T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TOKAT YEŞİLIRMAK NEHRİ SUYUNUN MUTAJENİTESİNİN
ARAŞTIRILMASI Ayşe ÇETİNER Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Yrd. Doç. Dr. Canan USTA
2012
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
TOKAT YEŞİLIRMAK NEHRİ
SUYUNUN MUTAJENİTESİNİN
ARAŞTIRILMASI
Ayşe ÇETİNER
TOKAT 2012
TEZ BEYANI
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
i ÖZET Yüksek Lisans Tezi TOKAT YEŞİLIRMAK NEHRİ SUYUNUN MUTAJENİTESİNİN
ARAŞTIRILMASI Ayşe ÇETİNER Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Yrd. Doç. Dr. Canan USTA
Bu çalışmada, Temmuz 2010- Kasım 2010 tarihleri arasında Yeşilırmak’ tan toplanan su örneklerinin mutajenik etkisi kısa zamanlı bakteriyel mutajenite test sistemlerinden biri olan Ames test sistemi ile araştırılmıştır. Bunun için Yeşilırmak üzerinde belirlenen beş farklı istasyondan su örnekleri alınmıştır. Su örnekleme istasyonları Behzat deresi girişi, Behzat deresinin Yeşilırmak’a karıştığı nokta, Gümenek, Dimes Fabrikası çıkışı ve atık çöp yığın merkezi sonrası olmak üzere toplam beş deneme istasyonu olarak planlanmıştır. Ames testinde, Salmonella typhimurium’ un TA 98 ve TA 100 suşları kullanıldı ve deneyler metabolik aktivasyon (S9) yokluğunda gerçekleştirildi. Elde edilen sonuçlar kontrol grupları ile beraber SPSS 19.0 (Statistical Package for Social Sciences) paket programında analiz edilmiştir. Analiz kapsamında, betimleyici istatistikler yapılmış ve bağımsız örneklem t testi, tek yönlü varyans analizi (ANOVA), Tukey testi ve Friedman testi kullanılmıştır. Analiz sonuçlarına göre kirliliğin fazla olduğu bazı istasyonlarda (Dimes fabrikası çıkışı ve atık çöp yığın merkezi sonrası) mutajenite belirlenmiştir.
2012, 57 sayfa
ii ABSTRACT M. Sc. Thesis MUTAGENICITY ASSESMENT OF THE WATER OF YEŞİLIRMAK IN TOKAT Ayşe ÇETİNER Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Deparment of Biology
Supervisor: Asst. Prof. Dr. N. Canan USTA
In this study, the mutagenic effect of water samples collected from the Yeşilırmak between July and November 2010 has been investigated by using short-term bacterial mutagenicity test system namely Ames. Therefore, water samples were taken from identified five different stations on the Yeşilırmak. Water sampling stations was planned including entrance of Behzat creek, the joins point of the Behzat creek with Yeşilırmak, Gümenek, the output of Dimes Factory and after the center of the garbage heap as five experimental station. In the Ames test TA 98 and TA 100 strains of
Salmonella typhimurium were used and experiments carried out in the absence of
metabolic activation (S9). The results with control groups were analyzed with SPSS 19.0 (Statistical Package for Social Sciences) programme. The scope of the analysis was descriptive statistics and used independent samples t-test, one way analysis of variance (ANOVA), Tukey test and Fridman test. According to the results of the analysis mutagenicity was determined at some stations with high pollution (the output of Dimes Factory and after the center of the garbage heap).
2012, 57 pages
iii ÖNSÖZ
Çalışmalarım sırasında bana yol gösteren ve yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Yrd. Doç. Dr. Canan USTA’ ya teşekkür ederim. Çalışmalarımda kullandığım bakteri suşlarını temin etmemde bana yardımcı olan Prof. Dr. Nuran DİRİL’ e teşekkür ederim. Ayrıca bu tezi hazırlarken her türlü desteğini ve yardımını esirgemeyen eşime ve hayatımın her aşamasında bana destek olan, varlıklarıyla bana güç veren aileme teşekkürü bir borç bilirim.
Ayşe ÇETİNER Mayıs/ 2012
iv İÇİNDEKİLER DİZİNİ Sayfa ÖZET ……….…….………...……i ABSTRACT …………...……….………....ii ÖNSÖZ………...………...…..………… iii İÇİNDEKİLER DİZİNİ ………...iv
SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ………...…….………...…vii
ŞEKİLLER DİZİNİ………..………...………..…………..……...…. ix ÇİZELGELER DİZİNİ………...………...……..…. x 1. GİRİŞ ………...………...… 1 2. KURAMSAL TEMELLER………….……….……...……...4 2.1. Mutasyonlar………4 2.2. Kromozom mutasyonları………4
2.2.1. Sayısal kromozom mutasyonları……….5
2.2.1.1. Anöploidi……….…….5
2.2.1.2. Euploidi………...……….5
2.2.2. Yapısal kromozom mutasyonları ………6
2.2.2.1. Delesyon ………..6
2.2.2.2. Duplikasyon………..6
2.2.2.3. İnversiyon………...…..7
2.2.2.4. Translokasyon………..…….7
2.3. Gen mutasyonları………...……….8
2.3.1. Gen Mutasyonlarının Kategorileri ………..………8
2.3.1.1. Spontan ve Uyarılmış Mutasyonlar………..………8
2.3.1.2. Somatik ve Gametik Mutasyonlar………9
2.3.1.3. Morfolojik mutasyonlar………...…9
2.3.1.4. Biyokimyasal mutasyonlar……….10
2.3.1.5. Letal mutasyonlar………...……10
2.3.1.6. Koşullu mutasyonlar………..……….11
2.3.2. Gen Mutasyonlarının Çeşitleri………...………12
v
2.3.2.2. Sessiz, yanlış anlamlı ve anlamsız mutasyonlar……….………12
2.3.2.3. Çerçeve kayması mutasyonları………...………13
2.3.3. Gen Mutasyonlarının Sebepleri……….…………14
2.3.3.1. DNA Replikasyonu Hataları………...…………14
2.3.3.2. Kimyasal mutajenler………..………….15 Baz Analogları……….15 Alkilleyici ajanlar………16 İnterkalasyon ajanlar………16 Diğer ajanlar………17 2.3.3.3. Fiziksel mutajenler……….17 UV radyasyonu………17
X-Işınları, Gamma Işınları ve Kozmik Işınlar……….18
2.4. Mutajenlerin saptanması için geliştirilmiş kısa zamanlı test sistemleri ve Ames testi……….………...………18
2.4.1. Ames / Salmonella / Mikrozom test yöntemi………21
2.5. Salmonella typhimurim’un genetik özellikleri………..………...23
2.5.1. Histidin (his) mutasyonu………..……….23
His G 46 mutasyonu………23 His D 3052 mutasyonu………23 His D 6610 mutasyonu………24 His G 428 mutasyonu………..………24 2.5.2. Rfa Mutasyonu………..………24 2.5.3. uvrB Mutasyonu………..………..25 2.5.4. R-faktörü……….………..……….25 3. MATERYAL VE YÖNTEM………..………..28 3.1. Kimyasal Maddeler ……….……….28
3.2. Salmonella tpyhimurium test suşları………...………..28
3.3. Deneyde Kullanılan Ortamların İçerikleri ve Hazırlanmaları……….……….28
3.3.1. Vogel-Bonner- E Tuz Çözeltisi (50x VB)………...…………..28
3.3.2. (0.5 mM) Histidin/Biyotin (HB) Solüsyonu……….….29
3.3.3. (% 0.8/0.02 NaOH) Ampisilin Solüsyonu………...………..29
3.3.4. 0,02N NaOH Hazırlanışı………...………29
vi
3.3.6. (% 0.5) Histidin Çözeltisi………..30
3.3.7. (%20) Glikoz Çözeltisi………..………30
3.3.8. Minimal Glikoz Agar Plakları (MGA)……….……….31
3.3.9. Histidin/Biyotin Plakları (HB agar)……….………..31
3.3.10. Histidin/Biyotin/Ampisilin Plakları (HBA agar) ………32
3.3.11. Top Agar ……….32
3.3.12. Nutrient Agar (NA) Plakları………...……….33
3.3.13. Nutrient Broth (NB) Sıvı Kültür Ortamı……….33
3.3.14. (2 g/l) 4- Nitro-o-Fenilendiamin……….33
3.3.15. ( 0.1 g/l) Sodyum Azid Çözeltisi………..………..34
3.3.16. (%0,1) Kristal Viyole Solüsyonu……….……34
3.4. Örneklerin toplanması ve saklanması………..……….34
3.5. Metod………..………..35
3.5.1. Salmonella suşlarının kültürlerinin ve master plaklarının hazırlanması……..….35
3.5.2. Salmonella suşlarının stoklanması ve stok kültürlerin açılması …………..…….35
3.5.3. Bakterilerin genotiplerinin kontrol edilmesi……….………….36
3.5.3.1. Histidin gereksinimi kontrolü………...………..36
3.5.3.2. uvrB mutasyonu kontrolü……….………..37
3.5.3.3. Rfa mutasyonu kontrolü……….38
3.5.3.4. R-faktör varlığı kontrolü……….38
3.5.3.5. Spontan olarak geriye dönüş sıklığının kontrolü………39
3.6. Ames mutajenite testinin yapılışı.………..……..40
3.6.1. S9’ suz (-) deney ………..……….40
3.6.2. Sonuçların değerlendirilmesi……….……41
4. BULGULAR………...……42
4. 1. Betimleyici İstatistikler………..………..44
