Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4241

Tam metin

(1)台北醫學大學醫學科學研究所碩士論文 Taipei Medical University Graduate Institute of Medical Sciences Master Thesis. 指導老師：高淑慧博士 (Shu-Huei Kao). 粒線體功能調控顆粒細胞的類固醇荷爾蒙生成對女性生育力的影響. Mitochondrial Function in Human Granulosa Cell Steroidogenesis Modulate Female fertility. 研究生：吳文瀚 (Wen-Han Wu) 中華民國九十七年七月 July, 2008.

(2) 致謝四年的碩士在職班終於畫下了句點，四年的學習過程中，在台北榮總與北醫之間來回奔波，感謝許多的師長與親朋好友在身旁支持與鼓勵，我才能度過此漫長的四年歲月。首先，感謝高淑慧老師於學術與研究上的指導，讓我於生殖醫學方面有更深一層的了解。並感謝趙湘台主任、武國璋主任、曾啟瑞院長與謝榮鴻老師能夠於百忙之中撥冗審查論文，並且給予我論文之指正與建議。感謝我的服務單位－台北榮總生殖醫學中心的張昇平主任、杜來南醫師與李新揚主任協助提供顆粒細胞的來源與研究方向；更感謝我的工作同伴－妙玲姐、雅蘭與宇芳，使我得到工作與課業上許多幫助與支持。在此也特別感謝台北榮總免疫風濕科的廖堂順先生的協助，始能完成顆粒細胞於流式細胞儀的分析。另外，謝謝學校實驗室的學弟妹－鈴婉、彥淳、宜珮、怡蓉、怡娟、安安與大 BB，是我實驗上的小老師，使我實驗能夠順利進行。有人說『一個成功的男人，背後有一個偉大的女人』；至今使我能無後顧之憂，完成學業，要非常感謝遠在屏東的家，我身後的二個女性－我的母親與我的太太，始終給予我無限的支持與鼓勵；在一個月僅回二次家的情況下，發生與『回鄉偶書』中「笑問客從何處來」相同的窘境，被二個可愛的兒子叫「客人爸爸」；但是，由衷的謝謝我的家人；謹以此論文獻給支持與鼓勵我的親朋好友，謝謝你們。. 2008 年 7 月於北醫.

(3) 中文摘要顆粒細胞的功能被認為對卵細胞及胚胎的品質有直接的功能。本論文主旨在探討顆粒細胞粒線體功能對荷爾蒙生成，卵細胞成熟率、受孕力及胚胎品質的影響。我們接受人工生殖療程之患者的顆粒細胞，依照病因區分四大群組，包括子宮內膜異位(endometriosis)、多囊性卵巢症候群(polycystic ovary syndrome；PCOS)、女性其他不孕因素及男性不孕因素等四種分類，並以男性不孕因素的顆粒細胞為對照組。首先，分析患者血清及濾泡液中相關荷爾蒙指數，並測定顆粒細胞存活率、粒線體數量、粒線體膜電位變化。繼而分析與卵細胞數量、胚胎品質(embryo quality)、卵細胞受精率(fertilization rate)及患者懷孕率 (pregnancy rate)之相關性。研究結果顯示雌激素(estradiol；E2)於四種群組中，在子宮內膜異位群組之患者血清中的 E2 含量為對照組之患者的 61%(p=0.001)，尤其於患有巧克力囊腫的婦女其 E2 含量為對照組之 46%(p<0.001) 。子宮內膜異位群組其卵細胞數目為對照組的 65% (p=0.007)；顆粒細胞的細胞凋亡率較高於對照組 15%(p=0.045)、降低的粒線體數量(對照組的 68%，p=0.024)、下降的粒線體膜電位(對照組之 71%，p=0.022)與降低受精率(對照組的 93%，p=0.093)。同樣情況也發現在多囊性卵巢症候群的群組上，包括高於對照組 20%的細胞凋亡率(p=0.037)、粒線體數量的不足(對照組之 72%，p=0.04)及受精率不佳 (對照組之 90%，p=0.019)。我們進而分析與類固醇荷爾蒙有關的生成酵素 steroidogenic acute regulatory (StAR) 及 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD)，我們發現其蛋白含量與 hormone level 有關 (p<0.001)。人類顆粒細胞的粒線體功能障礙，阻礙類固醇荷爾蒙生成，並進而影響卵細胞成熟率、卵細胞受精率以及造成卵細胞品質不良和懷孕能力下降。 I.

(4) Abstract The purpose of this study is to evaluate mitochondrial function in human granulosa cells from infertile patients and examine the relationship between mitochondrial dysfunction and cause of infertility. The specific aims are to clarify the relationship between hormone levels, mitochondrial function, granulosa cells steroidogenesis, fertility capacity and embryo quality. The granulosa cells were obtained from the individuals undergoing IVF-ET treatment. The granulosa cells were classified into four groups: endometriosis, polycystic ovary syndrome (PCOS), other female factor infertility and male factor infertility. The concentration of estradiol (E2) and progesterone were analyzed by radioimmunoassay. Cell viability, mitochondrial mass and mitochondrial membrane potential were detected by flow cytometry with propidium iodide, nonyl acridine orange, and N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, respectively. In addition, the oocyte numbers, oocyte quality, fertilization rate, and pregnancy rate were also recorded. The results showed, the significantly lower serum E2 levels were found in the endometriosis group (61% of the control, p=0.001). The serum E2 level from patients with chocolate cyst was declined to 46% of the control (p<0.001). In emdometriosis group, the numbers of obtained oocyte was decreased to 65% of the control (p=0.007). The cell apoptosis was 15% higher than the control. (p=0.045). Reduced mitochondrial mass (68% of the control，p=0.024), declined mitochondrial membrane potential (71% of the control，p=0.022), and poor fertilization rate (93% of the control, p=0.093) were found in endometriosis group. All of these findings were also demonstrated in the PCOS group, including high apoptosis rate (over 20% of the control, p=0.037), lower mitochondrial mass (72% of the control, p=0.04), and reduced fertilization rate (90% of the control, p=0.019). Moreover, the steroidogenic enzymes, steroidogenic acute II.

(5) regulatory (StAR) and 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) were also measured by Western blot. The enzyme contents of StAR and 3β-HSD were correlated to E2 levels (p<0.001). In conclusion, mitochondrial dysfunction of the human granulosa cells may contribute to the global decline of steroidogenesis, decersed fertilization rate, oocyte maturation rate and oocyte quality, and finally jeopardize fertility capacity.. III.

(6) 目錄中文摘要 ........................................................................................................I Abstract ........................................................................................................ II 目錄 .............................................................................................................IV 圖表目次 ................................................................................................... VII 縮寫表 .........................................................................................................IX 第一章. 緒論 ............................................................................................... 1 一、不孕症治療 ............................................................................. 1 二、顆粒細胞之特性 ..................................................................... 1 1. 顆粒細胞於月經週期之任務 ............................................. 1 2. 顆粒細胞於濾泡成長之任務 ............................................. 2 三、顆粒細胞分泌之荷爾蒙 ......................................................... 3 四、顆粒細胞對卵細胞之調控 ..................................................... 3 五、卵細胞對顆粒細胞之調控 ..................................................... 4 六、顆粒細胞對濾泡之調控 ......................................................... 4 七、顆粒細胞對荷爾蒙之調控 ..................................................... 5 八、粒線體特性 ............................................................................. 5 1. 粒線體 ................................................................................. 5 2. 粒線體與 steroidogenesis ................................................... 6 3. 粒線體膜電位與 steroidogenesis ....................................... 6 九、顆粒細胞與細胞凋亡 ............................................................. 6 十、子宮內膜異位 ......................................................................... 7 十一、多囊性卵巢症候群 ............................................................. 9 十二、Steroidogenesis.................................................................. 10 1. Steroidogenic acute regulatory (StAR) .............................. 10 IV.

(7) 2. 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) .................... 10 第二章. 研究目標..................................................................................... 14. 第三章. 材料與方法................................................................................. 15 一、藥品材料 ............................................................................... 15 二、顆粒細胞來源 ....................................................................... 17 三、相關荷爾蒙之檢測 ............................................................... 17 四、顆粒細胞之收集 ................................................................... 17 五、顆粒細胞的細胞凋亡分析 ................................................... 18 六、粒線體膜電位分析 ............................................................... 18 七、粒線體數量分析 ................................................................... 19 八、StAR 及 3β-HSD 之定量...................................................... 19 1. 蛋白質定量 ....................................................................... 19 2. 西方墨點法 ....................................................................... 20 九、統計分析方法 ....................................................................... 20. 第四章. 實驗結果..................................................................................... 21 一、各組之血液中荷爾蒙的差異 ............................................... 21 1. Estradiol (E2)...................................................................... 21 2. Luteinizing hormone (LH) ................................................. 21 3. Progesterone (P4) ............................................................... 22 二、各組之濾泡液中荷爾蒙的差異 ........................................... 22 三、各組之濾泡數、取卵數與成熟卵細胞數的比較............... 23 四、顆粒細胞內之粒線體功能分析 ........................................... 24 1. 粒線體膜電位(membrane potential) ................................ 24 2、粒線體數量(mitochondrial mass) .................................... 24 五、顆粒細胞存活率及細胞凋亡之分析................................... 25 1. 存活率 (viability) ............................................................. 25 V.

(8) 2. 細胞凋亡 (apoptosis) ....................................................... 25 六、顆粒細胞內荷爾蒙生成酵素(steroidogenic enzyme)分析 . 26 1. 荷爾蒙生成酵素(StAR 與 3β-HSD) ................................ 26 2. 荷爾蒙生成酵素與粒線體功能 ....................................... 27 七、卵細胞受精率與患者懷孕率之分析................................... 27 1. 受精率 (fertilization rate)................................................. 27 2. 懷孕率 (pregnancy rate)................................................... 27 第五章. 討論 ............................................................................................. 29. 附表及圖 ..................................................................................................... 35 參考文獻 ..................................................................................................... 71. VI.

