Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4240

Tam metin

(1)臺北醫學大學醫學科學研究所碩士論文. Taipei Medical University Graduate Institute of Medical Science Master Thesis. Andrographolide 抑制 LPS/IFN- 誘發大鼠血管平滑肌細胞發炎反應之分子機轉探討. Inhibitory Mechanism of Andrographolide on LPS/IFN-Induced Vascular Smooth Muscle Cell Inflammation. 研究生：王薏媗 (Yi-Hsuan Wang) 指導教授：許準榕博士(Joen-Rong Sheu, Ph. D.). 中華民國九十七年七月 July, 2008 1.

(2) 目錄. 項目. 頁次. 目錄. 1. 中文摘要. 2. 英文摘要. 4. 縮寫對照表. 6. 壹、緒論. 7. 貳、材料與方法. 21. 參、結果. 43. 肆、討論. 59. 伍、結論. 65. 陸、圖表. 66. 柒、參考文獻. 85. 2.

(3) 中文摘要近來的研究中發現動脈粥狀硬化不再被認為是一種脂肪堆積所造成的疾病，而是一種內皮失去功能、內皮下發炎反應以及血管平滑肌細胞的癒後有關的慢性發炎病程。本篇論文在於探討穿心蓮萃取物 andrographolide (3-(2-(decahydro-6-hydroxy-5-(hydroxymethyl)-5,8a-dimethyl-2methylene-1-napthalenyl)ethylidene)dihydro-4-hydroxy-2(3H)-fur anone)抑制大鼠血管平滑肌細胞發炎的藥理機轉。在本篇研究中我們發現 andrographolide(20 及 50 M)以濃度相關性的降低脂多醣體(lipopolysaccharide，LPS)以及干擾素 (interferon- )在大鼠血管平滑肌細胞中所引發的發炎因子，包含誘導型一氧化氮合成酵素以及基質金屬蛋白水解酶，訊息核醣核酸及蛋白質的生成。之後進一步探討 andrographolide 抑制細菌脂多糖體與干擾素合併誘導血管平滑肌細胞發炎的分子機轉。發現 andrographolide 抗發炎的效果是經由影響 NF-B 進入細胞核內進，而抑制轉錄因子 NF-B 訊息之活化。之後我們更進一步觀察 andrographolide 在動物實驗中，對於施以氣球擴張術後的大鼠頸動脈，是否能降低其血管新內膜的過度增生，發現 andrographolide(5 mg/kg/day)可以明顯的減少氣球擴張術造. 3.

(4) 成的血管內膜增生的情形。本研究發現，andrographolide可以藉由抑制轉錄因子NF-B 之活化而降低下游發炎相關基因的表現，將來在臨床上對於動脈粥狀硬化疾病以及氣球擴張術後的血管再阻塞是具有開發潛力的藥物。. 4.

(5) Abstract In the recent study, atherosclerosis was no longer considered a disorder of lipid accumulation, but a disease process characterized by the dynamic interaction between endothelial dy s f un c t i o n,s u be n d o t he l i a li n f l a mma t i ona n dt h e‘ woun dhe a l i ng r e s po n s e ’oft hev a s c ul a rs moot hmus c l ec e l l s . Andrographolide is a bicyclic diterpenoid lactone isolated from leaves of Andrographis paniculata. In the present study, we investigated the effects and mechanisms of andrographolide on the inflammatory effect induced by bacterial lipopolysaccharide (LPS) and interferon-(IFN- ) on cultured primary vascular smooth muscle cells (VSMCs). We found that andrographolide (20 and 50 M). exerted. a. concentration-dependently. inhibited. the. inflammatory mediator expression including nitric oxide (NO) production, iNOS mRNA and protein expression upon stimulation by LPS (50 g/mL)/IFN-(100 unit/mL) on VSMCs. On the other hand, andrographolide (20 and 50M) concentration-dependently suppressed matrix metalloproteinase-9 not only expression but also activation on VSMCs, which are stimulated by LPS and. 5.

(6) IFN-   And the continued research focused on the molecular mechanism of andrographolide inhibitory effect on LPS with Interferon-induced vascular smooth muscle cells inflammation. We found that andrographolide attenuated inflammatory effect by inhibiting. NF-B. tranlocation. therefore. down-regulated. transcription factor NF-B signal activation. Moreover, we found that andrographolide (5 mg/kg/day) inhibited the thrombus and neointimal formation after angioplasty at prevention of neointimal hyperplasia in rats. Our research indicated that, by the down-regulation of the NF-B target genes which are critical in thrombosis and inflammation, such as andrographolide, may be therapeutically valuable for preventing and treating thrombotic arterial diseases, including neointimal hyperplasia in arterial restenosis.. 6.

(7) 縮寫對照 BSA. bovine serum albumin. DMSO. dimethylsulphoxide. ECM. extracellular matrix. EMSA. electrophoretic mobility shift assay. FBS. fetal bovine serum. GAPDH. glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase. IFNs. interferons. IB. inhibitor of NF-B. IKK. IB kinase. IL. interleukin. LPS. lipopolysaccharide. MAPKs. mitogen-activated protein kinases. MMPs. matrix metalloproteinases. NF-κB. nuclear factor kappa-B. NLS. nuclear localization signal. RT-PCR. reverse transcription-polymerase chain reaction. SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polacrylamide gellectrophoresis. 7.

(8) 壹、緒論 (Introduction) 動脈粥狀硬化(atherosclerosis) 在心血管疾病中扮演相當重要的角色，其併發症包含冠心病(coronary artery disease)、急性血管症候群(acute vascular syndromes)、心肌梗塞(myocardial infarction) 、不穩定型心絞痛 (unstable angina) 及中風 (stroke)(Fuster, 1994)。二十世紀末開始，治療高膽固醇血症以及高血壓是臨床常用動脈粥狀硬化的治療方式，但是心血管疾病在之後的十五年間仍在世界造成相當高的死亡率，並且在已開發國家地區包含東歐地區以及西方國家快速增加(Murray & Lopez, 1997)；心血管疾病佔北美總死亡原因的百分之三十八，為歐洲六十五歲以下男性最常見的死亡原因，及歐洲六十五歲女性第二死亡原因。這些過去的統計讓我們必須由一個新的角度來重新檢視這個疾病及其所用的治療以及預防方式(Hansson, 2005)。. (一) 動脈粥狀硬化及其病程動脈粥狀硬化是一種主要發生於中大型彈性動脈的疾病，因為細胞(cells)、細胞基質(cell matrix)、脂肪(lipids)以及殘骸(debris)堆積血管內膜(intima)造成不正常增厚的疾病(Stary et. 8.

(9) al., 1995)。而病程可以簡單區分為三個時期:脂肪斑紋的形成 (formation of fatty streaks)、複雜性損傷的發展(development of complex lesions)，以及斑塊的破裂(plaque rupture)(Lusis, 2000)。在近來的研究當中指出動脈粥狀硬化開始於內皮失去功能(endothelial dysfunction)(Ross & Glomset, 1973)，而可能造成內皮細胞受損導致內皮失去功能的原因有，血液中低密度脂蛋白濃度的提高、因吸菸所產生的自由基、高血壓、糖尿病、基因的影響、血漿中同型半胱氨酸(hemocysteine)濃度的提高、微生物的感染例如泡疹病毒 (herpesviruses) 或肺炎披衣菌 (chlamydia pneumoniae)(Ross, 1993)。內皮細胞因受損而失去功能後，會增加吸附分子(adhesion molecules)的表現和產生細胞激素(cytokines)(Lusis, 2000)，刺激單核球(monocyte)和 T 型淋巴球(T-lymphocytes)由血液循環移動進入動脈血管壁中。進入血管內膜(intima)後的單核球分化(differentiation)成為巨噬細胞 (macrophages)，而巨噬細胞在吞噬氧化低密度脂蛋白後成為泡沫細胞(foam cells)，泡沫細胞的堆積在血管內膜形成脂肪斑紋 (fatty streaks)。而吸附分子及細胞激素也會刺激血管平滑肌細胞 (vascular smooth-muscle cell) 的移動 (migration) 及增生 (proliferation)。由中膜(media)進入內膜(intima)的血管平滑肌細. 9.

(10) 胞除了也會吞噬脂蛋白形成泡沫細胞之外，更重要的是血管平滑肌細胞會和細胞外基質(extracelluar matrix, ECM)形成纖維帽 (fibrous cap)，包覆脂質以及死亡(necrosis)和凋亡(apoptosis)的泡沫細胞碎片的死亡核心 (necrotic core)，而形成纖維斑塊 (fibrous plaque)。脂質堆積、血液的沖刷、血管平滑肌細胞的死亡及金屬蛋白酶包括膠原蛋白酶(collagenase)、彈性蛋白酶 (elastase)和基質溶解酶(stromelysins)分解細胞外基質所導致纖維帽的脆弱，都會導致纖維斑塊的破裂(rupture of plaque)。破裂的斑塊不但會造成更大的血管內膜傷害形成受損與修復的循環，也會暴露出組織因子 (tissue factor) 進而造成血栓 (thrombosis)的形成，造成中風等其他的心血管疾病(Lusis, 2000, Harvey & Ramji, 2005)。. (二) 發炎反應與動脈粥狀硬化在 1970 年間，血中膽固醇(cholesterol)尤其是低密度脂蛋白(low-density lipoprotein)的升高是動脈粥狀硬化的主要危險因子之一，所以高血脂(hyperlipidemia)被認為是動脈粥狀硬化的主要成因(Ross & Harker, 1976)，雖然改變生活習慣以及使用藥物來降低血中膽固醇濃度在過去是常用的治療方式. 10.