4. 2. İstasyonlara İlişkin Karşılaştırmalar………..………..47
4. 3. Farklı zamanlarda alınan su örneklerinin karşılaştırılması………..50
4. 4. Deney grubunun kontrol grubu ile karşılaştırılması………..………..50
5. TARTIŞMA VE SONUÇ………..………52
KAYNAKLAR………...………55
vii SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama C Santigrad derece cm Santimetre g Gram km Kilometre km2 Kilometrekare l Litre M Molar μm Mikrometre μg Mikrogram μl Mikrolitre mg Miligram mm Milimetre mM Milimolar ml Mililitre m Milimikron N Normal nm Nanometre s saniye Kısaltmalar Açıklama A Adenin 2-AP 2 Aminopürin 5-Bu 5 Bromourasil C Sitozin DMSO Dimetilsülfoksit DNA Deoksiribonükleik asit
viii EMS Etilmetansülfonat G Guanin
His Histidin
his- Hisitidin sentezleyemeyen his+ Histidin sentezleyebilen HB Histidin Biyotin
HBA Histidin Biyotin Ampisilin LPS Lipopolisakkarit
MGA Minimal Glikoz Agar m RNA mesajcı Ribonükleik asit NA Nutirent Agar
NB Nutrient Broth
S9 Metabolik aktivasyon sağlayan rat karaciğeri mikrozomal enzimleri
SPSS Statistical Package for Social Sciences T Timin
ix
ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa
Şekil 1.1. Yeşilırmak nehri havzası………..….3 Şekil 2.1. Ames testinin uygulanması ve mutajeniteyi gösteren koloniler……….…….22 Şekil 3.1. S. typhimurium TA 98 histidin gereksinimi kontrolü sonuçları……….36 Şekil 3.2. S. typhimurium TA 100 histidin gereksinimi kontrolü sonuçları………37 Şekil 3.3. S. typhimurium TA 98 ve TA 100 suşlarının uvrB mutasyonu
kontrolü sonuçları………...…….37 Şekil 3.4. S. typhimurium TA 98 ve TA 100 suşlarının rfa mutasyonu
kontrolü sonuçları………..………..38 Şekil 3.5. S. typhimurium TA 98 ve TA 100 suşlarının R-faktör mutasyonu
kontrolü sonuçları………...…….39 Şekil 3.6. S. typhimurium TA 98 ve TA 100 suşlarının spontan olarak
x
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa Çizelge 2.1. Mutajenlerin saptanması için geliştirilmiş kısa zamanlı test sistemleri ve bunların dayandığı genetiksel ve biyokimyasal yollar…………..…....20
Çizelge 2.2. Yaygın olarak kullanılan Salmonella test suşlarının genotipik özellikleri ……….………..……….26
Çizelge 2.3. Salmonella test suşlarının DNA dizi özgüllükleri………..…….27 Çizelge 4.1. Salmonella typhimurium TA 98 ve TA 100 suşlarının aylara göre
geriye dönüş sayıları………43 Çizelge 4.2. Salmonella typhimurium TA 98 ve TA 100 suşları ile istasyonlardan alınan su örneklerinin plak inkorporasyon testi betimleyici istatistikleri....45 Çizelge 4.3. Beş farklı istasyondan alınan su örneklerinin Ames testi
sonuçlarının karşılaştırılması……….…………..47 Çizelge 4.4. Beş farklı istasyondan alınan su örneklerinin Ames testi sonuçlarının farklılığının hangi istasyonlar arasında olduğuna dair yapılan
karşılaştırma ………...……….………48 Çizelge 4.5. Farklı zamanlarda alınan su örneklerinin Ames testi sonuçlarının
karşılaştırılması ………..……….50 Çizelge 4.6. Salmonella typhimurium TA 98 ve TA 100 suşları ile yapılan Ames
1. GİRİŞ
Son yıllarda giderek artan nüfus ve buna bağlı olarak ortaya çıkan çevre kirliliği, yaşayan bütün canlıları olumsuz yönde etkilemekte ve canlıların sağlıklarını her yönden tehdit etmektedir. Sanayileşme, kullanılan çeşitli ilaçlar, gıdalara katılan tatlandırıcı ve renklendiriciler, tarımda bitkileri zararlılardan korumak için kullanılan çeşitli kimyasallar çevre kirliliğine büyük ölçüde sebep olan etmenlerdir (Akyıl, 2006).
Tüm bu konular ile ilişkili olan temiz kullanılabilir su ise dünya nüfusunu ve yaşam kalitesini doğrudan etkilemektedir. Endüstriyel teknolojinin gelişmesine paralel olarak su, hava ve toprağın sağlığa zararlı maddelerle kirlenmesi insanoğlunun karşısındaki en önemli toksikolojik sorunlardan biridir. Günümüzde teknik olarak kullanılabilir durumda olan tatlı su kaynaklarının oldukça sınırlı olduğu bilinmektedir. Diğer taraftan tarım alanlarının bilinçsizce kullanılması da sorunu arttırmaktadır (Mumcu, 2005). Sonuçta bu kirlenmeler tüm canlıların günlük yaşamlarında doğrudan ya da dolaylı olarak canlılara zarar vermekte ve çevre kirliliği toplumlarda önemli bir sorun haline gelmektedir. Canlıların olumsuz yönlerde etkilenmesine neden olan sorunların başında doğal ya da sentetik kimyasal maddeler gelmektedir (Akyıl, 2006).
Kimyasal maddelerin pek çoğu canlıların DNA (Deoksiribonükleik asit)’ sıyla etkileşerek DNA’ ya zarar verebilmekte, mutasyona ve dolayısıyla kansere yol açabilmektedir.
Çevremizde bulunan ve biyolojik etkileri henüz bilinmeyen milyonlarca sentetik ve doğal maddenin, karsinojenik potansiyel açısından test edilmesi sağlık açısından gereklidir. Kimyasal maddelerin karsinojenik etkilerini ortaya çıkarmak için en akılcı yaklaşım laboratuar hayvanlarında tümör indüksiyonudur. Ancak laboratuar hayvanları ile yapılan karsinojenite deneyleri hem çok pahalı hem de çok zaman almaktadır. Bu nedenle, canlı hayvan deneyleri yerine kimyasal maddelerin kanserojenik
2
potansiyellerini ölçebilmek için son yıllarda birçok in vitro bakteriyel test sistemi geliştirilmiştir. Bakteriyel testler bakterilerin basit üreme ortamlarında hızlı üreyebilmeleri, çabuk ve kolay uygulanabilir olmaları nedeni ile tercih edilmektedir. Kısa zaman içinde sonuçlanan bu testlerle, kimyasal maddelerin belirli genetik özelliklerde oluşturduğu sonuçlara yol açıp açmadıkları ölçülmekte ve elde edilen sonuçlarla maddelerin karsinojenik potansiyelleri arasında ilişkiler kurulmaktadır (Anonim, 1985).
Karsinojenlerin taranmasında mutajenitenin esas alınmasının sebebi genetik kodun, genetik sistemin evrensel oluşu ve mutajenite ile karsinojenite arasındaki korelâsyonun yüksek oluşudur (Anonim, 1985).
Kısa zamanlı testlerden olan Salmonella testi, etkinliği, ucuz olması ve hızlı uygulanabilirliği nedeniyle yaygın olarak kullanılan ve iyi şekilde karakterize edilmiş bir testtir (Anonim, 1985).
Dr. Bruce Ames tarafından geliştirilmiş ve Ames testi olarak da adlandırılan
Salmonella/mikrozom test sistemi, kimyasal maddelerin mutajenik etkilerinin
araştırılmasında en yaygın olarak kullanılan, mutajen-karsinojen etkisi en iyi bilinen ve geçerliliği en fazla kabul edilmiş kısa zamanlı bakteriyel test sistemlerinden birisidir (Maron ve Ames 1983).
Yapılan bir çalışmada Ekim 1995- Aralık 1995 tarihleri arasında İzmir körfezine drene olan dere ve kanalizasyon ağızlarından ve İzmir Körfezi’ nin iç, orta ve dış kısımlarından seçilen istasyonlardan alınan sediment örneklerinde S. typhimurium TA98 ve TA100 suşları ile mutajenite tesi uygulanmıştır. Test sonucuna göre körfezin iç kısmına drene olan dere ve kanalizasyonların, taşıdıkları kirlilik yükü sebebi ile körfez için mutajenik aktivite kaynağı teşkil ettiği belirlenmiştir (Boyacıoğlu, 1999).
Yapılan başka bir çalışmada, Seydi Çayı (Eskişehir) çevresinden toplanan su ve toprak örneklerinde bulunan bor miktarının mutajenik etkisi Salmonella typhimurium TA 98 ve TA 100 suşları ile Ames / Salmonella / Mikrozom test yöntemi kullanılarak hem
3
metabolik enzimlerin kullanıldığı S9'lu ortamda hem de S9'suz ortamda araştırılmıştır. Bor düzeyinin yüksek olduğu istasyonlarda bazı dozlar için toksisite ve mutajenite belirlenmiştir (Mumcu, 2005).
Yeşilırmak nehri, Türkiye’nin en önemli akarsularından biri olup Türkiye’nin kuzey doğusunda yer alır (Şekil 1). Yeşilırmak nehri 519 km uzunluğunda olup drenaj havzası 38.000 km2’ lik bir alanı kaplamaktadır (Kazancı ve ark., 2010).