(9) 圖表目次. Table 1.各組群組的血清中 E2 含量(pg/mL) ............................................ 36 Table 2.各組群組的血清中 LH 含量(mIU/mL)........................................ 37 Table 3.各組群組的血清中 P4 含量(ng/mL)及經濾泡數校正之相關性 38 Table 4. 各組群組的濾泡液(follicular fluid)中 E2 與 P4 含量(ng/mL).. 39 Table 5. 各組群組的濾泡數、卵細胞數與成熟卵數(Metaphase II) ...... 40 Table 6. 以流式細胞分析儀測定各組的顆粒細胞之粒線體功能.......... 41 Table 7. 以流式細胞分析儀測定各組群組的顆粒細胞之細胞凋亡...... 42 Table 8. 各組的顆粒細胞之類固醇荷爾蒙生成酵素含量分析.............. 43 Table 9. 荷爾蒙生成酵素(StAR)與粒線體功能之相關性 ...................... 44 Table 10. 荷爾蒙生成酵素(3β-HSD)與粒線體功能之相關性................ 45 Table 11. 各組的受精率(fertilization rate)及懷孕率(pregnancy rate) ..... 46 Table 12. 血清中 E2 含量與受精率及懷孕率之相關性 ......................... 47 Figure 1. 各組的血清中 E2 含量(pg/mL) ................................................ 48 Figure 2. 各組的血清中 LH 含量(mIU/mL) ............................................ 49 Figure 3. 各組的血清中 P4 含量(ng/mL)及經濾泡數校正值................. 50 Figure 4. 各組的濾泡液中 E2 及 P4 含量(pg/mL) .................................. 51 Figure 5. 各組的血清內與濾泡液中之 E2 含量(pg/mL)比較 ................ 52 Figure 6. 各組的血清內與濾泡液中之 P4 含量(ng/mL)比較 ................ 53 Figure 7. 各組的濾泡數、卵細胞數與成熟卵數(Metaphase II)之比較 54 Figure 8. 各組血清中的 E2 分別經濾泡數校正後之比較...................... 55 Figure 9. 各組粒線體膜電位功能之比較 ................................................ 56 Figure 10. 粒線體膜電位功能與血清中 E2 含量之相關........................ 57 Figure 11. 粒線體 mass(NAO)之比較 ...................................................... 58 VII.

(10) Figure 12. 粒線體 mass(NAO)與血清中 E2 含量之相關 ....................... 59 Figure 13. 粒線體 mass(MitoTraker Red)之比較..................................... 60 Figure 14. 粒線體 mass(MitoTraker Red)與血清中 E2 含量之相關 ...... 61 Figure 15. 各組群組的顆粒細胞染色分析 .............................................. 62 Figure 16. 各組的顆粒細胞存活率與血清中 E2 含量之比較................ 63 Figure 17. 顆粒細胞存活率(Viability)與血清中 E2 含量之相關 ........... 64 Figure 18. 顆粒細胞的細胞凋亡之比較 .................................................. 65 Figure 19. 顆粒細胞的細胞凋亡與血清中 E2 含量之相關.................... 66 Figure 20. 荷爾蒙生成酵素之比較 .......................................................... 67 Figure 21. 顆粒細胞的荷爾蒙生成酵素與血清中 E2 含量之相關........ 68 Figure 22. 顆粒細胞的荷爾蒙生成酵素與血清中 P4 含量之相關........ 69 Figure 23. 各組的卵細胞受精率與患者懷孕率之比較 .......................... 70. VIII.

(11) 縮寫表 ΔΨm. Membrane potential. 3β-HSD. 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase. ARA54. Androgen receptor-associated protein 54. ARA55. Androgen receptor-associated protein 55. ARA70. Androgen receptor-associated protein 70. ATP. Adenosine triphosphate. BMP15. Bone morphogenetic protein-15. COC. Cumulus-oocyte-complex. DHEA. Dehydroepiandrosterone. E2. Estradiol. EGF. Epidermal growth factor. FGF. Fibroblast growth factor. FSH. Follicle-stimulating hormone. GDF-9. Growth/differentiation factor-9. GnRHa. Gonadotropin-releasing hormone agonists. HCG. Human chorionic gonadotropin. IGF-1. Insulin-like growth factor-1. IL-6. Interleukin-6. INF-α. Interferon alpha. LH. Luteinizing hormone. IVF. In-vitro fertilization. IUI. Intra-uterine insemination. MFI. Mean fluorescence intensity. NAO. Nonyl acridine orange. OHSS. Ovarian hyperstimulation syndrome. P4. Progesterone. P450scc. Cholesterol side-chain cleavage cytochrome P450 IX.

(12) P450c17. 17α-hydroxylase/ C17-20 lyase cytochrome P450. P450arom. Aromatase cytochrome P450. PCOS. Polycystic ovary syndrome. PI. Propidium iodide. PI3K. Phosphatidylinositol-3 kinase. RIA. Radioimmunoassay. StAR. Steroidogenic acute regulatory. TGF-α. Transforming growth factor - alpha. TGF-β. Transforming growth factor - beta. TMRE. N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine. TNF-α. Tumor necrosis factor - α. VEGF. Vascular endothelial growth factor. X.

(13) 第一章. 緒論. 一、不孕症治療接受人工生殖治療之不孕症患者，施行方式主要有人工授精 (Intra-uterine insemination；IUI)及試管嬰兒(In-vitro fertilization ； IVF)。自 1978 年 7 月 25 日全世界第一個試管嬰兒在英國誕生，1985 年國內第一個試管嬰兒在台北榮總誕生，根據美國不孕症醫學會公佈的 1995 年全美不孕症治療資料顯示，植入一次胚胎（約 3~4 個胚胎）的成功率約達 23%(Chapko et al., 1995)。國內較具規模的不孕症中心做試管嬰兒的成功率則為 25~40%左右。試管嬰兒的發展至今已經有二、三十年，懷孕成功率並無大幅度的進步，影響的原因有許多，從藥物刺激排卵、取卵手術、精細胞與卵細胞結合、胚胎培養發育到胚胎植入、子宮內黃體支持等，部分的生殖技術已經慢慢克服，例如刺激排卵藥物改善其純度、腹腔鏡取卵進步到陰道超音波引導取卵、單一精蟲卵質注入克服男性不孕問題及囊胚期胚胎培養與植入等技術的更新及改善；最終的目的是讓患者能夠懷孕。但是一切的努力，最主要的重點還是在要有一個品質良好的卵細胞。卵細胞的成長受到周遭的影響，牽涉許多因素。目前臨床上在接受試管嬰兒療程中，刺激卵細胞成長過程中，為了解卵細胞成長狀況，僅能憑藉血液中荷爾蒙濃度及濾泡的大小，去推斷卵細胞成熟度(Kerin et al., 1984)，而血液中荷爾蒙濃度及濾泡的大小有其相關性(Casper et al., 1987)。二、顆粒細胞之特性 1. 顆粒細胞於月經週期之任務卵巢中的顆粒細胞具有重要生理意義，顆粒細胞位於卵巢基底膜(basal lamina)之內側，在卵巢中是屬於特有的內分泌細胞(王馨世, 1998)。在具有生殖能力之女性的卵巢中，因應每個月的排 ~1~.

(14) 卵週期，濾泡逐漸成長成熟中，顆粒細胞會開始增生以達到足夠的細胞數量及分泌功能之完整性。為了使濾泡中的卵細胞能夠成熟，顆粒細胞分泌出大量的雌激素(estradiol；E2)(Gilula et al., 1978)，E2 經由回饋控制下視丘(hypothalamus)與腦下垂體(pituitary) 分泌濾泡刺激素(follicle-stimulating hormone；FSH)與黃體激素 (luteinizing hormone；LH)，進而控制濾泡成長與卵細胞成熟。於卵巢排卵之後，顆粒細胞改變其形態與功能，變化成為黃體細胞，而黃體細胞的主要功能則是分泌黃體素(progesterone；P4)，以幫助卵細胞於受精後的著床。若受精卵著床成功，則黃體細胞會更進一步成為黃體(luteum)，持續分泌黃體素，以維持懷孕狀態的穩定性但若受精卵沒有著床成功，而黃體細胞則會自行分解 (luteolysis)(E.Y., 1991) 。下視丘及腦下垂體經由下視丘 (hypothalamus)-腦下垂體(pituitary)-卵巢(ovary)機轉去調控卵巢中濾泡成長，由腦下垂體分泌 FSH 及 LH 去刺激卵巢內的顆粒細胞，顆粒細胞受到刺激而分泌出 E2，E2 進而推動濾泡成長及負回饋控制下視丘及腦下垂體的分泌，因此顆粒細胞在下視丘 (hypothalamus)-腦下垂體(pituitary)-卵巢(ovary)軸的調節中佔有舉足輕重的地位(SSC, 1991; Vande Wiele et al., 1970)。 2. 顆粒細胞於濾泡成長之任務在原始期濾泡(primordial follicle)中，卵細胞僅被覆單一層顆粒細胞，此時濾泡成長尚未由顆粒細胞所控制。而在前腔室期濾泡(preantral follicle)中，卵細胞被多層顆粒細胞及膜細胞所包圍，並且顆粒細胞對腦下垂體所分泌的 FSH 及 LH 有反應，開始進行荷爾蒙之合成與分泌(Adashi, 1991; 王馨世, 1998)。於腔室期濾泡 (antral follicle)，濾泡在 FSH 之作用下，開始進行主濾泡(dominant. ~2~.

(15) follicle)的選擇。主濾泡內的顆粒細胞則因 FSH 及 E2 共同作用下引發 LH 的受體(receptor)的表現，繼續持續分泌大量之 E2，經正回饋機轉刺激腦下垂體大量釋放出 LH，促使卵細胞成熟與排卵。其他濾泡因在 FSH 不足及顆粒細胞分泌 E2 量不夠，使得其內部的顆粒細胞無法增生，便逐漸萎縮掉，而在 LH 作用下加速非主濾泡的萎縮過程，且非主濾泡其中的顆粒細胞亦加速死亡(Adashi, 1991; Speroff et al., 1994)。三、顆粒細胞分泌之荷爾蒙女性體內生殖系統中荷爾蒙的產生是由腦下垂體分泌 LH 去刺激膜細胞 (theca cells) 將膽固醇 (cholesterol) 經由 steroidogenic acute regulatory protein(StAR) 的作用將 cholesterol 送入粒線體，再經由 cholesterol side-chain cleavage cytochrome P450(P450scc)轉變成孕烯醇酮 (pregnenolone) ，再經 17α-hydroxylase/ C17-20 lyase cytochrome P450(P450c17)轉為去氫皮質酮(dehydroepiandrosterone；DHEA)，去氫皮質酮再經 3β-hydroxysteroid dehydrogenase(3β-HSD)變成雄烯二酮 (androstenedione) ，雄烯二酮由膜細胞經基底膜傳送至顆粒細胞 (Havelock et al., 2004)，顆粒細胞經 FSH 刺激調控再將雄烯二酮經 aromatase cytochrome P450(P450arom)轉成睪固酮(testosterone)，最後變成 E2(Harlow et al., 2007)。另外，顆粒細胞也接受到 LH 調控而產生 P4(Dain et al., 1991)。四、顆粒細胞對卵細胞之調控顆粒細胞與卵細胞相互依存的特性，表現於卵細胞後續的發展。在濾泡成長的過程中，顆粒細胞分成二個群組，內層的顆粒細胞發展成 cumulus cells ，與卵細胞形成複合體 (cumulus-oocyte-complex ； COC)，而外層的顆粒細胞形成 mural granulosa cells，與 theca cells 連. ~3~.