(11) (Shepherd et al., 1995)，然而心血管疾病仍是美國歐洲及大部分亞洲地區的主要死亡原因(Breslow, 1997)。而在 1970 到 1980 年間，由於臨床所用的穿皮血管擴張術易造成血管再窄化 (restenosis)而使研究人員專注於生長因子(growth factor)以及血管平滑肌細胞的增生研究。而近來內皮受損後造成內皮失去功能(endothelia dysfunction)的假設為動脈粥狀硬化病程起始的假說已被確立之後，發炎反應在動脈粥狀硬化所扮演的角色開始受到研究人員的關注。 1. 發炎標的與動脈粥狀硬化 C-反應蛋白(CRP，C-Reactive Protein)是一種由肝臟生成出來的特殊蛋白，因為對肺炎球菌的 C 多醣體會有反應，故稱為 C 反應蛋白(CRP, C-reactive protein)。當肝臟受到發炎細胞激素例如 IL-1、IL-6 和 TNF-刺激時，會分泌 CRP 而提高血中 CRP 之濃度，目前在臨床上被當作發炎反應之指標。在之前的研究中發現在動脈粥狀硬化相關之疾病例如不穩定心絞痛 (unstable angina)和心肌梗塞 (myocardial infarction) 的病人當中，血液中的 CRP 和 IL-6 都有上升的現象，並且有較高濃度的 CRP 和 IL-6 的病人其之後的病況較為嚴重。(Liuzzo et al., 1994, Biasucci et al., 1996, Lindahl et al., 2000)而這些病人的血. 11.

(12) 液中其它的發炎標的(inflammatory marker)也有提高，包含 fibrinogen 、 IL-7 、 IL-8 、 soluble CD40 ligand 和 C-reactive protein-relative protein pentraxin 3 (Wilhelmsen et al., 1984, Aukrust et al., 1999, Peri et al., 2000, Damas et al., 2003)。在 2003 年一月，美國疾病管制局 (Centers for Disease Control and Prevention, CDC)和美國心臟協會(American Heart Association, AHA)聯合公告認為 CRP 可以用來作為心血管疾病之臨床檢驗指標(Pearson et al., 2003)。 2. 微生物感染與動脈粥狀硬化目前被認為和動脈粥狀硬化相關的微生物包含疱疹病毒 (herpesviruses)和肺炎披衣菌(Chlamydia pneumoniae)。泡疹病毒 (herpesviruses)及肺炎披衣菌(C. pneumoniae)在動脈粥狀硬化的動脈血管病灶處都有被發現(Hendrix et al., 1990, Jackson et al., 1997)，在臨床上並利用這些微生物的抗體來偵測曾發生心肌梗塞病人的血管狀態 (Melnick et al., 1993)(MelnickAdam & Debakey, 1993, Gupta et al., 1997)。血管平滑肌細胞的遷徙 (migration)以及增生(proliferation)在動脈粥狀硬化病程當中扮演很重要的角色，而cytomegalovirus (CMV, human herpesvirus type 5)在體外實驗當中被證實會增加血管平滑肌細胞的遷徙. 12.

(13) (migration)亦會藉由抑制p53而增加血管平滑肌細胞的增生 (proliferation) (Zhou et al., 1999b)，並增加血管損傷後的內膜增生反應(Zhou et al., 1999a)。雖然如此，並沒有直接的證據可以證明這些感染性微生物會造成動脈硬化(Nicholson et al., 1998)，而且這些微生物在很多器官及組織中都有存在，直接在動物上注射這些感染性微生物也無法造成動物的動脈粥狀硬化；但在有些報告中仍發現，感染及其他動脈硬化相關因子的共同作用有可能造成某些病人動脈硬化的產生。(Libby et al., 1997) 以上的研究使動脈粥狀硬化被重新定義為一種慢性發炎疾病，而使心血管疾病有了新的研究方向 (Ross, 1999)。. (三) 血管平滑肌細胞在動脈粥狀硬化中扮演的角色血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)根據形態學，大致上分成兩種形態(phenotypes)，收縮型(contractile phenotype) 和合成型 (synthetic phenotype)(Libby et al., 1989)(Kuro-o et al., 1989)。正常生理狀況下血管平滑肌細胞位於血管內皮細胞下層的血管中膜為收縮型血管平滑肌細胞。收縮型的血管平滑肌細胞為紡錘狀(spindle-shaped)，有大量和收. 13.

(14) 縮有關的蛋白質，例如:肌動蛋白(-actin)、肌球蛋白(myosin)、原肌球蛋白(tropomyosin)等。收縮型的血管平滑肌細胞功能在維持血管壁的強韌度而提供血管張力與彈性。在動脈粥狀硬化的病程進行中，內皮細胞受損會使原本位於內皮細胞下方的血管平滑肌細胞受細胞激素影響而由原本的收縮型轉為合成型，進而往內膜移動並開始增生(Schwartz et al., 1986)。受到細胞激素刺激的合成型血管平滑肌細胞相較於收縮型除了細胞組成的改變，例如合成型血管平滑肌細胞內有較少的肌纖維蛋白、較多的合成型胞器例如高基氏體(Golgi complex)、內質網 (endoplasmatic reticulum) (Clowes et al., 1983)，且增生及遷徙能力和對使細胞凋亡的刺激均呈現高度敏感性(Orekhov et al., 1986)之外。在動脈粥狀硬化中血管平滑肌細胞除了吞噬過氧化低密度脂蛋白形成泡沫細胞、分泌細胞外基質形成纖維帽 (Lusis, 2000)，也會受細胞激素刺激產生誘導型一氧化氮合成酶以及金屬蛋白水解酶，誘導型一氧化氮合成酶會產生大量的過氧化物進而氧化低密度脂蛋白，而金屬蛋白水解酶則會使斑塊 (plague)破裂，皆會使動脈粥狀硬化病程惡化(Buttery et al., 1996) (Galis & Khatri, 2002) 。. 14.

(15) (四) 一氧化氮(Nitric oxide) 一氧化氮是含一未配對電子的自由基，屬於活性氮族群 (reactive nitrogen species, RNS)之一，此分子極不穩定，在氧存在下會快速代謝成亞硝酸鹽(nitrite)和硝酸鹽(nitrate)。一氧化氮(nitric oxide)的生理作用依合成的量、時間及被合成的位置來決定。過去發現低量的的一氧化氮具有抗動脈粥狀硬化的功能，包含調整血壓、抑制血小板凝集、抑制血管平滑肌細胞的增生(Ignarro et al., 1999)、減少白血球貼附於內皮細胞 (Bogdan, 2001)，以及減少細胞激素對血管內皮細胞的刺激 (Peng et al., 1995)。在細胞激素誘發下所產生高量的一氧化氮則具有細胞毒性。過量的一氧化氮和超氧化物(superoxide)可以形成比超氧化物更具有氧化破壞性的過氧亞硝基物(peroxynitrite, ONOO-)，會造成細胞 DNA 斷裂、蛋白質氮化(nitration)以及脂質過氧化 (Beckman et al., 1990)。一氧化氮在體內的合成路徑，主要是經由一氧化氮合成酵素(nitric oxide synthase, NOS)經由三種受質：L-arginin、NADPH 與 O2 ，加上五種輔助因子： FAD 、 FMN 、 calmodulin 、 (6R)-tetrahydrobiopterin(BH4)及 heme 的作用，催化產生一氧化. 15.

(16) 氮以及 L-citrulline(Stuehr DJ, 1999)。目前將一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase)粗略分為兩種不同的種類：基本型(constitutive)與誘導型(inducible)兩類。基本型一氧化氮合成酶(cNOS)平時就存在著，包含(1)、神經性基本型一氧化氮合成酶(neuronal constitutive NOS, nsNOS, or type I)，主要存在於中央及周邊神經系統，主要和腦部學習與記憶有關，以及(2)、內皮性基本型一氧化氮合成酶(endothelial constitutive NOS, esNOS, or type III)，主要存在於血管內皮細胞，和血管擴張有關。這兩種酵素為鈣離子依賴型 (Ca 2+. -dependent)，其活性需要鈣離子濃度的變化來調節(Nathan &. Xie, 1994)。另一種誘導型的一氧化氮合成酶(iNOS or type II)，則須由 endotoxin、proinflammatory cytokine，例如 TNF-、IL-1 和 IFN- 等，以及各種訊息傳導來誘導產生，其活性不需依賴鈣離子和 calmodulin 的存在，為非鈣離子依賴型 (Ca 2+. -independent)酵素，主要是以轉錄因子(transcription factor)來. 調節其酵素產生(Kleinert et al., 2004)。通常基本型一氧化氮合成酶只能在短時間且少量釋放一氧化氮，但誘導型一氧化氮合成酶卻能長時間且產生大量的一氧化氮(Nathan & Xie, 1994)。動脈粥狀硬化損傷發的發炎部位常伴隨誘導型一氧化氮. 16.

(17) 合成酶活性及表現的增加，同時也增加一氧化氮代謝產物過氧亞硝基物(peroxynitrite, ONOO-)的產生。過氧亞硝基物是一氧化氮與超氧化物反應所形成的產物，具有細胞毒性，也可以經由誘發低密度脂蛋白(LDL)氧化、促進血小板凝集作用，進而促進粥狀動脈硬化的病程(Radomski & Salas, 1995) (Buttery et al., 1996)。. (五) 細胞外基質與基質金屬蛋白水解酶細胞外基質(extracellular matrix)由許多種不同的大分子基質蛋白包括膠原蛋白(collagen)、彈性蛋白(elastin)、醣蛋白 (glycoprotein)以及蛋白醣類(proteoglycan)所組成，在動脈壁提供支持以及伸展彈性。在動脈粥狀硬化病程中，細胞外基質的分解和產生不只影響動脈粥狀硬化部位血管的重塑(remodling) 以及纖維斑塊 (fibrous plaque) 的形成，也在細胞的遷徙 (migration) 和增生 (proliferation) ，脂蛋白滯留 (lipoprotein retention) 以及血栓 (thrombosis) 的形成扮演很重要的角色 (Katsuda & Kaji, 2003) 。基質金屬蛋白水解酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一種含鋅離子(zinc ion) 的蛋白質酵素，並有水解細胞外基質蛋. 17.