Şekil 1.1. Yeşilırmak nehri havzası (Kazancı ve ark., 2010)
Yeşilırmak nehri havzasında önemli kirlilik kaynakları endüstriyel kuruluşlardan kaynaklanan atık sular, yerleşim alanlarından gelen evsel atık sular ve tarım alanlarından süzülen sulardır (Kazancı ve ark., 2010).
Bu çalışmanın amacını, son yıllarda oldukça fazla kirlenen Yeşilırmak suyunun kısa zamanlı bakteriyel test sistemlerinden olan Ames testi ile mutajenik etkisinin araştırılması oluşturmaktadır.
2. KURAMSAL TEMELLER
2.1. Mutasyonlar
Genetik kodun (şifrenin) yer aldığı DNA‟ da kendiliğinden veya çeşitli etkenlere bağlı olarak meydana gelen kalıtsal değişikliklere mutasyon denir. Mutasyonu taşıyan hücreye ya da bireye mutant, mutasyona neden olan faktörlere de mutajen adı verilmektedir (Yıldırım ve ark., 2007).
Mutasyon terimi ilk kez 1901 yılında, Hugo De Vries tarafından Oenothera
lamarckiana ile yaptığı çaprazlamalarda gözlemlediği varyasyonu tanımlamak için
kullanılmıştır (Klug ve Cummings, 2003).
Mutasyonlar ayrıca genetik biliminin de temelini oluşturur. Bir genin varlığı, gen ancak bir mutasyonla değiştiği ve bu durum fenotipe yansıdığı takdirde fark edilebilmektedir. Bu yüzden mutasyonlarla yapılan araştırmalar aslında genler üzerinde daha detaylı bilgiler elde edilmesini ve genetik mekanizmaların işleyişlerinin daha iyi anlaşılmasını sağlamıştır (Yıldırım ve ark., 2007).
Bir sınıflama kolaylığı sağlamak üzere mutasyonlar kromozomların sayı veya yapılarındaki değişiklikler ile sitolojik olarak kromozom düzeyinde gözlenemeyen, ancak bireyin fenotipindeki farklılıkla saptanabilen gen mutasyonları olarak gruplandırılabilirler (Oraler, 1990).
2.2. Kromozom mutasyonları
Kromozom mutasyonları, sayısal kromozom mutasyonları (tüm takımı ya da bir-birkaç kromozomu ilgilendirir) ya da yapısal kromozom mutasyonları (kromozom yapısındaki bazı değişiklikler) başlıkları altında incelenir (Bozcuk, 2005).
5
2.2.1. Sayısal kromozom mutasyonları
2.2.1.1. Anöploidi
Kromozomlardan birinin veya bir kaçının sayıca değişmesine denir (Demirsoy, 2003). Bu da bir kromozomun eksilmesi ya da bir veya daha fazla sayıda eklenmesi şeklinde olabilir. Buna göre şu tipleri ayırt edilir (Sağlam, 2000).
Monosomi, diploit bir bireyde tek bir kromozomun eksilmesidir. 2n-1 ile gösterilir (Demirsoy, 2003).
Nullisomi, bir canlıda bir kromozomun homoloğu ile birlikte yitirilmesidir. 2n-2 ile gösterilir (Demirsoy, 2003).
Polisomi, bir veya birkaç kromozomun sayıca fazlalaşmasıdır. Değişik şekilleri vardır. Trisomi, diploit bir bireyde bir kromozomun fazla bulunmasıdır. 2n+1 ile gösterilir. İnsanda 21. kromozomun triploit olmasıyla mongoloit dediğimiz gerizekalılık ortaya çıkar. Tetrasomi ise diploit bir bireyde bir kromozomun iki misli fazla bulunmasıdır. 2n+2 ile gösterilir (Demirsoy, 2003).
2.2.1.2. Euploidi
Temel takım olan kromozom sayısına monoploit sayı denir. (Bozcuk, 2005). Kromozom sayısındaki artış ve azalışlar temel kromozom sayısının tam katları kadar oluyorsa buna öploidi ve sayıya da öploid denir (Başaran ve ark., 1995).
Poliploidi de bir öploid durumudur ve temel kromozom sayısının ikiden daha çok artması durumunda oluşur (2n, 3n, 4n, 5n gibi). Temel kromozom sayısı kadar kromozom içeren bireyler monoploid (n), üç katı içeren bireyler triploid (3n), dört katı içeren bireyler tetraploid (4n) olarak adlandırılır. Öploidide temel kusur, hücrede çekirdek bölünmesi olduğu halde sitoplâzma bölünmesinin olmamasıdır (endomitoz).
6
Endomitoz durumunda kromozomlar katı kadar çoğalır fakat mitoz bölünmenin ilk iki evresi (profaz ve metafaz) gerçekleştiği halde anafaz ve telofaz safhası olmaz, hücre ve sitoplâzma bölünmesi (sitokinez) olmaz. Bunun sonucunda kromozom sayıları her bölünmede katı kadar artmış olur (Başaran ve ark., 1995).
Poliploidi ikiye ayrılır; otopoliploidi ve allopoliploidi. Bir poliploidin taşıdığı genomların hepsi aynı spesiyesten (türden) geliyorsa, bu durumda otopoliploididen bahsedilir. Bir poliploidin taşıdığı genomların bir kısmı bir spesiyesten, bir kısmı başka bir spesiyesten geliyorsa (melez) allopoliploididen bahsedilir (Bozcuk, 2005).
2.2.2. Yapısal kromozom mutasyonları
2.2.2.1. Delesyon
Kromozomun bir parçasının kaybedilmesidir. Böylece bir veya daha fazla gen kaybedilir. Sonuçta canlı haploitse delesyon ölümcül olabilir, diploitse kaybedilen genler homolog kromozomda da olacağı için (allel genler) ölümcül olmayabilir. Ama bu her zaman böyle sonuçlanmaz. İnsanda erkek bireyde gonozomlar ( X ve Y) homolog olmadığı için bunlardaki delesyonlar ölümcül olabilir. Yine kaybedilen genler dominantsa resesif genlerin etkisi ortaya çıkabilir. Kaybedilen parçanın uçta veya ortalarda olmasına göre terminal delesyon ve interkalar delesyon ayırt edilir. Özel bir delesyon insanda kedi çığlığı sendromunda görülür. Bu sendrom beşinci kromozomlardan birinin kısa kolunun kaybedilmesi sonucu ortaya çıkar (Sağlam, 2000).
2.2.2.2. Duplikasyon
Genetik materyalin herhangi bir kısmı –bir lokus ya da kromozomun büyük bir parçası- genomda birden fazla sayıda bulunursa buna duplikasyon denir. Duplikasyonlar, mayozda sinaps yapan kromozomlar arasında eşit olmayan krosover sonucu meydana
7
gelebilir ya da mayozdan önce bir replikasyon hatası sonucu oluşabilir. Birinci durumda hem duplikasyon, hem de delesyon oluşmaktadır (Klug ve Cummings, 2003).
Drosphila‟ daki Bar göz mutantı da X kromozomunun bir segmentinin duplike olmasından kaynaklanır. Bu sinekler normalden daha küçük göze sahip olurlar (Sağlam 2000).
2.2.2.3. İnversiyon
Kromozom parçasının kopup, ters dönerek eklenmesi sonucu kromozomun içeriği değişmez, fakat gen sıralanışı değişir. Dolayısıyla genetik informasyonda farklılaşmaz. Ancak mayoz sırasında homolog kromozomlar sinaps yaparken –inversiyon sonucu bölgelerin sıralanışı değiştiği için- aynı bölgeler karşı karşıya gelemez, böylece inversiyon çıkıntıları oluşur (Sağlam, 2000).
2.2.2.4. Translokasyon
Kromozomun bir parçası kopup başka bir kromozoma eklenirse bu tip mutasyonlar oluşur (Sağlam, 2000). Translokasyonun şu çeşitleri vardır.
İntrakromozomal (kromozom içi) translokasyonlar; aynı kromozomda ya bir kromozom kolundan diğer kola, ya da aynı kromozom kolu içinde bir kromozom parçasının yerinde olan değişikliği kapsar (Yıldırım ve ark., 2010).
İnterkromozomal (Kromozomlar arası) translokasyonlar; basit translokasyon ve resiprokal translokasyon olmak üzere iki tipi vardır. Basit translokasyon, bir kromozomdan herhangi bir kromozom parçasının homolog olmayan bir kromozoma transferini kapsar. Resiprokal translokasyon ise iki homolog olmayan kromozomlardaki parçaların resiprokal (karşılıklı) değişimini içerir (Yıldırım ve ark., 2010).
8
2.3. Gen mutasyonları:
Bir gen, DNA üzerindeki belirli bir nükleotit dizisini ifade ettiğine göre gen mutasyonları nükleotit düzeyindeki değişikliklerdir diyebiliriz (Sağlam, 2000). Gen mutasyonları veya diğer bir deyimle “Nokta Mutasyonlar” kromozomların yapısında herhangi bir değişiklik yapmadıkları gibi, mikroskopla da gözlenmezler (Demirsoy, 2003).
2.3.1. Gen Mutasyonlarının Kategorileri
Gen mutasyonlarının çok çeşitli oluşu nedeniyle çok değişik sınıflandırılmaları yapılmakta ve bir mutasyon bazen birden fazla kategoride yer alabilmektedir. Aşağıda yaygın olarak bilinen temel mutasyon kategorileri açıklanmıştır (Yıldırım ve ark., 2007).