(16) 結(Areekijseree and Vejaratpimol, 2006; Buccione et al., 1990)。顆粒細胞圍繞在卵細胞的周圍，利用細胞間的間隙連結(gap junction)提供卵細胞基本的養份與成長的調控(Cecconi et al., 1996; Rotmensch et al., 1986)。顆粒細胞利用細胞間隙連結(gap junction)傳遞 cAMP 訊息使原本停滯在第一前期(prophase I)的卵細胞繼續進行減數分裂(meiosis)(Buccione et al., 1990)。卵細胞成長時，皆由圍繞在其周圍之顆粒細胞提供能量、氨基酸及核苷酸，給予卵細胞需要的基本代謝(Brower and Schultz, 1982; Buccione et al., 1990)。五、卵細胞對顆粒細胞之調控卵細胞可分泌多種因子幫助顆粒細胞分化及增生 (Russell and Robker, 2007; Wen et al., 2007)，例如 epidermal growth factor(EGF)、 insulin-like growth factor-1(IGF-1)、transforming growth factor -alpha 與 -beta(TGF-α,-β)(Best et al., 1994)及 fibroblast growth factor(FGF)等刺激顆粒細胞增生及 steroidogenesis(Amsterdam et al., 2003; Guerrero et al., 1993)。此外，growth/differentiation factor-9(GDF-9)是屬於 TGF-β 家族之一，表現在卵細胞上(Lanuza et al., 1998; McGrath et al., 1995)，當 GDF-9 缺乏時，會使濾泡成長停止(Dong et al., 1996; Thomas and Vanderhyden, 2006)，即卵細胞利用降低 GDF-9 及提升 Nodal、ALK7 的表現進而抑制 phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)/AKT pathway 使得顆粒細胞 apoptosis，進一步造成濾泡停止成長(Craig et al., 2007; Webb and Campbell, 2007)。卵細胞亦利用 GDF-9 及 bone morphogenetic protein-15(BMP15) 調控排卵時顆粒細胞的作用 (Assou et al., 2006; Gilchrist et al., 2004)。六、顆粒細胞對濾泡之調控顆粒細胞除了與卵細胞之間的交互作用外，另外調控著濾泡之成. ~4~.

(17) 長，如 integrin α6 表現在顆粒細胞上，調控濾泡成長(Fujiwara et al., 1996)。當在不同時期的濾泡成長中，顆粒細胞會有不同之荷爾蒙表現，以影響其濾泡成長 (Bomsel-Helmreich et al., 1979; Fujiwara et al., 1993)。當顆粒細胞受到 FSH 及 LH 刺激時，利用卵細胞的 PI3K pathway 調控卵細胞的成長及濾泡發展(Liu et al., 2006)；當濾泡萎縮(atresia) 時，顆粒細胞之內分泌由 estradiol-rich 狀態變為 androgen-rich 狀態，並減少 P4 的生產量，進而走向細胞凋亡的路徑(McNatty et al., 1979)。七、顆粒細胞對荷爾蒙之調控顆粒細胞可以合成及分泌 E2、P4 等荷爾蒙(Kunz et al., 2006)，產生荷爾蒙的調控受到許多因素影響，例如 androgen receptor-associated protein 54(ARA54)、ARA55 及 ARA70 影響 E2 的生成(Chang et al., 2005)，當 DHEA 上升時，亦大量產生 E2(Bonser et al., 2000)，interferon alpha (INF-α)抑制 P4 產生(Best et al., 1995; Hill et al., 1990)。八、粒線體特性 1. 粒線體粒線體於結構上有兩個功能不同的膜，包括外膜 (outer membrane)和內膜(inner membrane)。外膜完整包圍胞器，與細胞膜成份一致。而內膜具有很多向內的皺褶，稱爲「嵴」(cristae)。嵴上面有很多用於有氧呼吸和製造腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate；ATP)的結構，這些折疊可以增加粒線體內膜的表面積以增強其效率。內膜又將粒線體其分成兩個部分，內膜之內的部分稱爲「基質」(matrix)，而內外膜之間的部分稱爲「膜間腔」 (intermembrane space)。通常一個細胞中有數量上千的粒線體。一般細胞中粒線體的數目取決於細胞的代謝，代謝越旺盛，粒線體越多。粒線體可看作是「細胞能量工廠」，因其主要功能是將有. ~5~.

(18) 機物氧化產生的能量轉化爲腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)。粒線體的內外膜均由磷脂雙層(phospholipids bilayers)與蛋白質組成(Alberts, 2002)，然而這兩層膜具有很不同的特性。粒線體的首要功能是分解有機物，產生能量，但粒線體還有許多的功能。如：膜電位的調節、細胞凋亡、調控細胞的增生、細胞氧化還原的調節、膽固醇合成。 2. 粒線體與 steroidogenesis E2經FSH與LH刺激，控制濾泡成長與卵細胞成熟(Gilchrist et al., 2004; Mehlmann, 2005)，而顆粒細胞形成荷爾蒙的能力被認為受到細胞內粒線體功能的影響，在形成類固醇荷爾蒙的 steroidogenesis 關鍵步驟是在粒線體中進行 (Seifer et al., 2002; Yamashita et al., 2007)。因為steroidogenesis的第一步驟就是由StAR 將膽固醇送到粒線體中經由P450scc轉變成孕烯醇酮(Seifer et al., 2002)。 3. 粒線體膜電位與steroidogenesis 當粒線體膜電位變化時，使得膜的離子通透性改變，研究文獻提出在男性睪丸的leydig cells之粒線體，當其膜電位下降時， StAR protein減少，P4產生量降低(Levine et al., 2007)。另外，若細胞內加入電子傳遞抑制劑(electron transport inhibitor)或F0/F1 ATP inhibitor，皆會造成細胞內粒線體的ATP減少及StAR protein表現降低，進而抑制P4產量及steroidogenesis(Hales et al., 2005)。九、顆粒細胞與細胞凋亡在其他研究中發現，在卵巢中為了要維持卵細胞一定之數量與品質及細胞能夠正常運作及存活，顆粒細胞進行程序死亡或稱細胞凋亡，是一種極為重要的調節(Duerrschmidt et al., 2006; Idil et al., 2004)。. ~6~.

(19) 於濾泡成長與發展時，為了在每一次週期中，篩選出最優良的一顆卵細胞，而形成主濾泡。主濾泡內之顆粒細胞因受 FSH 之作用而增生，主濾泡亦逐漸長大，分泌更多的 E2，而負回饋抑制 FSH 生成，使得其他的濾泡萎縮，因此約有 99%的濾泡會發生萎縮(atrophy)。萎縮的主因是由顆粒細胞無法得到 FSH 而發生的細胞凋亡(Hughes and Gorospe, 1991; Kaipia and Hsueh, 1997)。細胞凋亡是一種細胞自己程序死亡的方式，其中包括形態上與生物化學上的特性(Chinnaiyan, 1999)。於形態上的改變包括染色質的濃縮、於細胞表面出現細胞質的窿凸及細胞膜破裂釋放出許多小體(稱為細胞凋亡小體)。進而引發細胞內凋亡小體產生，需要經由許多訊息傳遞路徑。而在細胞凋亡中有許多訊息傳遞路徑，粒線體的訊息路徑也是在細胞凋亡中的一條重要路徑，例如利用 tumor necrosis factor α (TNF-α)、cytochrome c 的調控(Makino et al., 2005; Montgomery Rice et al., 1998)、活化 caspase cascade 而進行細胞凋亡(Izawa et al., 1998; Tsai et al., 2005)，而粒線體的膜電位改變，進一步造成細胞凋亡(Krysko et al., 2001)。研究指出顆粒細胞內的粒線體基因(mitochondrial genome)若是有斷損突變(deletions)，例如 mtDNA 4977bp -deletion，其顆粒細胞 apoptosis 比例會增加(Seifer et al., 2002)。因此可以得知於顆粒細胞內的粒線體在控制的細胞凋亡上扮演重要角色(Amsterdam et al., 2003; Choi et al., 2004)。此外，顆粒細胞內粒線體基因表現，影響顆粒細胞本身產生的荷爾蒙能力，進而影響卵細胞之品質 (Hosokawa et al., 1998; Yamashita et al., 2007)。十、子宮內膜異位子宮內膜異位是指子宮內膜細胞移至骨盆腔生長，產生不正常的症狀。這種異常的生長細胞在月經週期中受到卵巢荷爾蒙的刺激，會. ~7~.