(18) 白(extracellular matrix proteins )的能力 (Kotra et al., 2001)。其活性可以由未活化基質金屬蛋白水解酶的轉錄及合成、後轉譯活化(posttranslational activation)以及組織基質金屬蛋白水解酶抑制蛋白(tissue inhibitors of metalloproteinase, TIMPs)的作用來調節。目前已經有28種基質金屬蛋白水解酶被識別出來，並且依其催化水解的受質分為五類 :gelatinase 、 stromelysins 、 membrane-bound enzymes以及collangenase與其他類，特定的金屬蛋白水解酶由特定的細胞所分泌而出現在不同的組織中。其中 gelatinase B(MMP-9) 可以由巨噬細胞演變的泡沫細胞 (macrophage foam cell)和血管平滑肌細胞(smooth muscle cell) 所分泌(Katsuda & Kaji, 2003)，在動脈粥狀硬化的部位被發現有大量的表現(Brown et al., 1995)。目前認為基質金屬蛋白酶的活化對動脈粥狀硬化而言會造成斑塊的破裂對動脈粥狀硬化病程有不良的影響(Galis et al., 1994)。. ( 六 ) 脂多醣體 (Lipopolysaccharide ， LPS) 和丙型干擾素 (interferon- ,IFN- ) 脂多醣體(Lipopolysaccharide, LPS)或稱為細菌性內毒素 (endotoxin)，位於革蘭氏陰性菌(Gram-negative)之細胞壁上，是. 18.

(19) 最早發現與發炎反應有關成分之一。其主要結構可分為兩部分，分別為 lipid A 與多醣(polysaccharide)，而 lipid A 為 LPS 的重要毒性來源(Erridge C et al., 2002)。目前已知與 LPS 相關的訊息傳遞分子有三個，分別為 CD14、Toll-like receptor 4(LTR4) 與 myeloid differentiation protein-2(MD-2)。當細胞受到 LPS 刺激時，LPS 便會與 LPS-binding protein(LBP)在 plasma 中結合，並且第一時間被細胞表面的 CD14 吸引，然後與 TLR4 和 coreceptor MD-2 結合(Chow et al., 1999)，接著再刺激 adaptor molecule MyD88 啟動一連串的訊息傳遞，最後便活化轉錄因子，進行基因的轉錄及轉譯作用(Sato et al., 2004)。細胞激素 interferon family 可以分為 type I 及 type II。而 IFN- 則是 Type II 的唯一成員。在免疫反應中 IFN- 的產生是由抗原呈現細胞(antigen-presenting cells)經由分泌細胞激素例如 IL-12 和 IL-18 所調控，而 IFN- 則主要是由自然殺手細胞 (natural killer cells) 和活化的 T 型淋巴細胞 (activated T-lymphocytes, CD4+ Th1 cells)所分泌。IFN- 具有多種的生理功能並在免疫反應中扮演重要的角色。在 IFN- 基因的基因剔除鼠中，沒有肉眼可見的缺陷，但是極易受到細菌和病毒的感染。IFN- 還可以刺激抗原的呈現；活化巨噬細胞、T 型淋巴細. 19.

(20) 胞及自然殺手細胞；藉由增加貼附分子(adhesion molecules)的表現吸引細胞聚集到受傷部位；影響細胞增生、分化、及凋亡。而這些反應在動脈粥狀硬化中均具有重要的影響(Harvey & Ramji, 2005)。. (七)穿心蓮內酯(Andrographolide) 穿心蓮內酯 andrographolide ，分子式 C20H30O5 ，分子量 :350.45 ，結構式為： (3-(2-(decahydro-6-hydroxy-5(hydroxymethyl)-5,8a-dimethyl-2-methylene-1-napthalenyl)ethyli dene)dihydro-4-hydroxy-2(3H)-furanone). (Figure. 1) 。是. Andrographis paniculata 的主要有效成分之一。A. paniculata 在印度、中國與越南是被廣泛使用的傳統中草藥物。萃取物含有廣範圍的生物活性，在臨床治療方面，針對抗菌、抗病毒(Chang et al., 1991, Calabrese et al., 2000)、抗發炎(ShenChen & Chiou, 2002)、免疫促進(Puri et al., 1993)、肝保護性(Kapil et al., 1993)、降低血糖(Zhang, 2000)以及抗細胞凋亡(Chen et al., 2004) 等作用。而萃取物目前臨床應用在一般的流行性感冒，主要用來減輕流行性和症狀強度。 Andrographolide 針對抗發炎有非常高的活性(Shen et al.,. 20.

(21) 2000)，因此本次實驗中將 andrographolide 使用在血管平滑肌細胞上，探討 andrographolide 對 LPS 與 IFN- 合併誘導血管平滑肌細胞發炎的抑制作用及藥理機轉，且經由氣球擴張術引發血管內膜增生的大鼠動物模式直接觀察 andrographolide 對血管內膜不正常增生的影響。. 21.

(22) 貳、材料與方法 (Material and Method). 一、實驗試藥 andrographolide (3-(2-(decahydro-6-hydroxy-5(hydroxymethyl)-5,8a-dimethyl-2-methylene-1-napthalenyl)ethyli dene)dihydro-4-hydroxy-2(3H)-furanone). 二、實驗動物雄性大鼠 (Wistar品系，來自樂斯科生物科技公司). 三、實驗細胞大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(源自Wistar品系的雄性大鼠). 四、實驗藥品 1. 下列藥品為Amersham公司之產品: protein molecular weight marker (RPN 756) protein molecular weight marker (RPN 800) triton X-100 2. 下列藥品為Amersham Life Science公司之產品: sodium dodecylsulfate (SDS) tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris-base)、. 22.

(23) 3. 下列藥品為Bio-Rad公司之產品: ammonium persulsate (APS) protein assay dye reagent concentrate 4. 下列藥品為Gibco BRL公司之產品: amphotericin B (Fungizone) du be c c o’ smodi f i e de a gl eme di um( DMEM) porcine elastase fetal bovine serum (FBS) hanks balanced salt solution (HBSS) penicillin/ streptomycin/ L-glutamine sodium pyruvate tryphane blue stain trypsin-EDTA 5. 下列藥品為Invitrogen公司之產品: Lipofectamine TM 2000 6. 下列藥品為Mallinckrodt Baker公司之產品: acetic acid (glacial) calcium chloride ethanol HEPES methanol 23.

(24) sodium hydrogen carbonate 7. 下列藥品為MDBio Inc.公司之產品: 40% acrylamide/Bis solution DNA markers TBE solution 5X 8. 下列藥品為Peprotech Inc.公司之產品: recombinant rat interferon- 9. 下列藥品為Pharmacia biotech公司之產品: glycerol N, N, N, N,-tetramethyllethylethylenediamine (TEMED) polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween 20) 10.下列藥品為Sigma 公司之產品: aprotinin albumin, human bovine serum albumin (BSA) mercaptoethanol coomassie brilliant blue collagenase Ⅰ collagenase Ⅱ dimethyl sulfoxide (DMSO) dithiothreitol (DTT) 24.

(25) ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA．2Na) leupetin tetrazolium dye 3- (4, 5- dimethylthiazol- 2- yl) -2, 5 diphenyltetrazolium bromide (MTT) peptastatin p-phenlenediamine phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) sodium orthovanadate sodium pyrophosphate 11.下列藥品為Wako公司之產品: chloroform paraformaldehyde 12.下列藥品為其他公司之產品: 2-propanol (Showa) EtBr: ethidium bromide (BDH) gelatin (Kanto, Japan) sodium fluoride (Fluka). 五、套組試劑 (Kit)  enhanced. chemiluminescence. (ECL). western. blotting. detection reagent 25.

(26)  NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents (PIERCE, USA)  Nitrate/Nitrite colorimetric assay kit (Cayman CHEMICAL, USA)  SUPERSCRIPT One-step RT-PCR with PLATIUM Taq (Invitrogen, USA)  Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). 六、抗體 (Antibody)  -tubulin mouse monoclonal antibody (Neomarkers, USA)  iNOS rabbit monoclonal antibody (Santa cruz, USA)  IBrabbit monoclonal antibody (Cell Signaling, USA)  MMP-9 mouse monoclonal antibody (Neomarkers, USA)  NF-B p65 mouse monoclonal antibody (Santa cruz, USA)  phospho-NF-B p65 (Ser 536) rabbit polyclonal antibody (Cell signaling, USA)  phospho-IB-(Ser32/36) mouse monoclonal antibody (Cell Signaling, USA)  Lamin B1 (H-90) rabbit polyclonal antibody (Santa cruz, USA)  anti-mouse Ig, HRP linked whole antibody (Amersham, USA) 26.

(27)  anti-rabbit Ig, HRP linked whole antibody (Amersham, USA). 七、引子(Primer) 購自生工(MDBio Inc.)公司 iNOS sense: 5’ -ACCTACTTCCTGGACATCAC-3’ iNOS antisense: 5’ -ACCCAAACACCAAGGTCA TG-3’ GAPDH sense: 5’ -GCCGCCTGGTCACCAGGGCTG-3’ GAPDH antisense: 5’ -ATGGACTGTGGTCATGAGCCC-3’ Consensus NF-B promoter: 5’ -AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG-3’. 八、耗材  Biodyne® B Precut Nylon Membranes (PIERCE, USA)  blotting paper (Amersham, USA)  cassette (Okamoto, Japan)  developer and replenisher (Kodak, USA) 27.

