. Gurung A, Hung T, Morin J, Gilks C B. Molecular abnormalities in ovarian carcinoma: clinical, morphological and therapeutic correlates. Histopathology 2013;62:59-70.

5. Gao X, Lıu Y, Deeb D, Lıu P, Lıu A, Arbab A S, Gautam S C. ROS Mediate Proapoptotic and Antisurvival Activity of Oleanane Triterpenoid CDDO-Me in Ovarian Cancer Cells. Anticancer Research 2013;33(1): 215–221.

6. Rebecca L. Siegel, MPH1; Kimberly D. Miller, MPH2; Ahmedin Jemal, DVM, PhD3. Cancer Statistics, 2016. CA CANCER J CLIN 2016;66:7–30.

7. Kramer, J.L., Greene, M.H., Epidemiology of Ovarian Fallapian Tube, and Primary Peritoneal Cancers, ‘Gynecologic Cancer Contro-versies in Management (Ed. D.M. Gershenson, W.P. McGuire, M. Gore, M.A. Guim, G. Thomas)’da, USA, 2004;327- 337.

8. Whittemore, A.S. The risk of ovarian cancer after treatment of infertility. N. Engl. J. Med. 1994;331:805.

9. Gross, T.P., Schlesselman, J.J. The estimated effect of oral contraseptive use on the cumulative risk of epithelial ovarian cancer. Obstet. Gynecol. 1994;83:419.

10. Leitzmann MF, Koebnick C. Body mass index and risk of ovarian cancer. Cancer 2009;115:812-822.

11. Schouten LJ, Rivera C. Height, body mass index, and ovarian cancer: a pooled analysis of 12 cohort studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2008;17:902-912. 12. Olsen CM, Green AC. Obesity and the risk of epithelial ovarian cancer: a systematic

38

13. Pavelka JC, Brown RS. Effect of obesity on survival in epithelial ovarian cancer. Cancer 2006;107:1520-1524.

14. Goff BA, Mandel LS, Melancon CH, Muntz HG. Frequency of Symptoms of Ovarian Cancer in Women Presenting to Primary Care Clinics. JAMA 2004;291(22):2705- 2712.

15. Dina, R., Rustin, G., Soutter, W. P. Carcinoma of the ovaries and fallopian tubes’, in Shaw, Soutter WP, Stanton SL (eds) Gynaecology, London: Churchill Livingstone, 2002.

16. Smolle E, Taucher V, Pichler M, Petru E, Lax S, Haybaeck J. Targeting Signaling Pathways in Epithelial Ovarian Cancer. International Journal of Molecular Sciences 2013;14:9536-9555.

17. Yaginuma Y and Westphal H. Abnormal Structure and Expression of the p53 Gene in Human Ovarian Carcinoma Cell Lines. Cancer Research 1992;52:4196-4199.

18. Press JZ, De Luca A, Boyd Net al. Ovarian carcinomas with genetic and epigenetic brca1 loss have distinct molecular abnormalities. BMC Cancer 2008;8:17.

19. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature 2011;474(7353):609-615.

20. Wiegand KC, Shah SP, Al-Agha OM et al. Arid1a mutations in endometriosis- associated ovarian carcinomas. The New England Journal of Medicine 2010;363:1532-1543.

21. Kuo KT, Mao TL, Jones Set al. Frequent activating mutations of pik3ca in ovarian clear cell carcinoma. American Journal of Pathology 2009;174:1597-1601.

22. Lönnqvist F, Arner P, Nordfors L, Schalling M. "Overexpression of the obese (ob) gene in adipose tissue of human obese subjects". Nat. Med. 1995;1(9):950–3.

23. Madej T. "Considerations in the use of lipid-based drug products". J Intraven Nurs. 1998;21(6): 326.

24. Sinha MK, Ohannesian JP, Heiman ML, Kriauciunas A, Stephens TW, Magosin S, Marco C, Caro JF. "Nocturnal rise of leptin in lean, obese, and non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects". J. Clin. Invest. 1996;97(5):1344–7.

25. Schoeller DA, Cella LK, Sinha MK, Caro JF. "Entrainment of the diurnal rhythm of plasma leptin to meal timing". J. Clin. Invest. 1997;100(7):1882–7.

26. Chan JL, Heist K, DePaoli AM, Veldhuis JD, Mantzoros CS. "The role of falling leptin levels in the neuroendocrine and metabolic adaptation to short-term starvation in healthy men". J. Clin. Invest. 2003;111(9):1409–1421.

39

27. Kolaczynski JW, Considine RV, Ohannesian J, Marco C, Opentanova I, Nyce MR, Myint M, Caro JF. "Responses of leptin to short-term fasting and refeeding in humans: a link with ketogenesis but not ketones themselves". Diabetes. 1996;45(11):1511–5. 28. Kolaczynski JW, Ohannesian JP, Considine RV, Marco CC, Caro JF. "Response of

leptin to short-term and prolonged overfeeding in humans". J. Clin. Endocrinol. Metab. 1996;81(11):4162–5.

29. Ahima RS, Prabakaran D, Mantzoros C, Qu D, Lowell B, Maratos-Flier E, Flier JS. "Role of leptin in the neuroendocrine response to fasting". Nature 1996;382(6588):250–2.

30. Friedman JM. "Leptin at 14 y of age: an ongoing story". Am. J. Clin. Nutr. 2009;89(3):973–979.

31. Margetic S, Gazzola C, Pegg GG, Hill RA. "Leptin: a review of its peripheral actions and interactions". Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 2002;26(11):1407–1433.

32. Anifandis G, Koutselini E, Louridas K, Liakopoulos V, Leivaditis K, Mantzavinos T, Sioutopoulou D, Vamvakopoulos N. "Estradiol and leptin as conditional prognostic IVF markers". Reproduction. 2005;129(4):531–534.

33. Comninos AN, Jayasena CN, Dhillo WS. "The relationship between gut and adipose hormones, and reproduction". Hum. Reprod. Update. 2014;20(2):153–74.

34. Zhao J, Townsend KL, Schulz LC, Kunz TH, Li C, Widmaier EP. "Leptin receptor expression increases in placenta, but not hypothalamus, during gestation in Mus