(20) 出現與正常子宮內膜細胞相同的週期性變化(Farquhar, 2007)。可能是月經週期中由 E2 刺激內膜細胞生長，進而造成血管生成(angiogenesis)及淋巴管生成 (lymphangiogenesis) ，造就了子宮內膜異位發展的環境 (Nisolle et al., 2007)。子宮內膜異位一般常發生在骨盆腔包括卵巢、骨盆腔腹膜上、子宮薦骨韌帶、道格拉斯凹陷(即為腸子下段陰道及直腸陰道間壁)。在子宮內膜異位細胞異位生長處常有黏連情形，因此造成骨盆器官的功能異常或障礙；一般發生的症狀包括經痛、性交困難、非週期性骨盆腔痛及不孕症(Garrido et al., 2000)。一般約有 2~50%的婦女無明顯症狀，必須要靠臨床診斷，在統計上發現約有 40~60%的婦女有經痛及 20~30%有不孕的問題(Alcazar et al., 1997; Fauconnier and Chapron, 2005)。另外，子宮內膜異位症亦引發的其他與生育相關問題，例如：改變濾泡成長(Tummon et al., 1988)、排卵功能失常(Dmowski et al., 1986)、高泌乳素血症(hyperpolactinaemia)(Muse et al., 1982)、黃體期缺陷(Grant, 1966)、受精率的降低(Mahadevan et al., 1983; Wardle et al., 1986)、胚胎發育受阻(Damewood et al., 1990)、降低著床機會(Arici et al., 1996; O'Shea et al., 1985)等。目前真正發生子宮內膜異位的原因仍未明，最為大家接受的原因可能是經血逆流，子宮收縮或輸卵管逆向蠕動而將內膜組織經輸卵管送入腹腔中有關。另外，有研究統計報告懷疑發生機會與年齡亦有相關性，一般好發生於 40 歲左右(kinkel and brosens, 2006)。因子宮內膜異位所造成的因素而影響到卵巢的功能，濾泡內的顆粒細胞亦受到影響，無法完整的施行其細胞功能，亦使得卵細胞發育出現問題(Farquhar, 2007)。當患有子宮內膜異位時，在排卵前 LH surge 前後，其血液中 LH 及 E2 的含量較一般正常人低(Tummon et al., 1988)。子宮內膜異位患者其 P4 及 interleukin-6 (IL-6)皆較高，vascular endothelial growth. ~8~.

(21) factor (VEGF)下降，使得停滯成長的胚胎比例增加，進而降低著床率 (Garrido et al., 2000)。十一、多囊性卵巢症候群於 1935 年由 Stein 與 Leventhal 發表若干女性具有無經 (amenorrhea)、多毛(hirsutism)、肥胖(obesity)及多囊性(polycystic)，即歸類罹患多囊性卵巢症候群(polycystic ovary syndrome；PCOS)，此類患者長久不治療的話，會造成許多其它衍生出的問題，包括不孕、代謝及心血管疾病的問題(Ehrmann, 2005)。一般多囊性卵巢症候群的患者，有 30%有體重超過問題(Azziz et al., 2001)，30%到 40%的患者對於葡萄糖耐受性(glucose tolerance)有缺損的現象，產生 insulin-resistance，約有 10%會有第 2 型的糖尿病(Type 2 DM)(Legro et al., 1999)。於 1990 年對於多囊性卵巢症候群的診斷訂定出了一個標準，指出多囊性卵巢症候群是一種內分泌的疾病，於 2003 年增加內容為更加完善的診斷 (ASRM, 2004)。多囊性卵巢症候群在生理方面的表現有四種假說，一種為 LH 假說，當內分泌失調，造成 LH 釋放頻率增加，使得無排卵及高雄性素(Matalliotakis et al., 2006)。一種為 insulin 假說，insulin resistant ，造成 hyperinsulinemia ，使得雄性素釋放增加及無排卵 (Matalliotakis et al., 2006)。第三為 ovarian 假說，性荷爾蒙合成或代謝異常，使得雄性素釋放增加及無排卵(Matalliotakis et al., 2006)。第四種為 FSH 假說，因多囊性卵巢使得 FSH 之作用，讓雄性素與雌激素轉變率減少，使得雄性素增加及無排卵(Matalliotakis et al., 2006)。在不孕的問題方面，罹患多囊性卵巢症候群的婦女卵巢表徵為有許多很小且具有粗膜的濾泡存在於卵巢內，當要排卵時卵巢卻發生閉鎖的現象，這些小的濾泡不繼續發展成為成熟的濾泡，而小濾泡內的顆粒細胞之數量也較一般正常的濾泡內顆粒細胞少(Magoffin, 2006;. ~9~.

(22) Matalliotakis et al., 2006)。因此在多囊性卵巢症候群患者的顆粒細胞多為異常的增生與分化，相對的引發產生更多的不正常量的雄性素 (androgen)去刺激顆粒細胞(Magoffin, 2006; Matalliotakis et al., 2006)，因而使得 LH 相對的也比較高，促使卵細胞提早老化，顆粒細胞亦會走向細胞凋亡之路徑，並且容易造成人工生殖技術所引發之卵巢刺激過度症候群(ovarian hyperstimulation syndrome；OHSS)，降低患者懷孕之機率(Matalliotakis et al., 2006; Stanek et al., 2007)。另外於多囊性卵巢症候群的女性，其 3β-HSD 基因表現降低，造成 P4 的產生量亦減少(Doldi et al., 2000)。十二、Steroidogenesis 1. Steroidogenic acute regulatory (StAR) 所有的類固醇合成的第一步驟為膽固醇從粒線體外膜移送到內膜，經由 P450scc 作用而形成 P4 。但是粒線體的膜間腔 (intermembrane space)為水性狀態，無法使脂溶性的膽固醇通過，必須要有輸送蛋白協助膽固醇移送的工作，已知有許多蛋白幫助完成工作(Kallen et al., 1998; Miller, 2007)，例如：sterol carrier protein. 2 、 steroidogenic. activator. polypeptide 、 peripheral. benzodiazepine receptor(PBR) 及 steroidogenic acute regulatory (StAR)。如今，明確的知道 StAR 與 PBR 讓氯離子移動使粒線體的內外膜靠近在一起，再讓膽固醇通過。因此現在已知 StAR 能快速的使粒線體產生類固醇荷爾蒙(Christenson and Strauss, 2000, 2001)。 2. 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) 3β-HSD 為短鏈酒精去氫酶還原酵素家族(SDR；short-chain alcohol dehydrogenase/reductase superfamily)之一(Penning, 1997)，與 cytochrome P450 家族相同皆是產生類固醇荷爾蒙，3β-HSD 和 ~ 10 ~.

(23) P450 酵素差異，為 P450 是單一基因產生，而 3β-HSD 是不同基因產生，因為 3β-HSD 具有許多個 isoform(Payne and Hales, 2004)； 3β-HSD 為細胞膜之結合酵素(membrane-bound enzymes)，也存在於粒線體膜上(Simard et al., 1996)。在人類細胞內有二種 isoform，區分為 type 1 及 type 2，type 1 存在於胎盤、乳癌、其他周邊組織， type 2 存在於性腺及腎上腺(Thomas et al., 2004)。3β-HSD 之任務為將去氫皮質酮(DEHA)轉換成雄烯二酮(androstenedione)及將孕烯醇酮(pregnenolone)轉換成 P4(Thomas et al., 1989)。於顆粒細胞內有多種方式調控 3β-HSD，Prolactin 可降低 3β-HSD mRNA 表現，進而 luteolysis；另外，若 cAMP 增加，會加強 3β-HSD mRNA 表現(Chedrese et al., 1990; Penning, 1997)。. ~ 11 ~.

(24) 第二章. 研究目標. 不孕症患者於施行人工生殖技術之試管嬰兒過程中，所抽取出的濾泡液中內含有卵細胞及豐富且圍繞在卵細胞周圍的顆粒細胞 (Neubourg et al., 1996)，本研究主旨觀察顆粒細胞所分泌出的荷爾蒙對卵細胞品質與受精的影響。顆粒細胞可以合成及分泌荷爾蒙，其中 E2 在卵細胞成熟過程中佔有重要的角色。E2 經由回饋控制下視丘與腦下垂體進而調控分泌 FSH 與 LH，進而控制濾泡成長與卵細胞成熟 (Gilchrist et al., 2004; Mehlmann, 2005)。而顆粒細胞形成荷爾蒙的能力被認為受到細胞內粒線體功能的影響，在形成類固醇荷爾蒙的 steroidogenesis 關鍵步驟是在粒線體中進行 (Seifer et al., 2002; Yamashita et al., 2007)。因此，我們推測顆粒細胞的粒線體功能缺損將影響顆粒細胞的功能，進而影響 E2 的合成及分泌，並且進一步影響卵細胞品質及後續發展的能力。進一步推測顆粒細胞在不孕症患者中扮演的角色重要性，探究多囊性卵巢症候群、子宮內膜異位或其他女性不孕因素所造成的顆粒細胞其細胞功能的不足進而使得卵細胞不成熟甚至不生長，因而造成不孕之因素。並經由四組患者的互相比較，了解卵巢中顆粒細胞中粒線體功能的生理角色。. ~ 14 ~.

(25) 第三章. 材料與方法. 一、藥品材料藥品名 Acrylamide Anti-goat IgG-HRP Anti-rabbit IgG-FITC Anti-rabbit IgG-HRP Apotinin. 廠牌 Fluka RDH. 產地 Saint Louis, Missouti, United States. Santa Cruz biotechnology Beckman coulter Santa Cruz biotechnology. Miami, United States. Sigma. Saint Louis, Missouti, United States. California, United States. California, United States. Ammonium persulphate Amersham Pharmacia Giles, United Kingdom (APS) Biotech (GE Healthcare) Phillipsburg, NJ, United β-glycerophosphate Mallinckrodt Baker States Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, Bio-Rad protein assay Hercules United States Enhanced PerkinElmer Life Waltham, MA, United chemiluminescence Sciences States (ECL) Flushing medium MediCult Jyllinge, Denmark FSH (Gonal-F) Serono Darmstadt, Germany Goat anti-human Santa Cruz California, United States 3β-HSD antibody biotechnology Saint Louis, Missouti, Histopaque 1077 Sigma United States Roseland, NJ, United HCG (Pregnyl) Organon States Saint Louis, Missouti, Leupeptin Sigma United States Molecular probes, Carlsbad, CA, United MitoTraker Red Invitrogen States Phillipsburg, NJ, United MgCl2 Mallinckrodt Baker States Solon, Ohio, United NaCl Amresco States ~ 15 ~.