(28)  fixer and replenisher (Kodak, USA)  polyvinylidene fluoride microporous membrane (PVDF; Hybond-P, Amersham, USA)  scientific imaging film (Kodak, USA)  10 cm dish、6 cm dish、6 well plates and 24 well plates、等細胞培養耗材(Costar, USA or Orange, Europe)  15 ml 離心管、50 ml 離心管、eppendorf、96 well-ELISA plates、cuvette 及 0.2 ml 薄壁微量 PCR 管等實驗耗材 (Corning , USA)  18 G 針頭、5 ml 針筒、1 ml 針筒附針頭(TERUMO, Japan)  0.22 m filter Millipore Express PLUS (PES) (Millipore, USA)  mini-osmotic pump model 2002(alzet○, USA) R.  fogarty arterial embilectomy catheter 2F (Edward Lifesciences, USA)  nylon suture (UNIK, Taiwan). 九、實驗方法 1. 大鼠血管平滑肌細胞初代培養. 28.

(29) 將 male Wistar rat (250-300 g)，以 choloral hydrate (4 mg/kg) 麻醉並斷頸後，從頸部放血，迅速剪開胸腔，取出胸主動脈 (thoracic aorta)放入 HBSS 溶液中(每毫升含有 penicillin 50 g， streptozotocin 50 g，neomycin 100 g，amphotericin B 0.25 g，不含 CaCl2 和 MgCl2 )，並以 HBSS 清洗血管四次後以小剪清除血管表面結締組織，放入裝有 2-3 ml collagenase type I (2 mg/ml) 的插管離心管中。灌入 O2 於 37 ° C digest 30 分鐘後去除 adventia tissue，將血管剪成四段置於加入 10% FBS 的 DMEM 培養液中 overnight。隔天將血管剪碎，放入加入 collagenase type II (2 mg/ml)和 porcine elastase (1 mg/ml) 各 1 ml 的溶液中，灌入 O2 於 37 ° C digest 一小時，之後加入 10% FBS 的 DMEM 終止反應再以 18G 針頭以及 5 ml 針筒吸取細胞液通過篩網去除碎屑離心十分鐘後，吸掉上清液，移置 35 mm 培養皿。以 DMEM 為培養液，外加 10 % FBS、4 mM glutamine、100 IU/ml penicillin、100 g/ml streptomycin 和 0.25 g/ml amphotericin B 置於 37 ° C 恆溫箱(incubator)通以氣體(95 % air- 5 % CO2) ，隔天換新鮮培養液，待長滿後移至 10 cm 培養皿，之後每兩天換一次培養液，約四天後長至 90 % confluent，即可再繼代培養或用來作實驗。. 29.

(30) 2. 大鼠血管平滑肌細胞繼代培養大鼠血管平滑肌細胞培養於 10 cm 培養皿中待細胞長滿後，移去培養液，用 PBS 清洗細胞後移去 PBS，加入 1.5 ml 胰蛋白酶( 0.05 % trypsin - 0.53 mM EDTA‧4Na )於 37° C 下作用 3 分鐘，吸除酵素液，加入 10 ml DMEM 沖下細胞，以轉速 850 rpm (140 x g)，25 ° C 離心七分鐘，吸除上清液後加入適量 10 % FBS/ DMEM，以 1: 3 稀釋比例繼代培養，由第四代到第八代之血管平滑肌細胞供作實驗用途。. 3. 血管平滑肌細胞存活率之測定利用 MTT 試劑來測定血管平滑肌細胞的存活率 (viability)。將正常培養的血管平滑肌細胞取下，將定量的細胞 (1×105 cells/ml)種於 24 wells 的培養盤中，以含有 10 % FBS 的 DMEM 培養液加以培養，接著置入培養箱中，讓細胞生長 24 小時後，將培養液換成不含 FBS 的 DMEM 培養液，分別給以不同濃度的 andrographolide 20 分鐘後，再加入 LPS (50 g/ml) 和 IFN-(100 unit/ml) ，置入培養箱 24 小時後，加入 0.5 mg/ml MTT，於 37° C 作用 2 小時，再加入 100% dimethyl sulfoxide. 30.

(31) (DMSO) 300l 到每個 well 中，稍微混合後，於室溫下避光輕搖 20 分鐘，待 well 內殘餘細胞溶解完全後，再從每 well 取出 200 l 置入 96 wells ELISA plate，接著用酵素免疫分析儀(MRX microplate reader, USA)以 550 nm 之波長偵測每一個 well 之吸光值。此實驗目的在測試 andrographolide 是否能影響大鼠平滑肌細胞的存活率，利用細胞中粒線體酵素將 MTT 試劑還原成 formazan 紫色結晶，再用 DMSO 將結晶溶解，即藉由細胞之代謝活性來作為細胞是否存活之依據，而測得之吸光值即等於相對的細胞數目，故細胞數越多其吸光值越高。而存活百分率之運算如下: 加藥處理之吸光值 × 100%. 未加藥處理之吸光值 4. 一氧化氮含量測定吸取實驗處理後的細胞上清液 80 l 置於 96 well plate 中，分別加入 10 l cofactor 以及 10 l reductase 於每 well 中，於室溫下避光作用一小時後使培養液中 nitrate 還原成為 nitrite。之後加入 50 l Griess reagent A (含 sulfanilamide) 以及 50 l Griess reagent B (含 N-(1-Naphthyl)ethylenediamine) 於室溫下作用 10 分鐘後，產生 Azo product 後利用 microplate reader 以. 31.

(32) 550 nm 波長測量其吸光值。. 5. 細胞內蛋白質分離與定量(Intracelluar protein isolation and quantity) 將實驗處理後之細胞，以外加 protease inhibitor (10 g/ml aprotein 、 1 mM PMSF 和 10 g/ml leupeptin) 及 2 mM dithiothreitol (DTT) 之 lysis buffer (50 mM HEPES、5 mM EDTA·2 Na 、50 mM NaCl 與 1% Triton X-100)將細胞溶破， 4℃下靜置 30 分鐘，每 10 分鐘 vortex 15 秒，隨後以 4℃轉速 12000 g 離心 20 分鐘，取上清液，定量蛋白質。若進行有關 IB-、MAPKs 等磷酸化蛋白質之測定時，其 lysis buffer 則必須再多加入 phosphatase inhibitor (10 mM sodium fluoride、1 mM sodium orthoranadate 和 5 mM sodium pyrophosphate)。蛋白質定量時，先取 2 mg/ml 之 albumin bovine (BSA)以二次水分別稀釋成濃度為 5 g/ml、10 g/ml、15 g/ml、20 g/ml、25 g/ml，做為 standard。並取蛋白質樣品 5 l 與二次水 395 l 充分混合。靜置十分鐘後，連同標準品全數加入 100 l dye reagent concentrate (Bio-Rad)充分混合，再靜置十分鐘後，取 200 l 至 96 well-ELISA plates ，用酵素免疫分析儀 (MRX microplate. 32.

(33) reader, USA)以 550 nm 之波長偵測每一個 well 之吸光值。所得之吸光值以線性迴歸方式換算成濃度，測定後，樣品分裝保存於-80℃以備用。. 6. 西方點墨法 (Western blotting) 將實驗處理後取得之以定量之細胞內蛋白質成分以5：1的體積比例加入6 × sample loading dye (350 mM Tris-base、30 % glycerol、350 mM SDS、175 M bromophenol blue、600 mM DTT 調為pH 6.8)充分混勻，並在95 °C加熱約5分鐘，使蛋白質 denature後，快速置於冰上至少5分鐘，以避免回溫過程中酵素影響蛋白質表現，最後在4 °C下以轉速2000 g離心5分鐘後備用。再以不同百分比的 SDS gel 於 running buffer (25 mM Tris-base, 192 mM glycerol, 0.1 % SDS, pH 8.3)下，以120 V/80 mA 進行電泳分離。隨後將膠片置於 transfer buffer (1 M Tris-base, 20 % methanol, 150 mM glycine, pH 8.3)下，以40 V/300 mA 進行電泳轉漬3小時，使膠片上之蛋白質轉移至 polyvinylidene. fluoride. microporous. membrane. (PVDF;. Hybond-P)表面，隨後將轉漬膜浸潤在4 °C的blocking buffer (5 % non-fat milk, 10 mM Tris-base, 100 mM NaCl, 0.1 % Tween 20, 33.

(34) pH 7.5)中，搖晃40分鐘後，以TBST (10 mM Tris-base, 100 mM NaCl, 0.1 % Tween 20, pH 7.5 ) 清洗轉漬膜四次，每次7分鐘，之後加入一級抗體(primary antibody)，於室溫下搖晃作用2小時。再用TBST清洗轉漬膜四次，每次7分鐘，之後再加入標記有 horseradish peroxidase (HRP) 的二級抗體 (secondary antibody)，於室溫下反應1小時，再以TBST清洗轉漬膜四次，每次7分鐘。最後使用冷光反應劑enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting detection reagent 使底片感光，以偵測蛋白質的表現情形。最後將成像後的底片掃描輸入電腦，以影像分析軟體(Bio-1D version 99)作分析處理。. 7. 電泳酵素分析法 (SDS-PAGE Zymography) 在冰上收集實驗處理後之細胞培養液進行實驗。將實驗處理後取得之細胞培養液以1：2的體積比例加入sample loading dye (500 mM Tris-HCl、25 % glycerol、10 % SDS和0.32 % bromophenol blue 調成 pH 6.8) 充分混勻，再以 10 % polyacrylamide gel (含1 % gelatin)於running buffer (25 mM Tris-base、192 mM glycerol和0.1 % SDS調成pH 8.3)下，以125 V/40 mA進行電泳分離。分離後之膠片再以2.5 % Triton X-100. 34.