2.3.1.1. Spontan ve Uyarılmış Mutasyonlar
Doğal ortamda ve belirgin bir mutajenik faktörün etkisi olmadan kendiliğinden meydana gelmiş mutasyonlara spontan mutasyonlar denir. Geçmişte ilk tanımlanan ve analiz edilen mutasyonlar da bu sınıf mutasyonlardır. Spontan mutasyonların çoğunun DNA replikasyonu sürecinde genlerin nükleotit dizilerinde değişiklikler meydana gelmesiyle oluştuğu düşünülmektedir. Genetik şifredeki değişimlerin kodlanan proteinlerin aminoasit dizisine yansıması ise farklı şekillerde olabilir. Spontan mutasyonlarla, proteinlerin biyolojik aktivitesini tamamen kaybetmesine yol açan kritik aminoasit değişiklikleri meydana gelebildiği gibi, bazen proteinin işlevini bozmayan zararsız aminoasit değişiklikleri oluşabilir veya bazen de aynı aminoasidin kodlanması mümkündür. Spontan mutasyonların görülme sıklığı genel olarak oldukça düşüktür ve organizmadan organizmaya farklılık göstermektedir. Örneğin; E. coli’ de replikasyon sırasında her 100 milyon nükleotitte 1 ( 10-8) hata olasılığı söz konusu iken, insanda
spontan mutasyon oranının daha yüksek olduğu ( 10-6
ve 10-5 ) belirlenmiştir (Yıldırım ve ark., 2007).
9
Mutasyon yapıcı faktörler kullanılarak laboratuar ortamında yapay olarak oluşturulan mutasyonlara uyarılmış mutasyonlar denir. 1927‟ de X-ışınlarının Drosophila üzerindeki mutasyon arttırıcı etkisi Hermann J. Mueller tarafından ortaya konduğundan bu yana deneysel amaçlı olarak ilave mutasyonlar elde etmek için radyasyonun çeşitli formları ve çok çeşitli kimyasal mutajenler kullanılmaktadır (Yıldırım ve ark., 2007).
2.3.1.2. Somatik ve Gametik Mutasyonlar
Eşeyli çoğalan çok hücreli organizmalarda mutasyonlar değişikliğin görüldüğü hücre tipine bağlı olarak ikiye ayrılır. Vücut hücrelerinde görülen mutasyonlar somatik mutasyonlar olarak adlandırılır. Somatik mutasyonlar yeni nesillere aktarılmadığı ve mutant bireyin ölümüyle de yok olduğu için evrimsel açıdan önemsizdir. Ancak somatik mutasyonların organizma üzerindeki etkileri farklılık gösterebilir. Somatik mutasyonlarla meydana gelen resesif (çekinik) alleller genellikle dominant ( baskın) allelleri tarafından maskelendiğinden bu tip mutasyonlar birey için nadiren önemlidir. Dominant allellerin oluşması veya mutasyonun X kromozomu üzerinde yer alması gibi maskelemenin söz konusu olmadığı durumlarda somatik mutasyonların bireydeki etkisi daha fazladır. Diğer yandan, embriyonik evrede henüz farklılaşmaya başlamamış hücrelerde oluşan somatik mutasyonlar, kanserde dâhil bazı ciddi hastalıklara sebep olabildiği halde, yetişkin hücrelerinde oluşan mutasyonların etkisi farklılaşmasını tamamlamış ve işlevini sağlıklı şekilde gerçekleştirebilen çok sayıda normal hücre tarafından maskelenebilmektedir (Yıldırım ve ark., 2007).
Üreme hücrelerinde meydana gelen mutasyonlar ise gametik mutasyonlar olarak adlandırılır. Yeni nesillere aktarıldığı ve yeni neslin tüm hücrelerinde yer aldığı için gametik mutasyonlar evrimsel açıdan önem taşır (Yıldırım ve ark., 2007).
2.3.1.3. Morfolojik mutasyonlar
Organizmaların dış görünümünü etkileyen mutasyonlara morfolojik mutasyonlar denir. Morfolojik mutantlar, yabanıl tip (wild-type) bireylerden fenotipik olarak yani gözle
10
görülür şekilde farklı oldukları için kolaylıkla ayırt edilebilirler. Örneğin, memelilerde deri, saç ve gözün koyu renkli olmasını sağlayan melanin adlı pigmentin sentezinden sorumlu ana enzim olan Tirozinaz enzimini kodlayan gende meydana gelen mutasyon nedeniyle, enzimin inaktif olmasına bağlı olarak melanin üretilememesi sonucunda; albino insanlar çok açık ten, saç ve göz rengi ile ve albino fareler ise beyaz tüy ve kırmızı gözleri ile normal bireylerden ayrılırlar (Yıldırım ve ark., 2007).
Mikroorganizmalar ve hatta virüslerde bile az sayıda da olsa morfolojik mutasyon gözlenebilmektedir. Örneğin, Streptococcus pneumoniae bakterisinin insanlarda zatürre hastalığa sebep olan virülent suşu düzgün görünümlü (smoth) koloniler, hastalık yapmayan avirülent mutant suşu ( rough ) pürüzlü görünümlü koloniler oluşturmasıyla ayırt edilebilmektedir (Yıldırım ve ark., 2007).
2.3.1.4. Biyokimyasal mutasyonlar
Bir organizmanın herhangi bir biyokimyasal ya da sentez reaksiyonunu gerçekleştiremez duruma gelmesine neden olan mutasyonlara biyokimyasal mutasyonlar denir (Yıldırım ve ark., 2007).
Aminoasit, nükleotit, vitaminler ve gerekli diğer maddeleri sentezleyerek basit besi ortamında kolayca üreyebilen mikroorganizmalara prototroflar denir. Mutasyon sonucunda, basit besi ortamına takviye besin isteyen mikroorganizmalara ise okzotroflar denir. Örneğin; Ames testinde kullanılan Salmonella typhimurium‟un mutant suşları histidini sentezleyemez ve bu yüzden üreme için histidine gereksinim duyarlar.
2.3.1.5. Letal mutasyonlar
Ölüme yol açan tipteki mutasyonlara letal mutasyonlar adı verilir. Bu mutasyonlar genel olarak hayati önemi olan genlerde görülmektedir. Örneğin, RNA polimeraz enziminin bir alt ünitesini kodlayan gende oluşan bir mutasyon nedeniyle aktif polimeraz
11
üretemeyen bir organizma RNA sentezi duracağı için yaşamını sürdüremez (Yıldırım ve ark., 2007).
Haploid organizmalarda mutasyonu maskeleyecek yabanıl tip allel mevcut olmadığından bir letal mutasyon resesif karakterli olduğunda dahi öldürücüdür. Örneğin; bir aminoasidi sentezleyemeyen bir bakteri, o aminoasidin olmadığı ortamda üreyemez. Diploid organizmaların heterozigot bireylerinde ise resesif letal mutastonlar tolere edilebilir, ancak iki kusurlu genin bir araya geldiği homozigot bireylerde ölümcül etki görülür (Yıldırım ve ark., 2007).
2.3.1.6. Koşullu mutasyonlar
Etkisi sadece belirli şartlar altında görülebilen mutasyonlara koşullu mutasyonlar denir. Koşullu mutasyonların çoğu aynı zamanda koşullu letaldirler, çünkü mutant organizma kısıtlayıcı ortama maruz kaldığında etkisi belirgin hale gelen mutasyon ölüme neden olur. Birçok organizmada gözlenen ısıya duyarlı mutasyonlar bu tip mutasyon grubuna örnek teşkil eder. Isıya duyarlı bir mutant organizma, tolere edilebilir derecedeki düşük sıcaklıkta gelişebilirken, kendisi için kısıtlayıcı ortam olan yabanıl tip organizmanın normal gelişme sıcaklığında yaşayamaz. Bu mutasyonun etkisiyle ısıya duyarlı hale gelen molekül gen değil, genin ürünü olan proteindir ve bu mutant protein yabanıl proteinin çalıştığı sıcaklıkta denatüre olduğu için fonksiyonunu kaybeder (Yıldırım ve ark., 2007).
Isıya duyarlı mutasyonlara insanlarda da rastlanmaktadır. Örneğin, vücut sıcaklığında uygun üç boyutlu yapısını oluşturacak katlanmaları yapamadığı için inaktif olan mutant proteinin kistik fibrozis hastalığının bir tipine (∆508) neden olduğu ve düşük sıcaklıklarda ise bu proteinin fonksiyonunu normal şekilde gerçekleştirdiği de bilinmektedir (Yıldırım ve ark., 2007).
12
2.3.2. Gen Mutasyonlarının Çeşitleri
2.3.2.1. Baz değişimi mutasyonları
Bir gen bölgesi içinde bir bazın farklı bir bazla yer değiştirmesi ile meydana gelen mutasyonlardır. Baz değişimi mutasyonları nokta mutasyonları olarak da isimlendirilebilir. Bu tip mutasyonlarda bazların değişimi iki şekilde gerçekleşebilir. Pirimidin bazının yine bir pirimidinle veya pürin bazının yine bir pürinle yer değiştirmesi transisyon mutasyonu ve bir pirimidinin bir pürinle yer değiştirmesi ise transversiyon mutasyonu olarak adlandırılır (Yıldırım ve ark., 2007).