(26) 藥品名. 廠牌. 產地 Saint Louis, Missouti, United States. NaF. Fluka RDH. Nonyl acridine orange (NAO). Molecular probes, Invitrogen. Carlsbad, CA, United States. PBS. Gibco. Carlsbad, CA, United States. GE Healthcare, life sciences. Giles, United Kingdom. PVDF membrane (Polyvinylidene fluoride) Phenyl-methanesulfonyl fluoride (PMSF) Rabbit anti-FSH Receptor antibody Rabbit anti-Human StAR antibody RIA CA125 analysis Kit. Sigma Chemicon，Millipore Abcam. RIA LH analysis Kit RIA P4 analysis Kit Sodium dodecyl sulphate (SDS). Diasorin Diagnostic Products Corporation (DPC) CIS Bio International CIS Bio International Amersham Pharmacia Biotech (GE Healthcare). Sodium orthovanadate. Sigma. RIA E2 analysis Kit. N,N,N’,N’-tetramethyl-e thylenediamine (TEMED) N,N,N',N'-Tetramethylet hyl-enediamine (TMRE). Saint Louis, Missouti, United States Billerica, MA, United States Cambridge, United Kingdom Vercelli, Italy California, United States Belgium, France Belgium, France Giles, United Kingdom Saint Louis, Missouti, United States. Amersham Pharmacia Giles, United Kingdom Biotech (GE Healthcare) Molecular probes， Invitrogen. Tris (pH7.5). USB. Triton X-100. Sigma. Vibrant apoptosis assay Molecular probes， kit Invitrogen. ~ 16 ~. Carlsbad, CA, United States Cleveland, Ohio, United States Saint Louis, Missouti, United States Carlsbad, CA, United States.

(27) 二、顆粒細胞來源標本來自於台北榮民總醫院婦產部生殖醫學中心接受不孕症治療的患者，區分四大群組，包括子宮內膜異位症、多囊性卵巢症候群、女性其他不孕因素（包括骨盆腔發炎沾粘、輸卵管阻塞或不明原因等）及男性不孕因素等四種分組，患者皆接受人工生殖技術之刺激排卵的療程，使用性腺激素釋放素類似物(Gonadotropin-releasing hormone agonists；GnRHa) (Leuprolide，Takeda，Osaka, Japan)與 FSH(Gonal-F， Serono，Darmstadt, Germany)促使刺激濾泡成長，一萬單位之人類絨毛膜激素(Human chorionic gonadotropin；HCG) (Pregnyl，Oganon，NJ, States)刺激排卵。於 36 小時後經由陰道超音波的引導下，抽取卵巢上之濾泡內的濾泡液，並使用濾泡沖洗液(Flushing medium，MediCult， Jyllinge, Denmark)沖洗濾泡，每一位患者的濾泡液及濾泡沖洗液皆各別收集。三、相關荷爾蒙之檢測於人工生殖技術之刺激排卵的療程中，需要有一些監測，以確保對患者刺激排卵之反應過程是否在進行中，在月經週期之第 8 日及第 10 日分別使用超音波測量出卵巢上之濾泡的大小與數量，並抽取患者血液，使用 radioimmunoassay(RIA)(Packard Cobra II Gamma Counter， Minnesota, States)分析患者體內血清中 E2 與 LH 的濃度，與濾泡的大小與數量做比對；在 HCG 注射前十分鐘與 HCG 注射後十二小時抽取患者血液，並於取卵手術前十分鐘抽取血液，使用 RIA 分析血清中 E2、 LH 與 P4 的濃度。並另外於取卵手術中，抽取其濾泡液，亦分析其濾泡液中 E2 及 P4 之濃度。四、顆粒細胞之收集每一位患者之濾泡液保留放置於 50.0 ml 之尖底離心管收集，於室. ~ 17 ~.

(28) 溫下以 250g 離心 15 分鐘；去除上清液，取離心下之沉澱物，稀釋至 4.0 ml ，使用玻璃滴管將離心沉澱物之懸浮液輕置於 Histopaque 1077(Cat.#10771，Sigma，Missouti, States)上層；室溫下以 400g 離心 30 分鐘；收集介於離心沉澱物之懸浮液與 Histopaque 1077 界面混濁的部分，置於新的 15.0 ml 尖底離心管加入 PBS(Cat.#21300-025，Gibco， CA, States)，稀釋到 10.0 ml；室溫下以 250g 離心 15 分鐘，去除上清液，取離心下之沉澱物，加入 PBS，稀釋到每一 ml 其細胞數量約有 106 個，此懸浮液即為本研究所使用之顆粒細胞。五、顆粒細胞的細胞凋亡分析取顆粒細胞之懸浮液約 0.5 ml，其細胞數量約有 106 個，分別加入 Annexin V 10.0 μl 及 PI 10.0μl (Vibrant apoptosis assay kit-3 ， Cat.#V13242，Molecular probes，CA, States)，於 37℃靜置 30 分鐘；加入 3.0 ml 之 PBS 混合沖洗；室溫下以 250g 離心 15 分鐘，去除上清液即去除多餘之染劑；再加入 1.0 ml 之 PBS；保存於陰暗環境中，直到進行流式細胞分析儀分析。流式細胞分析儀是使用 FACSCalibur（BD Biosciences；NJ, States）；其儀器參數設定為 SSC 探測器電壓：415 Voltage，FL1 探測器電壓：635 Voltage，FL2 探測器電壓：614 Voltage， FL3 探測器電壓：150 Voltage。六、粒線體膜電位分析取顆粒細胞之懸浮液約 0.5 ml 一管，其細胞數量約有 106 個，先加入第一抗體，rabbit anti-FSH receptor antibody 200.0 μl (Cat.#AB9425， Chemicon，MA, States)，於 37℃，靜置 60 分鐘，再加入第二抗體， anti-rabbit IgG(Cat.#732738，Beckman Coulter，Miami, States) (Quinn et al., 2006) 及加 N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine(TMRE) 5.0 μl (Cat.#T669，Molecular probes)，於 37℃，靜置 60 分鐘；加入 3.0 ml. ~ 18 ~.

(29) 之 PBS 混合沖洗；室溫下以 250g 離心 15 分鐘，去除上清液，即去除多餘之染劑；再加入 1.0 ml 之 PBS；保存於陰暗環境中，直到進行流式細胞分析儀分析。流式細胞分析儀是使用 FACSCalibur；其儀器參數設定為 SSC 探測器電壓：415 Voltage，FL1 探測器電壓：635 Voltage， FL2 探測器電壓：614 Voltage，FL3 探測器電壓：150 Voltage。七、粒線體數量分析取 106 個顆粒細胞之懸浮液約 0.5 ml 一管，加入 nonyl acridine orange (NAO) 5.0 μl (Cat.#A1372，Molecular probes)及 MitoTraker Red 10.0 μl (Cat.#M7512，Molecular probes)，於 37℃，靜置 30 分鐘，加入 3.0 ml 之 PBS 混合沖洗；室溫下以 250g 離心 15 分鐘，去除上清液，即去除多餘之染劑。再加入 1.0 ml 之 PBS；進行流式細胞分析儀分析。流式細胞分析儀是使用 FACSCalibur；其儀器參數設定為 SSC 探測器電壓：382 Voltage，FL1 探測器電壓：400 Voltage，FL2 探測器電壓： 500 Voltage，FL3 探測器電壓：150 Voltage。八、StAR 及 3β-HSD 之定量 1. 蛋白質定量取 0.5 ml 之顆粒細胞懸浮液，溶於 5 倍體積之 lysis buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，25 mM NaCl，1 mM MgCl2，25 mM β-glycerophosphate，100 μM PMSF，1% triton，1 μg/ml leupeptin， 1 μg/ml apotinin，50 mM NaF，1 mM sodium orthovanadate )，於 4℃以 20000g 離心，30 分鐘。收取上清液。取出 5μl 蛋白質萃取液，加至 955μl 五倍稀釋之 Bio-Rad protein assay (Cat.#500-0006 ； Bio-Rad Laboratories Inc ， CA, States) ( 即為 Bradford Method)置於比色計以波長 595nm 比色，測出吸光值，. ~ 19 ~.

(30) 並與以 0.2、0.4 及 0.8 mg/ml BSA 製備的標準曲線作比對，以測得蛋白質之濃度。 2. 西方墨點法取已經定好量的 25μg 蛋白質萃取液放入凝膠的孔內；使用 90 至 140 Voltage 、 400 mA 在 10% 及 40% 之 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)進行電泳分析。再將蛋白質轉漬到 PVDF membrane(polyvinylidene fluoride) (Hybond-P；GE Healthcare，Giles, United Kingdom)，利用 250 Voltage、400 mA 進行轉漬，轉漬完成後，將 PVDF membrane 放入 5%的脫脂奶粉的 TBST(Tris base buffer saline) blocking buffer 內作用 60 分鐘，分別加入 rabbit anti-human StAR antibody(Cat.#AB3343，Abcam， Cambridge, United Kingdom)及 goat anti-human 3β-HSD antibody (Cat.#SC-30821，Santa Cruz biotechnology Inc，CA, States)之第一抗體，於 4℃、作用 overnight；以 TBST 清洗多餘之第一抗體，再加入第二抗體 anti-rabbit IgG-HRP 及 anti-goat IgG-HRP (Cat.#SC-2020，Santa Cruz biotechnology, Inc)作用 1 小時，再以 TBST 清洗多餘之第二抗體，最後以 enhanced chemiluminescence (ECL) (Cat.#NEL105，PerkinElmer Life Sciences, Inc，MA, States) 作用 3 分鐘，偵測底片上冷光所呈現之訊號。九、統計分析方法所有實驗數據皆以 mean ± SEM(standard error of the mean)表示，數據的統計分析分別使用 student’s T-test 與 Chi-square test，當 p 值小於 0.05，即表示數據具有統計上顯著性差異。. ~ 20 ~.

(31) 第四章. 實驗結果. 一、各組之血液中荷爾蒙的差異 1. Estradiol (E2) 不同病因的不孕症患者血液中荷爾蒙之含量，發現 E2 的濃度在 HCG 注射前與注射後的比較，大多數為往上提昇的狀況(Fig. 1)，在子宮內膜異位的患者，其 E2 上昇的比率較小約為 1.2% (1354.07±109.99 vs 1370.39±146.02)，其他女性不孕因素組上升 7% (1404.48±106.02 vs 1524.16±124.13)，多囊性卵巢症候群組提昇 10% (1889.04±166.69 vs 2053.23±190.32) (Table 1)。子宮內膜異位的群組的 E2 濃度僅有以男性因素為對照組之 61% (1354.07±109.99 vs 2212.72±219.26，p=0.001)，進一步將子宮內膜異位的患者細分成二個小群組，包括具有巧克力囊腫的子宮內膜異位及不具有巧克力囊腫的子宮內膜異位，實驗發現具有巧克力囊腫的子宮內膜異位其 E2 僅為對照組的 46% (1015.88±127.72 vs 2212.72±219.26，p<0.001)，不具有巧克力囊腫的子宮內膜異位組 E2 為對照組之 65% (1449.00±134.01 vs 1471.74±175.41 ， p=0.011)。此二群組與對照組做統計運算比對，亦發現具有顯著性差異 (p<0.05)。另外對於取卵手術前所抽取的血清中 E2 含量進行分析，發現具有巧克力囊腫的子宮內膜異位群組，其 E2 亦顯著降低，僅對照組之 49% (483.83±142.35 vs 977.86±105.25，p<0.001)。 2. Luteinizing hormone (LH) 血清中 LH 含量在注射 HCG 前後之比較，子宮內膜異位的患者，其 LH 上昇 10% (3.33±0.36 vs 3.66±1.03)，其他女性不孕因素組上升 47% (2.90±0.44 vs 4.25±0.87)，多囊性卵巢症候群組下降 23% (2.10±0.30 vs 1.62±0.29) (Fig. 2)。於注射 HCG 前，LH 的含量 ~ 21 ~.