(35) 於室溫下洗滌兩次後，把膠片置於 reacting buffer (50 mM Tris-base、200 mM NaCl、5 mM CaCl2和0.02 % Brij 35調成pH 7.5)中，在37℃的恆溫箱內反應72小時，之後再以fixing solution (7 % acetic acid和40 % methanol)固定蛋白質於膠片上30分鐘。接著以Brilliant Blue G-Colloidal染色使膠片呈色均勻，並以 destain solution (10 % acetic acid與25 % methanol)做去色處理，使結果達到最佳化。最後將膠片置於影像分析系統 (Vilber Lourmat, France)，以CCD拍攝並將圖檔存入磁片中，再將磁片所存之影像於電腦中以影像分析軟體(Bio-1D version 99)做分析處理。以resting group亮度當作1，其餘band之亮度以其相對倍數表現之。. 8. RNA 萃取與定量(RNA extract and quantity ). 將實驗處理過後的細胞吸除上清液，接著加入 1 ml TRIzol reagent (total RNA isolation reagent, Invitrogen)，用 scraper 將細胞刮下後快速移至 1.5 ml eppendorf 中，室溫下靜置 5 分鐘待細胞溶解後，以 4℃轉速 12000 g 離心 10 分鐘。離心後，取出 900 l 上清液到新的 eppendorf，靜置 5 分鐘後，每管加入 200 l. 35.

(36) chloroform，劇烈搖盪 15 秒後置於室溫下 3 分鐘。接下來在 4℃ 下轉速 10500 g 離心 15 分鐘。離心後，小心吸取上清液至新的 eppendof 中，並加入 0.5 ml 的 isopropyl alcohol 於室溫下靜置 10 分鐘，使 RNA 析出，再以 4℃轉速 10500g 離心 10 分鐘。離心後，將上清液去除，留住管底的凝膠樣沉澱物(gel-like pellet)。再加入 1 ml 75 %之酒精(以 0.01 % DEPC-H2O 及 99.5 % 無水酒精配製)清洗凝膠樣沉澱物。將每管輕微振盪後，再以 4℃轉速 7100 g 離心 5 分鐘。離心後立刻風乾凝膠樣沉澱物 30 分鐘，再以 70 l DEPC-H2O 溶解 RNA。取少量至 microcuvette 中，用 GeneQuant Pro 分析儀以 260/280 nm 之波長來偵測樣品之純度及濃度。測定後將 RNA 溶液分裝置於-80℃中保存備用。保存時間不超過三天。. 9. 反轉錄 - 聚合酵素連鎖反應 (Reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR). 利用 Super Script One-Step RT-PCR with PLATINUN Taq (Invitrogen)之套組，依照說明書指示進行 RT-PCR 實驗。將說明書所列之 reagents 依序加入至 0.2 ml 已滅過菌之. 36.

(37) pre-chilled 薄壁微量 PCR 反應管，過程均在冰上操作，輕微 vortex 混合均勻，然後在冰上輕敲，使 vortex 時沾於管壁上的 sample 沉降，最後置入 PCR 反應器(GeneAmpR PCR System 2400)中依照下列的反應條件來進行 RT-PCR： (1) cDNA 的反轉錄合成  iNOS : 50℃，30 分鐘 94℃，2 分鐘  GAPDH : 50℃，30 分鐘 94℃，2 分鐘 (2) PCR amplification (放大)  iNOS: 94℃，15 秒 → 55℃，30 秒 → 7 2 ℃，1 分鐘總反應 30 cycles  GAPDH : 94℃，15 秒 → 62℃，30 秒 → 72 ℃，1 分鐘總反應 30 cycles (3) Final extension iNOS、GAPDH 皆以相同的條件。 72℃，5 分鐘 → 讓最後一個 cycle 的 cDNA 完成降到 4℃ → 避免 cDNA 降解最後將 cDNA 存放於-80℃直到用於實驗，保存時間不超. 37.

(38) 過一個禮拜。. 10. 膠體電泳(Agarose gel electrophoresis). 實驗處理後取得放大之 cDNA 產物以 4 : 1 的體積比例加入 5 倍 sample loading dye (25 % glycerol 和 0.25 % bromophenol blue)充分混合均勻，將每一管 sample loading 在 1.5 % Agarose gel (含 0.5 g/ml ethidium bromide，具螢光染色 cDNA 之能力)，於 0.5 % TBE buffer 下，以 150 V/33 mA 條件進行電泳分離。 GAPDH 與 iNOS 之 mRNA 經由反轉錄後之 cDNA 分別為 598 bp 與 552 bp。最後將膠片置於影像分析系統(Vilber Lourmat， France)，以 CCD 拍攝並將圖檔存入磁片中，再將磁片所存之影像於電腦中以影像分析軟體(Bio-1D version 99)進行影像分析處理。iNOS 之 cDNA 相對含量需先以 GAPDH 做適當校正，實驗結果的表示以相對此數值表示。. 11. 細胞核內及核外蛋白質分離與定量 (Nuclear extracts preparation，NE-PERTM). 將定量的大鼠血管平滑肌細胞種植於 10 cm dish 中直到 38.

(39) 80%-90%confluent (packed cell volume (PCV)大約 20 l)，經過實驗處理後，去除上清液，加入胰蛋白酶並以 10 ml cold-PBS 將血管平滑肌細胞小心沖下清洗移至 pre-chilled 15 ml 離心管，然後在 4 ℃下以轉速 150 g 離心 7 分鐘。離心後，去除上清液並盡量吸乾，再加入 100 l ice-cold CER-I，避免使用 pipet 造成細胞核破裂而用高速震盪儀以最高速震盪 15 秒直到 pellet 完全 resuspend，置於冰上 10 分鐘後加入 5.5 l CER II，使用高速震盪儀以最高速震盪 5 秒後置於冰上 1 分鐘後再以最高速震盪五秒後以 16,000 x g 離心 5 分鐘。離心後，上清液即為 cytoplasmic extracts。將上清液移出後，以無塵紙完全去除液體部分，再加入 100 l ice-cold NER，每 10 分鐘 vortex 15 秒，總共 40 分鐘，然後在 4℃下以轉速 16,000 x g 離心 10 分鐘，上清液即為 nuclear extracts 。最後將上清液分裝到一新的 pre-chilled eppendorf 並保存於－80℃。保存時間不超過一個禮拜。. 12. 電泳移動偏向分析法 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA). 39.

(40) 將 NE-PER kit 所抽離之細胞核內 sample 做好蛋白質定量後，取 2 ~ 4 g 做 Protein-DNA 結合反應實驗。有標定 biotin DNA 之最終濃度為 5 nM；而另外再使用未標定(又稱 cold)之高濃度(200 倍)DNA 作為標定 DNA 之競爭劑以做對照，證明所使用之 DNA 序列其品質固定且與產生位移(shift)之 protein 為專一性結合。依照 LightShiftR Chemiluminescent EMSA Kit 內之流程步驟加入各試劑並反應 20 min 後，以 6 % polyacrylamide gel 於 TBE buffer 下，以 100 V/15 mA 進行電泳分離。隨後將膠片置於 TBE buffer 中，以 100 V/380 mA 進行電泳轉漬 45 分鐘，使膠片上之蛋白質轉移至 nylon membranes 表面，隨後再依照 kit 流程指示處理 membrane 後使用其 Luminol /Enhancer solution 及 Stable Peroxidase solution 之等比例混和液來使底片感光，以用來偵測位移後蛋白質量的表現情形；位移之蛋白質表現量愈多，代表核內活化之轉錄因子(transcription factor)表現愈強。最後將成像後的底片掃瞄輸入電腦，以影像分析軟體(Bio-1D version 99)做分析處理。以刺激劑亮度當作 1，其餘 band 之亮度以其相對倍數表現之。. 13. 冷光報導基因表現分析實驗 (Luminometric reporter gene. 40.

(41) analysis assay) 將大鼠血管平滑肌細胞以 4 × 105 cell/well 種入 6-well 培養盤中，讓細胞生長直到 80-90% confluent 後，按照 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)內容所建議之用法以及計量與將本實驗採用的質體: pNF-B-Luc (5.0 kb)以及 control plasmid: pRL-TK (4045 bp)於 DMEM 培養液中反應四十分鐘。在包覆完成後將含 lipofectamine 包覆載體的培養液與細胞反應四小時，之後將培養液吸除加入含有藥物的培養液進行實驗，經實驗處理後的細胞在反應十二小時之後，使用 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)處理以分析細胞發出的冷光值，firefly luciferase 冷光值代表 NF-B signal 活化的程度，而 renilla luciferase 則用來當作平衡 transfection 效率的 control。. 14. 頸動脈氣球擴張術引起血管內皮細胞受損及頸動脈血管取得方法動物準備完成後，剔除手術部位之皮毛，自頸部中線剪開肌肉，將左側頸動脈暴露出來，做一血管造口。將動脈氣球擴張導管 (2F Arterial embolectomy catheter, Baxter Healthcare Corp., U.S.A.)由頸動脈造口處插入，穿過頸動脈至主動脈弓. 41.