2.3.2.2. Sessiz, yanlış anlamlı ve anlamsız mutasyonlar:
DNA bazlarında meydana gelen her türlü değişiklik mutasyon olarak kabul edilirse de, saptanabilir bir fenotipik etki oluşturmayan tipte mutasyonlarda mevcuttur. Bu mutasyonlar gen ürününün yapısını ve aktivitesini değiştirmedikleri için sessiz (silent) mutasyon olarak adlandırılır. Örneğin; UAC tripletinin UAU‟ ya dönüşmesi gerçek anlamda bir nokta mutasyonu olmasına rağmen her iki triplette aynı aminoasidi (tirozin) kodladığından genin protein ürününde bir değişim görülmez. Sessiz mutasyon oluşumu genetik şifrenin dejenere özelliğinden, yani tripletlerin ilk iki bazı son derece spesifik iken üçüncü bazdaki farklılığın tolere edilebilmesinden kaynaklanmaktadır. Ayrıca, baz değişikliğinin intron adı verilen ve genin fonksiyonu üzerinde etkisi olmayan bölgede meydana gelmesi de yine sessiz mutasyona sebep olur. Sessiz mutasyonların varlığı ancak ilgili genin baz dizisinin belirlenmesiyle ortaya konulabilir (Yıldırım ve ark., 2007).
Tripletlerin anlamlarının değişmesine ve proteinin yapısına farklı bir aminoasit katılmasına neden olan nokta mutasyonlarına yanlış anlamlı (missense) mutasyon denir. Örneğin, bu tip bir mutasyonla tirozini kodlayan UAU tripleti, serini kodlayan UCU tripletine dönüşebilir (Yıldırım ve ark., 2007).
13
Yanlış anlamlı mutasyonların protein üzerindeki etkileri değişkendir. Şöyle ki: i. kabul edilebilir, ii. kısmen kabul edilebilir veya iii. Kabul edilemez nitelikte olmak üzere üç farklı nitelikte etki ortaya çıkarabilir (Yıldırım ve ark., 2007).
Kabul edilebilir durumda, bir aminoasidin yerini benzer fonksiyonel gruba sahip diğer bir aminoasit aldığından protein biyolojik işlevini normal şekilde gerçekleştirebilir ve yabanıl proteinle mutant olanı fenotipik olarak ayırt etmek mümkün değildir. Kısmen kabul edilebilir durumda, proteinin işlevini kısmi olarak diğer bir ifadeyle düşük etkinlikte sürdürmesine neden olacak bir aminoasit değişimi söz konusudur. Kabul edilemez durumda ise aminoasit değişimi proteinin görev yapamaz hale gelmesine yani aktivitesini tamamen kaybetmesine neden olur. Yanlış anlamlı mutasyonun belirtilen farklı etki tiplerinin tümüne orak hücre anemili hastalarda rastlanmaktadır (Yıldırım ve ark., 2007).
Gen mutasyonları bazen bir tripletin hiçbir amino asiti şifrelemeyip, dur anlamına gelen tripletlere (UAA, UAG, UGA) dönüşmesine neden olabilmektedir ki bu tip mutasyona da anlamsız (nonsense) mutasyon denir. Anlamsız mutasyonun bir gen dizsinin özellikle başlangıç ve orta kısımlarında meydana gelmesi erken zincir sonlanmasına yani protein molekülünün sadece bir kısmının üretilmesine neden olur ve bu durumdaki bir proteinin işlevini yerine getirememe olasılığı son derece yüksektir (Yıldırım ve ark., 2007).
2.3.2.3. Çerçeve kayması mutasyonları:
DNA molekülüne fazladan bir veya daha fazla baz çiftinin girmesi ya da çıkmasıyla oluşan mutasyonlara çerçeve kayması mutasyonları ismi verilir. Bu mutasyonlarda, bir veya daha fazla baz çiftinin ilavesine insersiyon (addition), ayrılmasına ise delesyon ismi verilir (Konuk ve Liman, 2012).
m RNA (mesajcı Ribonükleik asit), translasyon sırasında bir seri nükleotit üçlülerini okuduğu için nükleotitlerin eklenmesi veya eksilmesi, genetik mesajın okunan çerçevesini değiştirebilir. Çerçeve kayması mutasyonu, genin sonuna oldukça yakın bir
14
bölgede olmadığı sürece, bu mutasyon hemen hemen her zaman işlevsel olmayan bir protein üretecektir (Campbell ve Reece, 2008).
Çerçeve kayması mutasyonu şifrenin tümüyle değişmesi yanında ayrıca bazen de herhangi bir noktada dur anlamına gelen bir tripletin ortaya çıkmasına ve erken zincir sonlanmasına da neden olabilmektedir (Yıldırım ve ark., 2007).
2.3.3. Gen Mutasyonlarının Sebepleri
2.3.3.1. DNA Replikasyonu Hataları
Hücrelerde DNA replikasyonu ne kadar hassasiyetle gerçekleştirilmeye çalışılsa da zaman zaman spontan replikasyon hataları meydana gelebilmektedir. Bu hataların oluşumunda rol oynayan en önemli faktör tautomerizasyon olayıdır. DNA‟ nın yapısında yer alan pürin ve pirimidin bazları, tautomer olarak adlandırılan alternatif kimyasal formlara sahiptir. Bazların tautomerik formlarının moleküler formülleri aynı, sadece atomlar arasındaki bağ konfigürasyonları farklıdır. Timin ile guanin bazlarının keto-enol formları ve, adenin ile sitozin bazlarının amino-imino formları karbon ve azot atomları arasında spontan proton kayması (tautomerik kayma) sonucunda oluşmaktadır (Yıldırım ve ark., 2007).
Timin (T) ve guanin (G) bazlarının keto, sitozin (C) ve adenin (A) bazlarının amino formları DNA‟ da standart baz eşleşmelerine olanak sağlayan kararlı tautomerlerdir. Mutasyona neden olan DNA replikasyon hatalarının sebebi ise bazen kalıp DNA‟ da yer alan, bazen de yeni sentezlenen ipliğe katılan bazlarda spontan olarak meydana gelebilen tautomerik kaymalar sonucunda oluşan timin ve guaninin enol , sitozin ve adeninin imino formlarıdır ki, bunlar yanlış bazlarla eşleşirler (Yıldırım ve ark., 2007). Örneğin; timin bazı normalde adenin ile baz çifti yapar. Fakat molekül içindeki bir proton kayması sonucunda timin keto formundan enol formuna geçer ve bu formda üç hidrojen bağı yapabilecek duruma gelir. Böylece, enol formundaki timin guanin bazıyla yanlış eşleşebilir ve T=A baz çifti yerine T≡G baz çifti oluşur. Görüldüğü gibi adenin
15
bazı yerine guanin bazı yapıya girmiştir. Dolayısıyla bu bir transisyonel mutasyondur. Aynı şey sitozin içinde geçerlidir. Sitozin normal amino formundan imino formuna geçerse iki hidrojen bağı yapabilir ve adeninle çift yapar. Böylece C≡G baz çifti yerine C=A çifti oluşur. Asıl taban çifti değişmeleri ise DNA‟ nın ikinci replikasyou sonucu olur (Sağlam, 2000). İkinci replikasyonda adenin bazının karşısına timin bazı gelir ve sonuç olarak başlangıçtaki C≡G baz çifti T=A baz çiftine dönüşmüş olur.
2.3.3.2. Kimyasal mutajenler
DNA‟ yı farklı şekillerde etkileyerek molekülün çeşitli yerlerinde bozukluklara neden olan pek çok kimyasal madde vardır (Yıldırım ve ark., 2007).
Baz Analogları
Hücrede DNA‟ nın yapısını oluşturan pürin ve pirimidin bazlarına benzeyen ve replikasyon sırasında bu bazların yerine geçebilen moleküllere baz analogları denir. Baz analogları mutajenik kimyasallardır ve DNA‟ nın bir zincirine yerleştiklerinde bu DNA‟dan kopyalanan yeni DNA moleküllerinde yanlış baz çiftlerinin yer almasına sebep olurlar. Urasilin bir türevi olan 5-Bromourasil (5-BU), timin analoğudur ve yapısında metil grubu yerine brom atomu taşır (Yıldırım ve ark., 2007).
Tautomerik kayma eğilimi hayli, yüksek olan 5-BU, DNA‟ da timinin yerini aldığında yaygın keto formunda iken adenin ile, enol formuna dönüştüğünde ise guanin ile eşleşmektedir(Yıldırım ve ark., 2007). T=A yerine 5-BU=A ve sonuçta 5-BU≡G çifti oluşur (Sağlam, 2000). Replikasyon sonucu bu guanin bazının karşısına normalde olduğu gibi sitozin bazı gelir ve sonuçta T=A çifti, C≡G çiftine dönüşmüş olur.
Başka bir baz analoğu ise 2-Aminopürin (2-AP)‟ dir. Buda adeninin baz analoğu olup amino formuda timinle normal eşleşme yaparken, imino formunda sitozinle eşleşir. Böylece A=T çifti yerine 2-AP=T çifti ve bunun yerine 2-AP≡C çifti gelir. Replikasyon
16
sonucu bu sitozin bazının karşısına normalde olduğu gibi guanin bazı gelir ve sonuçta A=T çifti, G≡C çiftine dönüşmüş olur (Sağlam, 2000).
Alkilleyici ajanlar
Nükleotitlerin amino ve keto gruplarına karbon içeren alkil grupları (─ CH3 veya
─CH3─ CH2) ekleyerek alkilasyona neden olan alkilleyici ajanlar arasında kükürt içeren
hardal gazı, dimetil sülfonat, dietilsülfonat, etil metan sülfonat (EMS) ve nitrozoguanidin gibi kimyasal maddeler sayılabilir. Alkilasyon çoğunlukla, bazlarda tautomerik kaymalara ve bundan kaynaklanan yanlış baz eşleşmelerine bağlı transisyon mutasyonlarına sebep olur (Yıldırım ve ark., 2007).