(32) 表現於子宮內膜異位的患者，為對照組的 69% (3.33±0.36 vs 4.77±1.54 ， p=0.186) ，其他女性不孕因素組為對照組的 60% (2.90±0.44 vs 4.77±1.54，p=0.126)，多囊性卵巢症候群組僅 44% (2.10±0.30 vs 4.77±1.54，p=0.049) (Table 2)。注射 HCG 後，LH 的含量於子宮內膜異位的患者，為對照組的 96% (3.66±1.03 vs 3.81±0.74 ， p=0.452) ，其他女性不孕因素組高於對照組 10% (4.25±0.87 vs 3.81±0.74，p=0.351)，多囊性卵巢症候群組僅有 42% (1.62±0.29 vs 3.81±0.74，p=0.004) (Table 2)。僅有多囊性卵巢症候群組與對照組有顯著性差異(p<0.05)。 3. Progesterone (P4) 於取卵手術前所抽取的血清中 P4 含量進行分析，P4 的含量表現於子宮內膜異位的患者，為對照組的 65% (5.94±0.96 vs 9.15±1.06 ， p=0.016) ，其他女性不孕因素組為對照組的 77% (7.10±0.73 vs 9.15±1.06，p=0.066)，多囊性卵巢症候群組高於對照組 15% (10.56±1.11 vs 9.15±1.06，p=0.862) (Table 3)。數據顯示，具有巧克力囊腫的子宮內膜異位群組，其含量僅為對照組的 33% (3.03±1.00 vs 9.15±1.06)，與對照組有顯著性差異(p<0.001) (Fig. 3)；進一步將 P4 含量除以濾泡數，計算每一個濾泡內產生的 P4 濃度，於子宮內膜異位組為對照組的 78% (0.620±0.102 vs 0.789±0.088，p=0.107)，其他女性不孕因素組為對照組的 90% (0.713±0.049 vs 0.789±0.088，p=0.218)，多囊性卵巢症候群組高於對照組 9% (0.861±0.118 vs 0.789±088，p=0.312) (Table 3)。具有巧克力囊腫的子宮內膜異位群組，其含量僅為對照組的 49% (0.393±0.118 vs 0.789±0.088)，與對照組有顯著性差異(p=0.009)。二、各組之濾泡液中荷爾蒙的差異濾泡液中使用 RIA 分析其荷爾蒙的濃度，各組群組在 E2 與 P4 的 ~ 22 ~.

(33) 含量多寡與對照組差異情況(Fig. 4)，與血清中 E2、P4 含量有相同的狀況(Fig. 5，Fig. 6)。子宮內膜異位群組的 E2 含量較對照組低 39% (134507.2±61212.8 vs 219522.5±51175.4，p=0.169)，其他女性不孕因素組為對照組的 87% (193134.1±31065.7 vs 219522.5±51175.4，p=0.326)，多囊性卵巢症候群組低對照組 57% (93685.0±27581.8 vs 219522.5±51175.4，p=0.055) (Table 4)。P4 含量之比較，子宮內膜異位群組的含量為對照組之 98% (8549.6±1976.4 vs 8713.3±1717.8 ， p=0.477)，其他女性不孕因素組高對照組的 16% (10176.0±1591.8 vs 8713.3±1717.8 ， p=0.292) ，多囊性卵巢症候群組高於對照組 56% (13625.0±4393.7 vs 8713.3±1717.8，p=0.147) (Table 4)。數據顯示其濾泡液中之 E2、P4 含量，各群組與對照組之間無顯著性差異。三、各組之濾泡數、取卵數與成熟卵細胞數的比較研究發現，子宮內膜異位的患者分析在人工生殖療程過程中所取得之濾泡數與卵細胞數(Table 5)，濾泡的數目為 9.41±0.56，較對照組低 24% (p=0.003)，且取得的卵細胞數為 6.47±0.62，比對照組少 35% (p=0.007)。其他女性不孕因素組的濾泡數為對照組的 79% (9.70±0.64 vs 12.35±0.90 ， p=0.013) ，卵細胞數為對照組之 74% (7.49±0.66 vs 10.00±1.23，p=0.028)。濾泡數於多囊性卵巢症候群組高於對照組 7% (13.18±0.93 vs 12.35±0.90 ， p=0.273) ，卵細胞數為多對照組 10% (11.04±0.80 vs 10.00±1.23，p=0.264) (Table 5) (Fig. 7)。進一步，將血清中 E2 濃度除以濾泡數，子宮內膜異位的患者之單一濾泡的 E2 較低 (143.40±7.97 vs 174.92±11.93，p=0.015)，其他女性不孕因素組為對照組的 85% (148.03±7.41 vs 174.92±11.93，p=0.028)，多囊性卵巢症候群組低於對照組 17% (144.61±9.62 vs 174.92±11.93，p=0.026) (Fig. 8)。再進一步將子宮內膜異位的患者細分成二個小群組，包括具有巧克力囊. ~ 23 ~.

(34) 腫的子宮內膜異位及不具有巧克力囊腫的子宮內膜異位，低對照組 15%(148.36±9.77 vs 174.92±11.93，p=0.048)，尤其在具有巧克力囊腫的子宮內膜異位群組上，有顯著的降低，佔對照組之 29%(124.57±7.84 vs 174.92±11.93，p<0.001)。就濾泡數及取卵數的分析中，除了多囊性卵巢症候群與對照組沒有統計上顯著差異之外，其他群組皆與對照組有顯著性差異(Table 5)。另外針對取得的成熟卵細胞數(Metaphase II)分析，具有巧克力囊腫的子宮內膜異位群組與對照組比較，其僅是對照組的 61% (3.50±0.82 vs 5.74±0.89，p=0.036)，具有顯著性差異(Table 5，Fig. 7)。四、顆粒細胞內之粒線體功能分析 1. 粒線體膜電位(membrane potential) 在顆粒細胞內的粒線體膜電位變化(membrane potential)的表現是以特殊染劑(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine；TMRE)呈現膜電位強弱，當粒線體膜電位越高其 TMRE 表現螢光強度越強，在流式細胞分析儀其分析結果中，各組與對照組比較(Table 6)，各組膜電位強度皆較低，多囊性卵巢症候群為對照組之 76% (371.55±47.42 vs 482.90±57.46， p=0.077)，而子宮內膜異位組 (341.96±36.18 vs 482.90±57.46， p=0.022)與其他女性不孕因素 (309.84±19.00 vs 482.90±57.46，p=0.012)具有顯著性差異(Table 6，Fig. 9)。另一方面，若不區分疾病群組，單就以粒線體膜電位變化與患者本身荷爾蒙含量進行統計分析，其結果分析發現，若膜電位越高則 E2 含量越高(r=0.091，p<0.001) (Fig. 10)。 2、粒線體數量(mitochondrial mass) 在顆粒細胞內的 mitochondrial mass 分析，是以 nonyl acridine. ~ 24 ~.

(35) orange (NAO)及 MitoTraker Red 螢光染料對粒線體做螢光標定，並使用流式細胞分析儀做分析。各群組與對照組比較，其各組螢光強度皆低，以 NAO 為例(Table 6，Fig. 11)，子宮內膜異位群組為對照組之 68% (445.22±61.09 vs 654.3±81.68，p=0.024)，其他女性不孕因素為對照組之 62% (408.10±80.69 vs 654.3±81.68 ， p=0.025) ，與對照組比較，多囊性卵巢症候群則低 28% (470.95±62.33 vs 654.3±81.68，p=0.04)，各組皆具有顯著性差異 (Table 6，Fig. 11，Fig. 13)。另一方面，若不區分疾病群組，單就以 mitochondrial mass 與患者本身荷爾蒙含量進行統計分析，其結果分析發現，若 mitochondrial mass 越高則 E2 含量越高(r=0.143，p<0.001) (Fig. 12)，(r=0.155，p<0.001) (Fig. 14)。五、顆粒細胞存活率及細胞凋亡之分析 1. 存活率 (viability) 於取得濾泡液中之顆粒細胞後，立即先行以 PI 染已死亡之細胞核(Fig.15)，分析顆粒細胞存活的比率(Fig. 16)，子宮內膜異位群組低對照組 10% (32.79%±1.99% vs 29.65%±2.68%，p=0.185)，其他女性不孕因素為對照組之 90% (32.43%±1.77% vs 29.65%±2.68%，p=0.198)，與對照組比較，多囊性卵巢症候群則低 19% (35.47%±2.21% vs 29.65%±2.68%，p=0.05)，各組皆沒有顯著差異性(Fig. 16)。但若以顆粒細胞之存活率與患者本身荷爾蒙含量進行統計分析，以結果分析發現，viability 越高則 E2 含量越高 (r=-0.115，p<0.001) (Fig. 17)。 2. 細胞凋亡 (apoptosis) 顆粒細胞之細胞凋亡與否是以 Annexin V 及 PI 染色，利用流. ~ 25 ~.