(42) 處，將氣球擴張三十秒後放鬆，反覆進行三次，以引起血管內皮細胞的受損。充氣擴張完畢後，將動脈氣球擴張導管取出，血管造口以帶勾外科手術縫線(8-0 Dermalon購自Davis+Geck Wayne, U.S.A.)縫合肌肉及外皮傷口。在給予andrgrapholide藥物的實驗組中，同時將osmotic pump放置於大白鼠的背部皮下。大白鼠在14天實驗期間結束後，大白鼠先以40% chloral hydrate腹腔注射麻醉後，將腹腔沿中線剪開。再將大白鼠橫膈膜剪開、沿兩側肋骨剪斷、胸骨柄剪斷，使心臟暴露出來。由左心室以PBS灌流(PBS，單位為 mM：NaCl 137、Na2HPO4 8.1、 KCl 2.7、KH2PO4 1.5，PH 7.4)，直到全身血液被灌流完畢。再以2.5 ％ glutaraldehyde及2 ％ paraformaldehyde混於PBS中為固定液(fixative)進行灌流固定。取下大白鼠頸動脈由血管造口處置主動脈弓之血管段，除去周圍的脂肪及結締組織，泡入固定液中，於4 °C下保存。. 15. 內置式迷你滲透壓幫浦的植入於大鼠頸動脈進行氣球擴張術的同時進行內置式迷你滲透壓幫浦的植入，作為實驗進行期間的給藥途徑。將老鼠背部的皮毛剃除後剪開表面皮膚，以蚊式夾撐開皮下組織，將裝有. 42.

(43) 藥物之迷你滲透壓幫浦(mini-osmotic pump, model 2002, Alzat Corp., USA)植入皮下組織中。在實驗進行之兩個星期期間，以 0.5 l/hr的速率持續釋放藥物，直到實驗結束。. 16. 受傷血管之光學顯微鏡觀觀察將固定好之血管橫斷(cross-section)切成1公分的血管段；用ethanol及xylene進行脫水；包埋於59 ° C的paraffin包埋液之中，進行組織切片；將切成 5 m 厚度的標本片；以 Hematoxylin-Eosin(H＆E)進行染色，進行標本片的觀察與組織分析。. 17. 統計分析所有資料皆以實驗數據之平均值 ± 標準誤差(means ± S.E.M.)表示。在One Way ANOVA統計有意義的情況下進行 Student Newman-Keuls test比較作為統計分析，以P值< 0.05 表示有意義之差異。. 43.

(44) 參、結果 (Result) 一、Andrographolide 對大鼠血管平滑肌細胞的細胞毒性評估本實驗利用MTT assay來測定藥物對於細胞存活率之影響。由於本實驗在於探討andrographolide對於血管平滑肌細胞之抗發炎作用，故先以MTT assay測量andrographolide在實驗濃度下對細胞存活率之影響。結果發現給予andrographolide在實驗濃度 20 M 以及 50 M，與未給予藥物之控制組(細胞存活率 100 ± 0.00%) 相較，細胞存活率並無統計上之差異 ( 給予 andrographolide 20 M 組 , 細胞存活率 100 ± 8.81% ；給予 andrographolide 50 M組, 細胞存活率104±5.00%)。而給予實驗用之刺激劑LPS (50 g/ml)與IFN-  (100 unit/ml)組與未加藥物控制組相較，細胞存活率並無明顯變化(96.18± 3.66%)。而於刺激劑給予 20 分鐘前加入實驗所用之不同濃度的 andrographolide，細胞的存活率與未加藥物控制組相較，亦無統計上之差異(給予andrographolide 20 M組，細胞存活率 111.21±8.97%；給予andrographolide 50 M組，細胞存活率91.57 ±6.96%) 因此，本實驗條件下所使用之andrographolide濃度，對於大鼠血管平滑肌細胞皆不具嚴重毒性反應(n=3) (Figure 2)。. 44.

(45) 二、探討andrographolide對於LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞釋出一氧化氮之影響當血管平滑肌細胞以 LPS 與 IFN- 刺激時，產生發炎反應刺激誘發釋放出一氧化氮(nitric oxide, NO)，而過多的一氧化氮則會和增加其代謝產物，產生具有強氧化力的過氧亞硝基物 (peroxynitrite, ONOO-)，而造成細胞傷害。本實驗是要探討 andrographolide 是否能抑制 LPS 與 IFN- 刺激時所產生之相關發炎介質例如一氧化氮之生成。一氧化氮在產生後會被氧化為亞硝酸離子(NO2-)以及硝酸離子(NO3-)，所以我們將硝酸離子還原成為亞硝酸離子後，利用測定亞硝酸離子的含量來表示一氧化氮的產量。種於 6 cm dish 中的血管平滑肌細胞在 80-90% confluent 狀態下給予不同濃度的 andrographolide (20 and 50 M) 20 分鐘之後，再以 LPS (50 g/ml)與 IFN-  (100 unit/ml)刺激並培養 24 小時後，取其上清液測量亞硝酸離子的含量。發現在未加刺激劑及藥物的情形下，細胞上清液中有低濃度的亞硝酸離子(0.36± 0.04 M)，而在給予刺激劑之後上清液中亞硝酸離子的濃度有意義的上升. (5.87 ± 1.06 M) ，而在給予不同濃度的. andrographolide 的血管平滑肌細胞的上清液中，亞硝酸離子的. 45.

(46) 含量隨著 andrographolide 的濃度增加而有意義的下降 (給予 andrographolide 20 M 組其細胞釋放 NO 濃度 1.95±0.19 M；給予 andrographolide 50 M 組其細胞釋放 NO 濃度 0.76±0.18 M)。表示 andrographolide 在血管平滑肌細胞中，可以有意義且濃度相關性的降低 LPS 與 IFN- 刺激所產生的一氧化氮釋出 (n=4) (Figure 3)。. 三、探討andrographolide對於LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞iNOS之表現影響先前的實驗已經證明 andrographolide 可以明顯且濃度相關的抑制血管平滑肌細胞在受到發炎刺激誘導產生的 NO 產生。為了進一步了解 andrographolide 是否經由抑誘導型一氧化氮合成酶之生成而抑制一氧化氮的生成，我們利用西方點墨法 (western blotting)測量細胞中 iNOS 蛋白質表現的變化。種於 6 cm dish 中的血管平滑肌細胞在 80-90% confluent 狀態下給予不同濃度的 andrographolide (20 and 50 M) 20 分鐘之後，再以 LPS 與 IFN- 刺激並培養 24 小時後，測量其細胞中誘導型一氧化氮合成酶訊息蛋白質的含量，發現在未加刺激劑的血管平滑肌細胞中(resting group)，其血管平滑肌細胞蛋白質萃取物中只. 46.

(47) 偵測到非常微量的 130kD 之 iNOS 蛋白質相對表現量 (resting group, 1.00±0.00 fold)。而以 LPS (50 g/ml)與 IFN-  (100 unit/ml) 刺激 24 小時後，發現其中 iNOS 蛋白表現量有顯著的增加 (8.11±0.23 folds) 。在給予 andrographolide 並以 LPS 和 IFN- 刺激的血管平滑肌細胞中，隨著 andrographolide 濃度的增加， iNOS 的蛋白表現量也逐漸降低，且統計上有顯著的差異性 (給予 andrographolide 20 M 組其 iNOS 蛋白質表現程度為 4.80±0.16 folds；給予 andrographolide 50 M 組其 iNOS 蛋白質表現程度為 3.93±0.55 folds) (n=4) (Figure 4)。. 四、探討andrographolide對於LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞iNOS之mRNA表現影響接下來我們更進一步探討 andrographolide 是否會影響誘導型一氧化氮合成酶之訊息核糖核酸之產生。種於 6 cm dish 中的血管平滑肌細胞在 80-90% confluent 狀態下給予不同濃度的 andrographolide (20 and 50 M) 20 分鐘之後，再以 LPS 與 IFN- 刺激並培養 12 小時後，利用反轉錄-聚合酵素連鎖反應測量細胞中誘導型一氧化氮合成酶之訊息核糖核酸之含量，發現相較於未給予藥物之控制組(resting group, 1.00±0.00 fold)，給予實驗. 47.

(48) 用的刺激劑後，細胞中誘導型一氧化氮合成酶之訊息核糖核酸大量且有意義的產生 (22.29±3.01 folds) ，而在給予 andrographolide (20 and 50 M)的細胞組，相較於給予刺激劑的細胞 iNOS mRNA 的產生則是有意義並且濃度相關的下降(給予 andrographolide 20 M 組其 iNOS mRNA 表現程度為 15.50±0.46 folds；給予 andrographolide 50 M 組其 iNOS mRNA 表現程度為 4.15±0.79 folds) (n=2) (Figure 5) 。. 五、探討andrographolide對於LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞基質金屬蛋白水解酶 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)活性表現之影響當血管平滑肌細胞以 LPS 與 IFN- 刺激時，會產生發炎反應誘發基質金屬蛋白水解酶產生，而誘導型一氧化氮合成酶的表現(inducible nitric oxide synthase, iNOS)進而釋放出的一氧化氮(nitric oxide, NO)，在之前的研究中也指出會增加基質蛋白水解酶的表現。本實驗在於探討 andrographolide 對於基質金屬蛋白水解酶活性以及蛋白質生成量之影響。種於6 cm dish中的血管平滑肌細胞在80-90% confluent狀態下給予不同濃度的andrographolide (20 and 50 M) 20分鐘之. 48.

(49) 後，再以LPS與IFN- 刺激並培養24小時後，測量其細胞上清液中，細胞釋出的基質金屬蛋白水解酶之活性。在血管平滑肌細胞當中MMP-2的活性表現是持續表現的，所以我們以MMP-2 的活性當作是loading control。在未加刺激劑與andrgrapholide的情形下(resting group)，其血管平滑肌細胞培養液中有較低的92 kD之MMP-9活性 (resting group, 1.00±0.00 fold)。而以LPS (50 g/ml)與IFN-(100 unit/ml)刺激24小時後，發現MMP-9的活性有顯著的增加 (4.49±0.90 folds)。在給予andrographolide並以 LPS和IFN- 刺激的血管平滑肌細胞中，隨著andrographolide濃度的增加，MMP-9的活性表現也逐漸降低，且統計上具有明顯差異性 (給予andrographolide 20 M組其MMP-9活性表現程度為2.51±0.69 folds；給予andrographolide 50 M組其MMP-9活性表現程度為1.56±0.38 folds) (n=3) (Figure6)。. 六、探討andrographolide對於LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞基質金屬蛋白水解酶 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)蛋白質表現之影響在之前的實驗當中發現 andrographolide 可以濃度相關的抑制基質金屬蛋白水解酶(MMP-9)之活性表現，在本實驗中我們 49.