Örneğin EMS, guaninin 6 numaralı pozisyonundaki keto grubuna etil grubu (─CH3─
CH2) takarak alkiller. Guanin bazı normalde sitozinle eşleşirken oluşan 6-etil-guanin
sitozin yerine timinle eşleşir. Bu da bir transisyon mutasyonudur.
İnterkalasyon ajanlar
Bazı organik moleküller yapısal olarak baz çiftlerine benzerler ve DNA molekülünün bazları arasına sıkışarak girebilirler. Bazlar arasına girebilen yani interkale olabilen maddelere örnek olarak proflavin, akridin sarısı ve etidyum bromid verilebilir (Yıldırım ve ark., 2007).
Bu ajanların bazlar arasına yerleşmesi DNA‟ nın sarmal yapısında genişlemeye yol açar. Bu durum genellikle DNA‟ ya baz çifti eklenmesine veya DNA‟ dan baz çifti çıkmasına ve sonuç olarak çerçeve kayması mutasyonlarına sebep olur (Yıldırım ve ark., 2007).
17
Diğer ajanlar
Bazı kimyasal ajanlar amino grubuna sahip olan adenin ve sitozin bazlarının amino gruplarını keto gruplarına dönüştürür. Bu olaya deaminasyon denir. Nitröz asit (HNO2)
deaminasyona neden olan bir mutajendir (Yıldırım ve ark., 2007).
Nitröz asiti, sitozini deamine ederek urasili oluşturur ve arkasından gelen ilk replikasyonda adenin ile birleşerek G.C→A.T transisyonuna sebep olur. Adeninin, gunanin analoğu hipoksantine deaminasyonu A.T→G.C transisyonu ile souçlanır (Turner ve ark., 2004).
Adenin bazının deaminasyonu sonucunda hipoksantin bazı oluşur. Hipoksantin bazı ise adenin gibi timinle değil, sitozin ile eşleşir. Yine sitozin bazının deaminasyonu sonucu oluşan urasil bazıda guaninle değil, adeninle birleşir. Gerçekleşen bu değişiklikler birer transisyondur.
DNA‟ da mutastona sebep olan diğer önemli ajanlar arasında, hidrojen peroksit (H2O2),
hidroksi radikaller (-OH) ve süperoksit (O2) gibi reaktif oksijen türleri yer alır. Normal
aerobik metabolizmanın yan ürünleri olan bu serbest radikaller, DNA bazlarını etkileyerek 8-oksoguanin, 2-oksoadenin ve 5-hidroksimetilurasil gibi baz eşleşme özellikleri değişmiş çeşitli oksidatif ürünler çıkmasına sebep olur. Bunlar spontan baz değişikliği mutasyonları yaratır (Yıldırım ve ark., 2007).
2.3.3.3. Fiziksel mutajenler
UV radyasyonu
Elektromanyetik spektrum içinde enerji, dalga boyuyla ters orantılı olarak değişir. UV (Ultraviole) ışınları dalga boyları uzun, enerji seviyeleri düşük ışınlardır.
18
UV ye maruz kalan DNA‟ da pirimidin bazları pürine göre daha fazla UV ışını absorbe ederler ve bu bazlarda fotokimyasal değişmeler meydana gelir. UV ışınları DNA‟ da ardı ardına yer alan iki timin bazı arasında timin dimeri adı verilen özel bir yapının oluşumuna neden olur. Sitozin-sitozin ve sitozin- timin dimerlerinin oluşumu daha nadir olarak görülür (Yıldırım ve ark., 2007).
Timinler arasındaki çapraz bağlanma, bazlar arasındaki mesafeyi kısalttığı ve DNA‟ nın bu kısmında çıkıntı şeklinde bir deformasyon yarattığı için replikasyonu engeller. Replikasyon bu duruma rağmen devam ettiği takdirde bu bölgenin karşısına gelen DNA zincirine rastgele bazlar eklenmesi mutasyona neden olur (Yıldırım ve ark., 2007).
X-Işınları, Gamma Işınları ve Kozmik Işınlar
X-Işınları, gamma ışınları ve kozmik ışınlar UV ışınlarından daha düşük dalga boylarına sahiptir ve bu nedenle enerjileri daha yüksektir. Bunun bir sonucu olarak dokuların derinliklerine inebilecek kadar kuvvetlidirler ve yolları boyunca karşılaştıkları moleküllerin iyonizasyonuna sebep olurlar (Klug ve Cummings, 2003).
İyonizasyon ile elektron kaybeden moleküller (özellikle DNA etrafındaki su molekülleri) serbest radikallere dönüşürler. Bu moleküller son derece reaktif olup, DNA‟ da baz değişimlerine bağlı nokta mutasyonu ve daha önemlisi yine DNA‟ da tek veya çift iplikte kopmalara bağlı delesyon, translokasyonla ve kromozom kırıkları meydana getirebilir (Yıldırım ve ark., 2007).
2.4. Mutajenlerin saptanması için geliştirilmiş kısa zamanlı test sistemleri ve Ames testi
Mutajenlerin etki mekanizması kesin olarak aydınlatıldıktan sonra belirli çevresel mutajenlerin insanda kansere sebep olabileceği şüphesi doğmuştur. Mutajenite ve karsinojenite arasındaki ilişkiyi araştıran bir çalışma ile bilinen 175 karsinojenik maddenin 157‟ sinin aynı zamanda mutajen olduğu ve karsinojenite ve mutajenite arasında % 90 oranında bir bağlantı olduğu ileri sürülmüştür. Bu sebeple kimyasal
19
maddeleri „„mutajen‟‟ ve „„kanserojen‟‟ olarak iki grupta incelemek yerine, mutajen/ kanserojen olarak incelemek daha doğru olduğu kabul edilmektedir (Saleh, 1997). Çevremizde bulunan ve biyolojik etkileri henüz bilinmeyen sayıları milyonları bulan sentetik ve doğal maddelerin kanserojenik potansiyelleri açısından test edilmesi sağlığımız açısından gerekmekle birlikte laboratuar hayvanları ile yapılan kanserojenezis deneylerinin hem çok zaman almaları hem de çok pahalı olmaları nedeniyle başarılamayacak bir durum arz etmektedir (Bağcı 1985).
Bu nedenle, kimyasal maddelerin kanserojenik potansiyellerini ölçebilmek için, canlı hayvan deneyleri yerine birçok in vitro test sistemi geliştirilmiştir. Kısa zamanlı testler (short-term tests) diye bilinen bu testlerle kimyasal maddelerin belirli genetik sistemlerde belirli sonuçlar verip vermedikleri ölçülmekte ve elde edilen sonuçlarla maddelerin kanserojenik potansiyelleri arasında ilişki kurulmaktadır (Bağcı 1985). Mutajenlerin saptanması için geliştirilmiş kısa zamanlı test sistemleri ve bunların dayandığı genetiksel ve biyokimyasal yollar Çizelge 2.1‟ de verilmiştir.
Çizelge 2.1. Mutajenlerin saptanması için geliştirilmiş kısa zamanlı test sistemleri ve bunların dayandığı genetiksel ve biyokimyasal yollar (Diril, 1988)
Kısa Zamanlı Testler İzlenen Genetiksel Biyokimyasal Yol Literatür
1. Salmonella typhimurium Histidin okzotrofları Ames vd. 1973a, Maron ve Ames 1983.
2. Escherichia coli
Arginin-triptofan okzotrofları
Profaj indüksiyonu
Onarım eksikliği olan suşların büyümelerinin inhibisyonu SOS cevabı Green ve Murial 1976 Elesperu ve Yarmolinsky 1979 Moreu vd. 1976 Rosenkranz ve Mermelstein 1980 Slater vd. 1971 Quillardet ve Hofnung 1985 Quillardet vd. 1985
3. Bacillus subtilis DNA onarımı hatalı suşlar Kada ve Hirano 1980
4. Neurospora crassa Adenin okzotrofları Brockman 1984 5. Çin hamsteri ovaryum ve akciğer hücreleri HGPRT
(Hipoksantinguanin fosforiboziltransferaz) Lokusunda mutasyonlar
Beaudet 1973
6. Fare karaciğeri epitel hücreleri 8-Azaguanine dirençlilik Vogel ve Sobels 1976 7. Drosophila melanogaster Kromozomal hatalar Vogel ve Sobels 1976
8. Suriye hamsteri embriyo hücreleri Morfolojik transformasyonlar Pienta vd. 1977 9. Çin hamsteri hücreleri Kardeş kromatid değişimi Perry ve Evans 1975 10. İnsan periferal lenfositleri Kromozomal hatalar Preston vd. 1981
21
Genetik toksisite, genotoksinlerin kromozom ve DNA yapısında meydana getirdiği hasarları kapsayan bir terimdir. Bu hasarlar genellikle gen mutasyonları, kromozom anormallikleri, DNA zincir kırıkları ve DNA eklentileridir. Bu tip genetik hasarlar; doğum defektleri, kanser, yaşlanma, infertilite ve bazı genetik ve multifaktoryal hastalıklara yol açabildiği için, mutajen ve karsinojenlerin tanımlanması ve risklerinin en düşük seviyeye indirilebilmesi halk sağlığının korunması için önemlidir (Şekeroğlu ve Şekeroğlu, 2011).