(36) 式細胞分析儀做分析。各群組與對照組比較，表現出細胞凋亡的比例較高，以 Annexin V 為例(Table 7，Fig. 18)，子宮內膜異位群組比對照組多 15% (65.29%±2.23% vs 56.94%±4.90%，p=0.045)，其他女性不孕因素高於對照組 6% (60.90%±3.11% vs 56.94%±4.90% ， p=0.271) ，多囊性卵巢症候群則多 19% (68.29%±3.49% vs 56.94%±4.90%，p=0.037)，子宮內膜異位群組及多囊性卵巢症候群與對照組有顯著差異(Table 7，Fig. 18)。若不區分疾病分組，以顆粒細胞之細胞凋亡與患者本身荷爾蒙含量進行統計分析，結果分析發現，若細胞凋亡越多則 E2 含量越低(r=-0.004，p<0.001)(r=-0.182，p<0.001) (Fig. 19)。六、顆粒細胞內荷爾蒙生成酵素(steroidogenic enzyme)分析 1. 荷爾蒙生成酵素(StAR 與 3β-HSD) 顆粒細胞內之 StAR 與 3β-HSD 為分析主要酵素，因顆粒細胞中，StAR 與 3β-HSD 為主要 steroidogenesis 荷爾蒙合成的 key enzyme。經西方墨點法分析之結果(Table 8，Fig. 20)。各群組與對照組比較，表現出 StAR 的含量較高，子宮內膜異位群組比對照組多 4% (0.93±0.07 vs 0.89±0.13，p=0.392)，其他女性不孕因素高於對照組 28% (1.14±0.12 vs 0.89±0.13，p=0.095)，多囊性卵巢症候群則多 22% (1.09±0.12 vs 0.89±0.13，p=0.150)。相反的情況發生於 3β-HSD，各群組的 3β-HSD 比對照組低，子宮內膜異位群組為對照組 90% (0.97±0.04 vs 1.07±0.10，p=0.189)，其他女性不孕因素低對照組 17% (0.89±0.05 vs 1.07±0.10，p=0.494)，多囊性卵巢症候群則為其之 87% (0.93±0.07 vs 1.07±0.10，p=0.394)(Table 8)。若不區分疾病分組，單就以顆粒細胞之 StAR 與 3β-HSD 與患者本身荷爾蒙含量進行統計分析，以結果分析，若顆粒細胞 StAR 越多. ~ 26 ~.

(37) 則 E2 含量越高(r=0.224，p<0.001) (Fig. 21)。而顆粒細胞 3β-HSD 越多則 P4 含量越高(r=0.058，p<0.001) (Fig. 22)。 2. 荷爾蒙生成酵素與粒線體功能將 StAR(Table 9)與 3β-HSD(Table 10)的含量分別與粒線體膜電位 (TMRE)及 mitochondrial mass(NAO，MitoTraker Red)做統計分析，以分析結果得知，其 steroidogenic enzyme 與 mitochondrial function 皆有顯著的差異性(p<0.001)。七、卵細胞受精率與患者懷孕率之分析 1. 受精率 (fertilization rate) 各個群組所取得之卵細胞經人工生殖方式給予不同之受精方式，其中男性因素群組使用單一精蟲卵質注入法(Intracytoplasmic Sperm Injection；ICSI)，其他群組則是使用自行受精方式，故以其他女性不孕因素為受精率與患者懷孕率之對照組，分析每個患者卵細胞之受精率(Table 11，Fig. 23)，各群組受精率皆低於其他女性因素。子宮內膜異位群組為對照組 93% (73.08%±3.03% vs 78.39%±2.63%，p=0.093)，具有巧克力囊腫的子宮內膜異位之群組最差，比其他女性不孕因素低 22% (56.56%±8.76% vs 78.39%±2.63%，p=0.015)，而男性因素僅 67%之受精率，比其他女性不孕因素低(66.50%±4.48% vs 78.39%±2.63%，p=0.009)；多囊性卵巢症候群則為對照組之 90% (70.96%±2.38% vs 78.39%±2.63%，p=0.019)。若不將病因分組，單就以卵細胞受精率與患者本身荷爾蒙含量進行統計分析(r=0.038，p<0.001) (Table 12)，以結果分析，若 E2 含量越高則卵細胞受精率越多(Fig. 23)。 2. 懷孕率 (pregnancy rate) 各組之懷孕率，經分析後發現，各組之懷孕率皆低於其他女. ~ 27 ~.

(38) 性不孕因素群組，子宮內膜異位為對照組 75% (24.64% vs 32.47%，p=0.297)，而男性因素僅 22%之受精率，比其他女性不孕因素低 33% (21.88% vs 32.47%，p=0.269)，多囊性卵巢症候群則為其之 59% (19.15% vs 32.47%，p=0.107)。各組與對照組之間無顯著差異(Table 11)。另一方面，以懷孕率與患者本身荷爾蒙含量進行統計分析，E2 含量與懷孕機率無相關性(p=0.601) (Table 12)。. ~ 28 ~.

(39) 第五章. 討論. 人工生殖治療之不孕症患者，主要有二種施行方式，包括人工授精(Intra-uterine insemination；IUI)及試管嬰兒(In-vitro fertilization； IVF)。試管嬰兒的發展至今，懷孕成功率並無大幅度的進步，影響的原因有許多。因此，在人工生殖的領域中，無論是臨床或學術界對於生殖方面做許多研究，以求得更好的技術與改善成功率。本研究之患者群組以收集女性不孕症患者之診斷病因，分別區分為四大群，包括子宮內膜異位症、多囊性卵巢症候群、其他女性不孕因素及男性不孕因素，因不孕症之治療，本身患者本來就有些與不孕相關之問題，實驗中無法取得由正常婦女進行人工生殖技術療程去刺激排卵，並取得正常的顆粒細胞做研究，因此選擇以男性不孕因素為其他因素群組之對照組，但是在卵細胞之受精率因男性不孕因素的精子品質的因素僅能提供參考，無法與其他因素群組做比較，故卵細胞受精率與患者懷孕率則選擇其他女性因素做為對照組。由於顆粒細胞本身的特性易聚結成團，並且於經陰道超音波引導下取卵手術過程會有血球的摻混(Levay et al., 1997)。因此當以流式細胞儀進行分析的過程中，因為顆粒細胞大小約 18~25 微米(Nottola et al., 2006)，雖然比血液中之白血球較大，但是易混淆而造成讀取上的錯誤，有些實驗研究使用了表面有 CD45 為標記的磁珠去吸附掉白血球，進而純化出顆粒細胞(Neubourg et al., 1996)，但是此方式屬於去除法，並無法完全的去除白血球之干擾，在本次實驗研究中，選擇使用標記顆粒細胞表面特有的 FSH 之接受器(receptor)(Quinn et al., 2006)，利用此接受器的抗體做標記，以區分出顆粒細胞，再進一步研究顆粒細胞粒線體功能及其細胞凋亡之比例。 ~ 29 ~.

(40) 首先針對血液中的荷爾蒙做分析，研究結果顯示注射 HCG 前十分鐘所採取到之血液中的 E2 於四種群組中，各組皆低於對照組，僅在多囊性卵巢症候群患者與對照組沒有顯著性差異。在子宮內膜異位症群組之患者的 E2 含量低於對照組之患者的含量，約對照組之 61% (1354.07±109.99 vs 2212.72±219.26，p=0.001)，尤其於患有巧克力囊腫的婦女其血清中 E2 含量約為對照組之 46% (1015.88±127.72 vs 2212.72±219.26，p<0.001)。其他女性不孕因素之 E2 含量也相同情況，對照組之 63% (1404.48±106.02 vs 2212.72±219.26，p=0.001)，推測此狀況因刺激卵成熟過程中，不同疾病的女性體內因素，造成體內荷爾蒙較一般正常女性之荷爾蒙低(Tummon et al., 1988)。血清中 LH 含量於疾病群組之統計分析中，僅有多囊性卵巢症候群組較對照組低，約為對照組的 44% (2.10±0.30 vs 4.77±1.54，p=0.049)，有統計上顯著的差異 (p<0.05)，一般多囊性卵巢症候群之患者其 androgen 較高，亦造成 LH 較高(Matalliotakis et al., 2006)，但是本研究中卻發現相反之狀況，推測是因為接受人工生殖療程中，經由刺激排卵藥物的控制，特別對多囊性卵巢症候群患者的 androgen 及 LH 特別做控制，抑制其濃度上升，使得血液中的濃度偏低(Stanek et al., 2007)。血清中 P4 含量於疾病群組之統計分析中，於具有巧克力囊腫的子宮內膜異位其結果明顯的降低，約為對照組的 33% (3.03±1.00 vs 9.15±1.06)，有統計上顯著差異性(P<0.05)。一般子宮內膜異位之患者其在排卵前與 LH surge 前後，血液中 E2 及 LH 的含量較一般正常人低 (Tummon et al., 1988)。子宮內膜異位患者其 P4 及 interleukin-6 (IL-6) 皆較高(Garrido et al., 2000)。這與本次研究中非巧克力囊腫之子宮內膜異位的數據相符，但是本研究中卻發現具巧克力囊腫的子宮內膜異位群組為相異之狀況，推測是因為巧克力囊腫所造成與一般子宮內膜異. ~ 30 ~.

(41) 位之患者相反狀況，造成 LH 較對照組高，高約對照組之 2%(4.85±1.14 vs 4.77±1.54)，亦使得 P4 在血液中的含量偏低，為對照組之 33% (3.03±1.00 vs 9.15±1.06)。於濾泡液內之荷爾蒙雖然無統計顯著性差異，亦發現有相同的趨勢，血液中的 LH 含量與血液中或濾泡液內的 P4 是負的相關性。本研究中，子宮內膜異位的患者之濾泡數與取得卵細胞數皆比其他群組低，具統計顯著性差異(p<0.05)；經 E2 校正過，單一濾泡或單一卵細胞的 E2 含量亦較低，以表現出卵細胞數較少，且刺激顆粒細胞產生之荷爾蒙含量較低。具巧克力囊腫的子宮內膜異位群組其濾泡數偏低，為對照組之 62% (7.69±0.99 vs 12.35±0.90，p=0.001)，取得卵細胞數在群組中最低，為對照組之 44% (4.38±0.96 vs 10.00±1.23， p<0.001)，其卵細胞成熟數(Metaphase II)亦是最少，為對照組之 61% (3.50±0.82 vs 5.74±0.89，p=0.036)。研究數據表現出具巧克力囊腫的子宮內膜異位群組其濾泡數、卵細胞數及卵細胞成熟數(Metaphase II)在群組中皆是最少的狀態，且在統計上皆有顯著的差異(p<0.05)。在本研究中觀察顆粒細胞的粒線體功能，利用 TMRE 測定粒線體膜電位，而粒線體數量的表現是以 NAO 及 MitoTraker Red 來標記粒線體，並計算 mitochondrial mass。在本研究數據顯示，以子宮內膜異位群組為例，當粒線體膜電位降低 (341.96±36.18 vs 482.90±57.46 ， p<0.031)，而 mitochondrial mass 少(445.22±61.09 vs 654.30±81.68， p<0.024) ，相對血液中 E2 含量亦降低 (1354.07±109.99 vs 2212.72±219.66，p<0.001)。因此，群組的顆粒細胞膜電位降低，相對在 mitochondrial mass 較少，使血清中 E2 含量變少，並在群組上是具有統計顯著性差異。顆粒細胞內粒線體功能不好，降低顆粒細胞產生的荷爾蒙，進而影響卵細胞數量與其品質(Yamashita et al., 2007)。. ~ 31 ~.