(50) 則探討此抑制作用是否經由抑制血管平滑肌細胞中基質金屬蛋白水解酶(MMP-9)的蛋白質產生而來。將血管平滑肌細胞種於 6 cm dish 中，在 80-90% confluent 狀態下給予不同濃度的 andrographolide (20 and 50 M) 20 分鐘之後，再以 LPS 與 IFN- 刺激並培養 24 小時後，測量其細胞中基質金屬蛋白水解酶蛋白質的含量。在未加刺激劑與 andrgrapholide 的情形下(resting group)，其血管平滑肌細胞萃取物中只偵測到非常微量的 92 kD 之 MMP-9 蛋白相對表現量 (resting group, 1.00 fold)。而以 LPS (50 g/ml)與 IFN-(100 unit/ml)刺激 24 小時後，發現其中 MMP-9 蛋白表現量有顯著的增加(7.40 folds)。在給予 andrographolide 並以 LPS 和 IFN- 刺激的血管平滑肌細胞中，隨著 andrographolide 濃度的增加， MMP-9 的蛋白表現量也逐漸降低(給予 andrographolide 20 M 組其 MMP-9 蛋白質表現程度為 4.88 folds；給予 andrographolide 50 M 組其 MMP-9 蛋白質表現程度為 1.88 folds) (n=1) (Figure 7)。. 七、探討andrographolide對於LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞活化NF-B訊息路徑活化之作用. 50.

(51) 之前的實驗中發現 andrographolide 能有效抑制 LPS 及 IFN- 刺激生成之發炎介質例如抑誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)以及基質金屬蛋白水解酶(MMP-9)的生成。而過去的研究中發現誘導型一氧化氮合成酶 (iNOS) 以及基質金屬蛋白水解酶 (MMP-9)的生成與 nuclear factor-B(NF-B)此轉錄因子之活化有很大的關係(Hattori et al., 2001)(Bond et al., 2001)，所以我們進一步探討 andrographolide 是否是經由抑制 NF-B 路徑的活化而抑制誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)以及基質金屬蛋白水解酶(MMP-9)的生成。將大鼠血管平滑肌細胞以 4 × 105 cell/well 種入 6-well 培養盤中，讓細胞生長直到 80-90% confluent 後，按照 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)內容所建議之用法以及計量與將本實驗採用的質體: pNF-B-Luc (5.0 kb)以及 control plasmid: pRL-TK (4045 bp)於 DMEM 培養液中反應四十分鐘。在包覆完成後將含 lipofectamine 包覆載體的培養液與細胞反應四小時，之後將培養液吸除，加入含有不同濃度之 andrographolide (20 and 50 M)的培養液進行實驗，經實驗處理後的細胞在反應十二小時之後，使用 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)處理以分析細胞發出的冷光值，firefly luciferase 冷光值代表. 51.

(52) NF-B signal 活化的程度，而 renilla luciferase 則用來當作平衡 transfection 效率的 control。我們發現在未給予刺激劑的情況下，細胞內的 NF-B 路徑只有微弱的活化(resting group, 1.00±0.00 fold)。而在給予 LPS (50 g/ml)與 IFN-(100 unit/ml)刺激之細胞，NF-B 路徑則很有意義的被活化 (3.58±0.48 folds) 。而在給予不同濃度的 andrographolide 之後，NF-B 路徑之活化則有意義並濃度相關性的下降(給予 andrographolide 20 M 組其 NF-B 表現程度為 2.93±0.17 folds；給予 andrographolide 50 M 組其 NF-B 表現程度為 1.56±0.21 folds)。而 MG132 則是 proteasome 之抑制劑，抑制 NF-B 之抑制蛋白 IB-降解作用，作為 negative control (1.43±0.03 folds) (n=3) (Figure 8)。. 八、探討andrographolide對於LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞活化NF-B與consensus NF-B promoter結合之作用為了進一步確認 andrographolide 對於 LPS 與 IFN- 引起 NF-B 活化之抑制作用，接下來使用電泳移動偏向分析法 (electrophoretic mobility shift assay, EMSA)來確認。將血管平滑肌細胞種於 10 cm dish 中，在 80-90% confluent 狀態下給予不. 52.

(53) 同濃度的 andrographolide (20 and 50 M) 20 分鐘之後，再以 LPS 與 IFN- 刺激並培養六十分鐘後，以 NE-PER 套組中的使用方式抽取核內蛋白質。在以電泳移動偏向分析法(EMSA)分析 NF-B 與 concensus NF-B promoter dsDNA 之結合能力。實驗結果發現 andrographolid 可以濃度相關性的抑制細胞核內胞核內的 NF-B 與 concensus NF-B promoter dsDNA 之結合能力，而 200X cold non-biotin binding dsDNA 則當作 negative control。(n=1) (Figure 9). 九、探討LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞引發IB-磷酸化之作用在之前的實驗中發現 andrographolide 可以有意義且濃度相關性的抑制 NF-B 路徑的活化，而 NF-B 之活化與其抑制蛋白 IB-有很大的相關性。在不活化的情況下 NF-B 會與 IB- 結合，而在刺激活化之後， IB-會先被磷酸化之後進行 ubiquitination，而讓 NF-B 進入核內，刺激轉錄作用。所以進一步探討 andrographolide 是否是經由抑制 IB-之磷酸化而抑制 NF-B 路徑的活化。而在探討 andrographolide 作用之前，我們先探討在大鼠血. 53.

(54) 管平滑肌細胞給予 LPS (50 g/ml)與 IFN-  (100 unit/ml)後， IB-之磷酸化作用與時間之關係。 將大鼠血管平滑肌細胞種於  cm dish 中直到 80-90% confluent，給予 LPS (50 g/ml)與 IFN-  (100 unit/ml)之後分別在 5、10、15、20 及 30 分鐘後收集細胞蛋白質萃取液，並以西方墨點法分析其中磷酸化之 IB-蛋白含量，發現相較於未給予刺激劑的細胞，給予刺激劑後 10 分鐘之細胞蛋白質萃取液中，磷酸化之 IB-蛋白含量最高 n=1   Figure 10 。  十、探討andrographolide對於LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞IB-磷酸化之作用在實驗證明給予刺激劑  分鐘後會達到 IB-磷酸化之高峰後，將大鼠血管平滑肌細胞種於 cm dish 中直到 80-90% confluent，給予不同濃度之實驗藥物 andrographolide (20 and 50 M)， 20 分鐘後給予刺激劑 LPS (50 g/ml)與 IFN-  (100 unit/ml)，於 10 分鐘後收集細胞蛋白質萃取液並以西方墨點法觀察細胞中磷酸化 IB-之含量。發現在未給予任何刺激劑的大鼠血管平滑肌細胞中，只有少量的磷酸化 IB- resting group, 1.0±0.00 fold ，而在給予刺激劑而未給予藥物的細胞之蛋白質 54.

(55) 萃取液中，則有大量且相較於 resting group 有意義的磷酸化 IB-表現量   ±   folds)，而在給予刺激劑並事先給予不同濃度的 andrographolide 的細胞萃取液中，磷酸化 IB-的表現相較於給予刺激劑的細胞組，磷酸化 IB-表現量並無明顯差異 給予 andrographolide 20 M 組其磷酸化 IB-表現程度為   ±  folds；給予 andrographolide 50 M 組其磷酸化 IB- 表現程度為    ± folds   n=3   Figure 11 。. 十一、探討LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞引發IB-降解之作用在之前的實驗中發現andrographolide抑制NF-B路徑之活化並不是經由抑制IB-之磷酸化作用。接下來進一步探討 andrographolide是否可以抑制IB-之降解(degradation)作用，而抑制NF-B路徑之活化；而在探討andrographolide作用之前，先測試在大鼠血管平滑肌細胞給予LPS (50 g/ml)與IFN- (  10 0 unit/ml)後，IB-之降解作用與時間之關係。將大鼠血管平滑肌細胞種於  cm dish 中直到 80-90% confluent，給予 LPS (50 g/ml)與 IFN-  (100 unit/ml)之後分別在 5、10、30 及 60 分鐘後收集細胞蛋白質萃取液，並以西方 55.

(56) 墨點法分析其中 IB-之降解作用，發現相較於未給予刺激劑的細胞，給予刺激劑後 30 分鐘之細胞蛋白質萃取液中，IB- 之降解作用最為明顯(Figure 12)。. 十二、探討andrographolide對於LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞IB-降解之作用在實驗證明給予刺激劑  分鐘後會達到 IB-降解作用之高峰後，我們將大鼠血管平滑肌細胞種於 cm dish 中直到 80-90% confluent，給予不同濃度之實驗藥物 andrographolide (20 and 50 M)，20 分鐘後給予刺激劑 LPS (50 g/ml)與 IFN-  (100 unit/ml)，於 30 分鐘後收集細胞蛋白質萃取液並以西方墨點法觀察細胞中 IB-之含量。我們發現在未給予任何刺激劑的大鼠血管平滑肌細胞萃取液中，IB-有輕微降解作用之 resting group, 1.00±0.00 fold 。而在給予刺激劑而未給予藥物的細胞之萃取液中，則 IB-發生降解作用，而相較於 resting group 只有少量之 IB-表現量   ±   folds)，有明顯的降解作用，而在給予刺激劑並事先給予不同濃度的 andrographolide 的細胞萃取液中， IB-的降解作用相較於給予刺激劑的細胞組，並無明顯差異 給予 andrographolide 20 M 組其 IB-蛋白 56.