Genotoksisite testleri, kimyasal ve fiziksel ajanların mutajenitelerinin belirlenmesi ve bu ajanların karsinojenik potansiyellerinin tahmin edilebilmesi için kullanılmaktadır. Bu testler; fiziksel etkenlerin, ilaçların, çevresel kirleticiler ve gıda katkı maddeleri gibi günlük yaşamda sıklıkla maruz kaldığımız her türlü kimyasal maddenin genotoksik ve kanserojenik potansiyellerinin ve güvenilirliliklerinin araştırılmasını, kanser riskinin tahmin edilmesini ve kanserin izlenmesini sağlayan biyoizlem testleridir (Şekeroğlu ve Şekeroğlu, 2011).
DNA ile etkileşerek kanserojenik etki gösteren kimyasal maddeler genotoksik kanserojenler olarak sınıflandırılır. Ames, bu amaçla çok duyarlı bir yöntem geliştirmiştir. Salmonella bakterileri kullanılarak yapılan bu yöntem genotoksik kanserojenik etkinin araştırılmasında, mutajenezis kanserojenezis ilişkisinden yararlanarak, birçok çevre kirleticileri ve ilaçlara uygulanmaktadır (Vural, 1984).
2.4.1. Ames / Salmonella / Mikrozom test yöntemi
Dr. Bruce Ames tarafından geliştirilmiş ve Ames testi olarak da adlandırılan
Salmonella/mikrozom test sistemi, kimyasal maddelerin mutajenik etkilerinin
araştırılmasında en yaygın olarak kullanılan, mutajen-karsinojen etkisi en iyi bilinen ve geçerliliği en fazla kabul edilmiş kısa zamanlı bakteriyel test sistemlerinden birisidir (Maron ve Ames, 1983).
22
Bu test sisteminde, Salmonella typhimurium LT2 atasal suşundan in vitro mutasyonlarla elde edilmiş bir seri Salmonella typhimurium mutant suşları kullanılmaktadır (Maron ve Ames, 1983).
Bu testin temeli, yapay mutasyon oluşturulmuş olan Salmonella typhimurium’un histidin sentezleme yeteneklerini kaybetmiş (his-) olan suşlarının test bileşeni ile
muamelesinden sonra tekrar bir mutasyon geçirip histidin sentezleyebilen (his+
) haline dönüşmesi esasına dayanır (Ames ve ark., 1973a).
Şekil 2.1. Ames testinin uygulanması ve mutajeniteyi gösteren koloniler (Şekeroğlu ve Şekeroğlu, 2011)
Ames testinde, çeşitli kimyasal maddelerin mutajenitesinin belirlenebilmesi için histidine ihtiyaç duyan suşlar kullanılmaktadır. Genel mutajenite testleri için en çok kullanılan test suşları; TA 98, TA 100, TA 102, TA 1535 ve TA 1538’ dir. Her bir test suşu histidin operonunda değişik tipte mutasyonlar içermektedir (Maron ve Ames 1983).
23
2.5. Salmonella typhimurim’un genetik özellikleri
Salmonella typhimurium LT2 atasal suşundan in vitro mutasyonlarla elde edilmiş
suşlarının genetik özellikleri aşağıda belirtilmiştir.
2.5.1. Histidin (his) mutasyonu
Her test suşu, histidin operonunun değişik bölgelerinde çeşitli mutasyonlar içermektedir. Bunlar, ya DNA’daki tek bir bazın değişmesi ile ortaya çıkan baz değişimleri ya da bir bazın eklenmesi ya da çıkarılması ile kendini gösteren çerçeve kayması mutasyonlarıdır (Ames ve ark., 1973b).
His G 46 mutasyonu
His G geni bakteriler tarafından histidin sentezinde kullanılan ilk enzimi kodlayan gendir. Bu mutasyon TA 1535 ve TA 100 mutantlarında vardır. His G geninde lösin aminoasidinin kodunu –GAG- baz çifti değişimi sonucu prolin amino asidi kodunu olan –GGG- dönüşmüştür. Bu mutasyon her iki mutantta da baz çifti değişimlerine neden olan mutajenik kimyasallar tarafından geri dönüştürülür (Kokmaz, 2005).
His D 3052 mutasyonu
His D geni de histidin sentezinde kullanılan histidinol dehidrogenaz enzimi kodlamaktadır. Bu mutasyon gendeki tek bir nükleotidin eksikliği sonucu ortaya çıkmış olan çerçeve kayması tipinde bir mutasyondur. TA 98 ve TA 1538 mutantlarında vardır (Kokmaz, 2005).
24
His D 6610 mutasyonu
Bu mutasyon gene bir nükleotid eklenmesi sonucu ortaya çıkmış olan çerçeve kayması tipinde bir mutasyondur. Mutasyonda etkilenen bölgede beş yerine altı sitozin dizisi bulunmaktadır (Kokmaz, 2005).
His G 428 mutasyonu
”ochre” stop kodonu varlığından dolayı his G geni inaktif durumdadır (Kokmaz, 2005). Başlangıçta geliştirilen his
mutantlarının kimyasal maddelere duyarlılığını arttırmak amacıyla çeşitli mutasyonlar eklenmiştir.
2.5.2. Rfa Mutasyonu
Salmonella typhimurium, gram negatif bir bakteridir. Gram negatif bakterilerin
peptidoglikan yapılı hücre duvarlarının dış kısmında lipopolisakkarit (LPS) bir tabaka bulunur. Bu tabakanın fonksiyonlarından biri de bakteri hücresinin içine kimyasal madde geçişlerini engelleyerek, bakteriyi korumaktır.
Bu mutasyon bakteri hücre duvarının LPS tabakasını kodlayan genlerde meydana gelmiştir. LPS tabakanın kısmen yok olması ile normalde hücre içine giremeyen büyük moleküller hücre içine girmektedir (Mumcu, 2005). Bu mutasyon sayesinde, bakteri hücresi içine madde girişi kolaylaştığından, bakterinin mutajenlere karşı duyarlılığı arttırılmıştır.
25
2.5.3. uvrB Mutasyonu
Bakterilerde UV’ nin sebep olduğu DNA hasarlarını tamir etmek için, uvrA, uvrB ve uvrC adı verilen genlerden sentezlenen bir enzim görev alır.
uvrB mutasyonu, DNA onarım sisteminde kesip çıkarma görevini üstlenen enzimi kodlayan uvrB genindeki delesyon sonucu oluşmuştur. uvrB mutasyonu, birçok mutajenin ortaya çıkarılmasında duyarlılığın artmasına neden olur. Ancak, teknik nedenlerden dolayı uvrB geninin kesilerek uzaklaştırılması sırasında bu delesyon, biotin genine kadar uzanmaktadır. Biotin geni ise vitamin H denilen biotinin sentezinden sorumludur. Bu nedenle, bakteriler üreyebilmeleri için histidinin yanında biotine de gereksinim duyarlar (Ames ve ark., 1973b).
2.5.4. R-faktörü
TA 1535 ve TA 1538 LT2’ den mutajenize edilmiş plazmid taşımayan suşlardır. Ancak, bunlardan mutajenler pek iyi tayin edilememektedir. Bu yüzden bu suşlara R-faktör plazmidi, yani ampisiline dirençlilik geni taşıyan bir plazmid olan pKM 101 plazmidi yerleştirilmiştir (Akyıl, 2006).
TA1538 suşuna bu plazmidin eklenmesi sonucu TA98; TA1535 suşuna eklenmesi sonucu ise TA100 suşu elde edilmiştir. Mutajenik olduğu belirlenen ajanlara karşı plazmidi taşıyan suşların hassasiyetinin daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Çünkü bu plazmid üzerinde, hataya meyilli onarım sistemi olan SOS onarım sistemine ait genler bulunmaktadır. Bu plazmidin eklenmesi sonucu SOS onarımı ve rekombinasyonel onarım daha fazla devreye gireceğinden kimyasal ve fiziksel mutajenlerle indüklenen mutajenite de artmış olacaktır (Mortelmans and Zeiger, 2000).
Ames testinde yaygın olarak kullanılan Salmonella test suşlarının genotipik özellikleri ve DNA dizi özgüllükleri Çizelge 2.2. ve Çizelge 2.3.’ te verilmiştir.
26
Çizelge 2.2. Yaygın olarak kullanılan Salmonella test suşlarının genotipik özellikleri (Mortelmans and Zeiger, 2000)
Mutasyon bio chID uvrB gal LPS hasarı Plazmit (suş)
hisG46
TA 1535 Delesyon mutasyonu rfa Plazmit yok TA 100 Delesyon mutasyonu rfa pKM101
hisD3052
TA 1538 Delesyon mutasyonu rfa Plazmit yok TA 98 Delesyon mutasyonu rfa pKM101
hisC3076
TA 1537 Delesyon mutasyonu rfa Plazmit yok
hisD6610 Delesyon mutasyonu rfa Plazmit yok
hisO1242
TA97
hisG428
TA 104 Delesyon mutasyonu rfa Plazmit yok TA 102 Atasal suş rfa pKM101, pAQ1
27
Çizelge 2.3. Salmonella test suşlarının DNA dizi özgüllükleri (Mortelmans and Zeiger, 2000)
Allel suş DNA’ daki hedef bölge Geri dönüşüm mekanizması
hisG46 -G-G-G- Baz çifti değişimi
TA 1535 TA 100
hisD3052 -C-G-C-G-C-G-C-G Çerçeve kayması
TA 1538 TA 98
hisC3076 +1 çerçeve kayması Çerçeve kayması
TA 1537 (-C-C-C- dizisinin yakınında)
hisD6610 -C-C-C-C-C-C- Çerçeve kayması
(C dizisinin yanına +1 sitozin)
hisG428
TA 102 TAA (ochre) Transisyon/transversiyon TA 104
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3. 1. Kimyasal Maddeler
MgSO4.7H2O (Magnezyum sülfat), Sitrikasit monohidrat, K2HPO4 (Potasyum fosfat),
NaHNH4 PO4.4H2O (Sodyum amonyum fosfat), D-Biyotin, L-Histidin-HCl, NaCl
(Sodyum klorür), Kristal viyole, D-glikoz 6-fosfat, 4- Nitro-o Fenilendiamine, Sodyum Azid, Agar, Nutrient broth (NB) no:2, NaOH, HCl, Ampisilin trihidrat
3.2. Salmonella tpyhimurium test suşları
Deneyde Ames ve arkadaşları tarafından Salmonella typhimurium LT2 atasal suşundan
in vitro mutasyonlarla geliştirilen TA 98 ve TA 100 suşları kullanılmış olup, bu suşlar
Hacettepe Üniversitesi öğretim üyesi Prof. Dr. Nuran Diril’ den sağlanmıştır.