(42) 在顆粒細胞的細胞凋亡分析，其數據及圖形上的變化與粒線體膜電位及 mitochondrial mass 是有相對性的，以子宮內膜異位群組為例，當粒線體膜電位降低，為對照組之 71% (341.96±36.18 vs 482.90±57.46，p<0.031)，而 mitochondrial mass 少，為對照組之 68% (445.22±61.09 vs 654.30±81.68，p<0.024)，相對顆粒細胞的 Annexin V 比例增加，高於對照組 15% (65.29%±2.23% vs 56.94%±4.90% ， p=0.045)。本研究數據的結果，與其他文獻有相同情況。在文獻報告中指出，當粒線體的膜電位下降，進一步會造成細胞凋亡(Krysko et al., 2001)。當顆粒細胞之粒線體膜電位下降、mitochondrial mass 減少及細胞凋亡增加，血液中荷爾蒙含量會變少。因此於顆粒細胞內的粒線體所控制的細胞凋亡是重要的一個路徑(Amsterdam et al., 2003; Choi et al., 2004)，粒線體功能不佳因而使得血液中荷爾蒙濃度偏低。顆粒細胞內之 StAR 與 3β-HSD 做為分析主要酵素，因所有的類固醇合成的第一步驟為膽固醇從粒線體外膜移送到內膜，交由 P450scc 作用產生 P4，但是粒線體之 intermembrane space 為水性狀態，無法使脂溶性的膽固醇通過，必須要有運送蛋白協助膽固醇移送的工作 (Kallen et al., 1998; Miller, 2007)。現在已知 StAR 能快速的使粒線體產生類固醇荷爾蒙(Christenson and Strauss, 2000, 2001)。而 3β-HSD 之任務為將去氫皮質酮轉換成雄烯二酮及將孕烯醇酮轉換成黃體素 (Thomas et al., 1989)。因此，為了解顆粒細胞的 steroidogenesis，故選擇 StAR 及 3β-HSD 做為研究目標。在各組群組並無統計上相關的差異性(Table 8，Fig. 20)，若以不區分疾病分組，單就以顆粒細胞之 StAR 與 3β-HSD 與患者本身荷爾蒙含量進行統計分析，以結果分析發現，若 StAR 越多則 E2 濃度越多(p<0.05) (Fig. 21)，具統計上之相關性。另外，在圖表的表現上觀察，發現 StAR 與 3β-HSD 是相反之狀況，當 StAR. ~ 32 ~.

(43) 越高則 3β-HSD 越低，但是於統計上無顯著差異。各群組之卵細胞有不同的受精方式，其中男性因素群組使用單一精蟲卵質注入法，其他群組則是使用自行受精方式，故以其他女性不孕因素為受精率與患者懷孕率之對照組，男性因素僅 67% 之受精率 (66.50%±4.48% vs 78.39%±2.63%，p=0.009)，而具有巧克力囊腫的子宮內膜異位之群組最不佳(56.56%±8.76% vs 78.39%±2.63%，p=0.015)，此結果表現出巧克力囊腫對卵細胞之影響很大。各群組之懷孕率，無統計上相關的差異性。於本研究中，因每一位患者對荷爾蒙刺激的反應皆不一致，故刺激出來濾泡內的顆粒細胞數量也不一致，而導致所收集到的有可能不足實驗分析，造成樣本收集上的困難。每一個療程所取得的血液檢體以及抽取出的顆粒細胞，僅能提供一次項目之分析，無法重複多次項目分析。在本研究推測顆粒細胞在不孕症患者中扮演的角色重要性，探究多囊性卵巢症候群、子宮內膜異位或其他女性不孕因素是否造成的顆粒細胞其細胞功能的不足進而使得卵細胞不成熟甚至不生長，因而造成不孕之因素。研究中發現，具有巧克力囊腫之子宮內膜異位症之群組與對照組比較結果較其他各組有顯著差異。分析多囊性卵巢症候群、子宮內膜異位或其他女性不孕因素及男性因素之患者，從產生之血液、濾泡液的荷爾蒙含量，卵細胞狀態，顆粒細胞的功能至顆粒細胞內粒線體功能等，發現多囊性卵巢症候群的控制良好，與一般婦女疾病無太大差異。而子宮內膜異位症之群組患者，可能因為子宮內膜異位所造成之卵巢環境及本身功能不良，進而使得顆粒細胞狀況不好，影響卵細胞品質(Damewood et al., 1990; Simon et al., 1992)、受精率下降(Mahadevan et al., 1983; Wardle et al., 1986)及懷孕率偏低(Matson and Yovich, 1986; Yovich et al., 1985)。此因. ~ 33 ~.

(44) 素造成卵巢無法以人工生殖技術給予改善或修護，僅能就原本殘餘部份與以使用。有研究提出，顆粒細胞粒線體 DNA 4977 斷損突變會影響卵細胞之受精率(Yamashita et al., 2007)。而具有巧克力囊腫之子宮內膜異位群組的表現在各方面皆是最差的。研究文獻提出，巧克力囊腫會造成其他發炎病症(Liu et al., 1998)；亦會造成骨盆腔沾粘(Jain and Dalton, 1999)；當子宮內膜異位併有巧克力囊腫時，也會使顆粒細胞的 apoptotic body 增加(Nakahara et al., 1998)。另一方面，粒線體功能與顆粒細胞之間相關性於血液中荷爾蒙含量具有統計上相關性，顆粒細胞健全，其內部的粒線體功能好，所產生的荷爾蒙含量較高，對卵細胞有莫大的幫助。後續對於顆粒細胞粒線體功能，如粒線體 ATP 含量及粒線體 DNA(mtDNA)的缺陷(deletions)加以研究，以觀察顆粒細胞的粒線體功能與顆粒細胞 steroidogenesis 相關性及不同疾病之間的影響。. ~ 34 ~.

(45) 附表及圖. ~ 35 ~.

(46) Table 1. 各組群組的血清中 E2 含量(pg/mL). HCG injection Before oocyte retrieval Before HCG injection. ~ 36 ~. n. Mean ± SEM. Control (male factor). 32. 2212.72 ± 219.26. Endometriosis. 76. 1354.07 ± 109.99. 16. Chocolate cyst. None chocolate cyst 57. p-value. After HCG injection Mean ± SEM. p-value. Mean ± SEM. p-value. 2146.86 ± 228.53. 977.86 ± 105.25. 1370.39 ± 146.02 0.002*. 580.61 ± 81.38. 0.016*. 1015.88 ± 127.72 <0.001**. 1020.27 ± 216.41 0.006*. 483.83 ± 142.35. <0.001**. 1449.00 ± 134.01. 0.001*. 1471.74 ± 175.41 0.011*. 629.76 ± 103.03. 0.122. 0.001*. Other female factor. 80. 1404.48 ± 106.02. 0.001*. 1524.16 ± 124.13 0.003*. 659.30 ± 56.65. 0.066. PCOS. 49. 1889.04 ± 166.69. 0.119. 2053.23 ± 190.32. 856.10 ± 76.30. 0.862. 0.171. Abbreviates, n , subject number ; SEM , Standard Error of Mean ; PCOS , polycystic ovary syndrome. * p<0.05 for versus control, by T-test. ** p<0.001 for versus control, by T-test.

(47) Table 2. 各組群組的血清中 LH 含量(mIU/mL). n. Before HCG injection. After HCG injection. Mean ± SEM p-value. Mean ± SEM p-value. Control (male factor). 32. 4.77 ± 1.54. Endometriosis. 76. 3.33 ± 0.36. 0.186. 3.66 ± 1.03. 0.452. Chocolate cyst. 16. 4.85 ± 1.14. 0.483. 4.95 ± 1.34. 0.217. None chocolate cyst. 57. 2.91 ± 0.32. 0.123. 3.28 ± 1.27. 0.360. Other female factor. 80. 2.90 ± 0.44. 0.126. 4.25 ± 0.87. 0.351. PCOS. 49. 2.10 ± 0.30. 0.049*. 1.62 ± 0.29. 0.004*. * p<0.05 for versus control, by T-test.. ~ 37 ~. 3.81 ± 0.74.

(48) Table 3. 各組群組的血清中 P4 含量(ng/mL)及經濾泡數校正之相關性. Serum. P4 per follicle. n Mean ± SEM p-value. Mean ± SEM p-value. Control (male factor). 32. 9.15 ± 1.06. 0.789 ± 0.088. Endometriosis. 76. 5.94 ± 0.96. 0.016*. Chocolate cyst. 16. 3.03 ± 1.00. <0.001** 0.393 ± 0.118 0.009*. None chocolate cyst. 57. 7.19 ± 1.28. 0.122. 0.730 ± 0.138 0.360. Other female factor. 80. 7.10 ± 0.73. 0.066. 0.713 ± 0.049 0.218. PCOS. 49 10.56 ± 1.11. 0.862. 0.861 ± 0.118 0.312. 0.620 ± 0.102 0.107. * p<0.05 for versus control, by T-test. ** p<0.001 for versus control, by T-test. ~ 38 ~.

(49) Table 4. 各組群組的濾泡液(follicular fluid)中 E2(pg/mL)與 P4 含量(ng/mL). E2 n. Mean ± SEM. P4 p-value. Mean ± SEM. p-value. Control(male factor) 4 219522.5 ± 51175.4. 8713.3 ± 1717.8. Endometriosis. 8549.6 ± 1976.4 0.477. 5 134507.2 ± 61212.8 0.169. Other female factor 8 193134.1 ± 31065.7 0.326 10176.0 ± 1591.8 0.292 PCOS. 3. 93685.0 ± 27581.8 0.055 13625.0 ± 4393.7 0.147. * p<0.05 for versus control, by T-test.. ~ 39 ~.