3.3. Deneyde Kullanılan Ortamların İçerikleri ve Hazırlanmaları
3.3.1. Vogel-Bonner- E Tuz Çözeltisi (50x VB)
Kullanım: Minimal Glikoz Agar (MGA) ve Hisitidin Biyotin Agar (HBA) plakları 1000 ml
Magnezyum sülfat (MgSO4.7H2O) 10 gr
Sitrikasit monohidrat 100 gr
Potasyum fosfat (K2HPO4) 500 gr
Sodyum amonyum fosfat (NaHNH4 PO4.4H2O) 175 gr
29
Maddeler yukarıda yazıldıkları sıra ile 45 C’ deki suya eklendi. Ekleme işlemi yapılırken, bir önceki kimyasalın tamamen çözünmesi beklendi. Toplam hacim, distile su ile 1000 ml’ye tamamlandı. 121°C de 15 dakika otoklava konularak steril hale getirildi.
3.3.2. (0.5 mM) Histidin/Biyotin (HB) Solüsyonu
Kullanım: Mutajenite deneyi (100 ml top agara 10 ml olarak) 250 ml için
D-Biyotin (F.W. 247.3) 0,0309 g
L-Histidin-HCl (F.W. 191.7) 0,024 g
Distile su 250 ml
Biyotin suyun kaynama noktasına kadar ısıtılarak çözüldü, daha sonra histidin ilave edilerek otoklavda 121 C’de 15 dakika sterilize edildi. +4 oC’ de saklandı.
3.3.3. (% 0.8/0.02 NaOH) Ampisilin Solüsyonu
Kullanım: pKM101 plazmidi (R faktör) taşıyan suşların genetik işaretlerinin kontrolünde ve master plakları.
100 ml için
Ampisilin trihidrat 0.8 gr
0.02 N Sodyum hidroksit 100 ml
Ampisilin trihidrat, 0.02 N NaOH içinde çözüldü ve sterilizasyon için 0.22 m çaplı filtreden geçirildi.
3.3.4. 0,02N NaOH Hazırlanışı
250 ml
NaOH 0,2 g
30
3.3.5. (% 0,13) Biyotin Çözeltisi
Kullanım: Genotip kontrolü ve HBA plakları hazırlanması 50 ml
D-biyotin 0,00065 g
Distile su 50 ml
Biyotin suyun kaynama noktasına kadar ısıtılarak çözüldü. Otoklavda 121 C’ de 15 dakika sterilize edildi. +4 C’ de saklandı.
3.3.6. (% 0.5) Histidin Çözeltisi
Kullanım: Genotip kontrolü ve HBA plakları hazırlanması 100 ml L-Histidin-HCl (F.W. 191.7) 0.5 g
Distile su 100 ml
Otoklavda 121 C’de 15 dakika sterilize edildi. +4 C’de saklandı.
3.3.7. (%20) Glikoz Çözeltisi
Kullanım: MGA ve HBA plaklarının hazırlanması
100 ml
Glikoz 20 g
Distile su 100 ml
Glikoz distile su içinde tamamen çözülerek otoklavda 121 C’de 15 dakika sterilize edildi. +4 C’de saklandı.
31
3.3.8. Minimal Glikoz Agar Plakları (MGA)
Kullanım: Spontan olarak geriye dönüş sıklığının kontrolü, pozitif kontrol, negatif kontrol ve mutasyon deneyi
500 ml
Agar 7,5 g
Distile su 440 ml
50x VB 10 ml
% 20 glikoz 50 ml
Agar ve su karıştırıldıktan sonra otoklavlanarak sterilize edildi. 45 C’ye soğutulup % 20 glikoz ve 50xVB tuzları karıştırılıp petri kutularına 25 ml olarak dağıtıldı. +4 C’de 2 ay saklanabilir.
3.3.9. Histidin/Biyotin Plakları (HB agar)
Kullanım: Histidin gereksinim deneyi
1000 ml Agar 15 g % 20 glikoz 100 ml 50XVB 20 ml Histidin HCl. H2O 10 ml 0.5 mM Biyotin 6 ml Distile su 864 ml
Agar ve su karıştırıldıktan sonra 121 C de 15 dakika otoklavlanarak sterilize edildi. 45 C’ye soğutulup % 20 glikoz, 50xVB tuzları ve histidin çözeltisi eklendi, solüsyon biraz daha soğuduktan sonra biyotin eklendi, karıştırılıp petri kutularına 25 ml olarak dağıtıldı.+4 C’de saklanır.
32
3.3.10. Histidin/Biyotin/Ampisilin Plakları (HBA agar)
Kullanım: Ampisiline dirençlilik testi ve master plak hazırlanması 1000 ml Agar 15 g Distile su 860 ml 50XVB tuzları 20 ml % 20 glikoz 100 ml Histidin HCl.H2O 10 ml 0.5 mM Biyotin 6 ml (%0.8/0.02 NaOH) Ampisilin 3150 µl
Agar ve su otoklavlandı, 45 C’ye soğutulup % 20 glikoz, 50xVB tuzları ve histidin bu sıcak solüsyona eklenip karıştırıldı ve biraz daha soğuyunca biyotin ve ampisilin eklenip plaklar petrilere 25 ml olarak aktarıldı. Bu plaklarda bakteriler 4 C’de 2 ay saklanabilir.
3.3.11. Top Agar
Kullanım: Mutasyon deneyi
1000 ml
Agar 6 g
NaCl 5 g
Distile su 1000 ml
Agar-su ve tuz manyetik karıştırıcıda ısıtılarak ve karıştırılarak çözüldü ve otoklavda 121 C’de 15 dakika sterilize edildi. Oda sıcaklığında karanlıkta saklanır.
33
3.3.12. Nutrient Agar (NA) Plakları
Kullanım: Gecelik kültürün ml’sindeki bakteri sayısını bulma ve genotip kontrolü (a. Kristal viyole b. UV duyarlılığı)
1000 ml Oxoid nutrient broth no:2 25 g
Agar 15 g
Distile su 1000 ml
Agar, broth ve su 2 litrelik kapta karıştırılıp 121 C’de 15 dakika sterilize edilir ve petri kutularına 30 ml olacak şekilde aktarılır. +4C’de saklandı.
3.3.13. Nutrient Broth (NB) Sıvı Kültür Ortamı
Kullanım: Bakterilerin gecelik kültürde büyütülmeleri. 200 ml Oxoid nutrient broth no:2 5 gr
Distile su 200 ml
Broth ve su karıştırılıp otoklavda 121 C’de 15 dakika sterilize edildi. Oda sıcaklığında karanlıkta saklandı.
3.3.14. (2 g/l) 4- Nitro-o-Fenilendiamin
Kullanım: Pozitif kontrol
200 g/petri olmak üzere DMSO (Dimetilsülfoksit)’da çözülerek kullanıldı. TA 98 suşu için S9 (metabolik aktivasyonu sağlayan rat karaciğeri mikrozomal enzimleri) fraksiyonu gerektirmeyen kimyasaldır.
10 ml
NPD 0,02 g
DMSO 10 ml Oda sıcaklığında saklandı.
34
3.3.15. ( 0.1 g/l) Sodyum Azid Çözeltisi
Kullanım: Pozitif kontrol
1 mg/petri başına olmak üzere distile suda çözülerek kullanıldı. TA 100 suşu için S9 fraksiyonu varlığında ve yokluğunda kullanılan kimyasaldır.
100 ml Sodyum azid 0,01 g
Distile su 100 ml
+4 C’de saklandı.
3.3.16. (%0,1) Kristal Viyole Solüsyonu
Kullanım: Suşların kristal viyoleye duyarlılıkları, dolayısıyla rfa mutasyonunu taşıyıp taşımadıklarının kontrolü.
100 ml
Kristal viyole 0.1 gr
Distile su 100 ml
Kristal viyole ve distile su karıştırıldı ve solüsyon ışık geçirmeyen bir şişede +4 C’de saklandı.
3.4. Örneklerin toplanması ve saklanması
Çalışmada kullanılacak su örnekleri Temmuz-Kasım (2010) ayları arasında beş tane istasyon belirlenerek Yeşilırmak’tan alınmıştır. Su örnekleme istasyonları Behzat deresi girişi, Behzat deresinin Yeşilırmak’a karıştığı nokta, Gümenek, Dimes fabrikası çıkışı, atık çöp yığın merkezi sonrası olmak üzere toplam beş deneme istasyonu olarak planlanmıştır. Örnekler oda sıcaklığında saklanmıştır.