(57) 表現程度為  ±   folds；給予 andrographolide 50 M 組其 IB-蛋白程度為   ±  folds   n=3   Figure 13 。  十三、探討LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞誘發細胞核內 p65磷酸化之作用之前的研究發現 andrographolide 並不會影響 IB-之磷酸化與降解作用之後，更進一步探討 andrographolide 是否會影響細胞核內 p65 之磷酸化，我們使用西方墨點法確認 p65 在受到刺激後於細胞核內發生磷酸化的時間。將血管平滑肌細胞種於 10 cm dish 中，在 80-90% confluent 狀態下以 LPS 與 IFN- 刺激並培養，發現細胞核中 p65 的磷酸化在 45 分鐘時最明顯(n=1) (Figure 14)。. 十四、探討andrographolide對於LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞核內p65磷酸化之作用接下來進一步探討 andrographolide 影響 LPS 和 IFN- 合併刺激細胞核內 p65 磷酸化的作用。將血管平滑肌細胞種於 10 cm dish 中，在 80-90% confluent 狀態下發現給予不同濃度的 andrographolide(20 and 50 M)，並於 45 分鐘之後以 NE-PER kit 57.

(58) 收取細胞核中蛋白質，發現 andrographolide 濃度相關的抑制核內 p65 之磷酸化(n=1) (Figure 15)。. 十五、探討andrographolide對於LPS與IFN- 刺激大鼠血管平滑肌細胞p65 translocation之作用為了進一步探討 andrographolide 抑制細胞核內磷酸化 p65 的表現量是否是經由抑制 p65 的 translocation 而得，我們使用西方墨點法偵測細胞核中 p65 的含量。將血管平滑肌細胞種於 10 cm dish 中，在 80-90% confluent 狀態下發現給予不同濃度的 andrographolide(20 and 50 M)，並於 45 分鐘之後以 NE-PER 收取細胞核中蛋白質，發現 andrographolide 濃度相關的抑制細胞核內 p65 的蛋白質含量(n=1) (Figure 16)。  十六、探討 andrographolide 對於氣球擴張術傷害引發大鼠頸動脈後血管內膜增生(neointima formation)之作用 為了測試 andrographolide 在活體中於動脈粥狀硬化疾病之作用，我們進一步探討 andrographolide 影響氣球擴張術引發血管內膜增生之作用。首先先確立氣球擴張術對大鼠頸動脈傷害誘發血管新內. 58.

(59) 膜增生的作用。在施予氣球擴張術後的大鼠頸動脈組織切片中 (n=3) (Figure 18)，發現相對於 sham 組(n=4) (Figure 17)，有明顯之血管內膜增生的情形。而以滲透壓幫浦事先給予 andrographolide (5 mg/kg/day)兩個禮拜大鼠的頸動脈切片當中，則觀察到較輕微的血管內膜增生的情形(n=2) (Figure 19)。              . 59.

(60) 肆、討論(Discussion) 動脈粥狀硬化(atherosclerosis) 在心血管疾病中扮演相當重要的角色，其併發症包含冠心病(coronary artery disease)、急性血管症候群(acute vascular syndromes)、心肌梗塞(myocardial infarction) 、不穩定型心絞痛 (unstable angina) 及中風 (stroke)(Fuster, 1994)。在最近的研究中被認為是一種和發炎因子與微生物感染有關之慢性的發炎反應，而本實驗主要是探討穿心蓮內酯(andrographolide)對脂多醣體(lipopolysaccharide， LPS)和丙型干擾素(interferon-   IFN- ) 共同誘發血管平滑肌細胞之發炎反應以及 andrographolide 對氣球擴張術引發血管內膜增生之影響。根據之前的研究認為動脈粥狀硬化與細胞激素之刺激 (Harvey & Ramji, 2005) 和微生物感染造成慢性發炎有關 (Hendrix et al., 1990, Jackson et al., 1997)，所以本篇選用 LPS 以及 IFN- 合併作為引發細胞發炎反應之刺激劑。而本篇實驗藥物 andrographolide 是 Andrographis paniculata 的主要有效成分之一。A. paniculata 在印度、中國與越南是被廣泛使用的傳統中草藥物，針對抗發炎有非常高的活性(Shen et al., 2000)。經由 MTT 的結果確認 andrographolide 在 20 M 和 50 M 之濃度下. 60.

(61) 對於大鼠血管平滑肌細胞並無細胞毒性之後，更進一步來探討 andrographolide 對於血管平滑肌細胞之抗發炎作用。在研究中發現，當血管平滑肌細胞受到 LPS 以及 IFN- 刺激之後會產生發炎反應進而誘發誘導型一氧化氮合成酶以及基質金屬蛋白酶之產生，而 andrographolide(20 and 50 M)則濃度相關並有意義的抑制誘導型一氧化氮合成酶以及基質金屬蛋白酶之產生。之前的研究中發現 LPS 刺激誘導型一氧化氮合成酶的生成是經由 NF-B 活化而產生的(Xie et al .,1994)，所以本篇更進一步針對於 andrographolide 是否是經由影響 NF-B 的活化。藉由冷光報導基因表現分析實驗 (Luminometric reporter gene analysis assay) 與電泳移動偏向分析法 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)，我們發現 andrographolide(20 and 50 M)可以有意義並濃度相關性的抑制 NF-B 的活化。 NF-B 為一種轉錄因子，首先被發現於 B 細胞內可以和 immunoglobulin light-chain enhancer 上一小段 DNA 序列結合而命名(Sen & Baltimore, 1986)。之後便發現在許多細胞中皆有此轉錄因子的表現，且和許多蛋白基因的調控有著密切的關係。 NF-B 主要由一系列稱作 Rel 大家族的蛋白組成，不同的 NF-B subtype 有著共同的 Rel domain(REL homology domains,. 61.

(62) RHD)(Chen & Greene, 2004)，這段由約 300 個胺基酸所組成的區域為 NF-B 進行 DNA 結合，或和 NF-B 的抑制性蛋白 IB(inhibitor of NF-B)交互作用的位置。其主要組成物分為七種: RelA/p65, c-Rel, RelB, p105, p50, p100 及 p52，其中只有 RelA/p65, c-Rel, RelB 具有 carboxy-terminal transactivation domain (TAD)。NF-B 由 RelA/p65, c-Rel, RelB, p50 及 p52 搭配另一個相同(homo)或不同(hetero)的 Rel 家族共同組成一個二元體(dimer)，其中以 RelA/p65 及 p50 共同組成的異二元體 (heterodimer)最為常見，而藉由不同組成的 NF-B，其調節的蛋白質基因也具有特異性。如 RelA-RelA homodimer 可以調控 IL-8 、 typeVII collagen 、 intercelluar adhesion molecule-1 ， RelA/p65-p50 heterodimer 可以調控其自身抑制蛋白(inhibitor of NF-B-, IB-)、IL-8、IL-6、TNF- 、inducible nitric oxide synthase、MMP 等之表現，而這些蛋白質的表現在生理以及病理現象中都扮演了很重要的角色。 NF- B 在不受刺激的細胞中會和其抑制性蛋白 IB- 結合，所形成的複合物 大部分存在於細胞質中。IB- 可以遮蔽 NF-B 上的 nuclear localization signal (NLS)，使得 NF-B 無法 translocation 進入細胞核內與 DNA 結合。NF-B 可以被許多活. 62.

(63) 化因子所活化，包括各種 pro-inflammatory cytokines、生長因子、DNA damaging agents 及病毒蛋白等(Ghosh & Karin, 2002)。在之前的研究中發現，動脈粥狀硬化重新被定義為一種慢性的發炎疾病(Ross, 1999)，而 NF-B subunit RelA 大量表現在動脈粥狀硬化部位內膜(intima)和中膜(media)中的血管平滑肌細胞、巨嗜細胞、內皮細胞以及 T 細胞的細胞核內，而在正常的血管壁中 p50 和 RelA 則是在細胞質內，而無在細胞核內積聚的現象 (Brand et al., 1997) 。在餵食高膽固醇食物 (hypercholesterolemic diet)的豬隻冠狀動脈(Wilson et al., 2000) 以及氣球擴張術傷害之後的大鼠血管平滑肌細胞中也有發現 NF-B 活化之情形(Landry et al., 1997)。接下來探討 NF-B 活化之路徑與 andrographolide(20 and 50 M)之關聯。NF-B 在不受刺激的細胞中會和其抑制性蛋白 IB-結合，所形成的複合物 大部分存在於細胞質中。而在受到刺激之後活化 IB kinase(IKK) 進而磷酸化抑制性蛋白 IB-，而 IB-在 ser-32、ser36 受到磷酸化之後隨後進行 ubiquitination 而 degradation ，使 NF-B nuclear location signal(NLS)暴露出來，而使 NF-B 進入核內刺激轉譯轉錄。本篇實驗中發現，andrographolide(20 and 50 M)並不會影響. 63.

(64) IB-之磷酸化與降解，而是藉由抑制 p65 之 translocation 而影響 NF-B 活化。進一步的進行動物實驗發現 andrographolide 可以抑制氣球擴張術引發大鼠血管內膜增生的情形，在之前的研究中發現氣球擴張術傷害之後的大鼠血管平滑肌細胞中也有發現 NF-B 活化之情形(Landry et al., 1997)。而 andrographolide 在小鼠的動脈傷害模式中發現可以藉由抑制 tissue factor、 E-selectin 以及 VCAM-1 等 NF-B 下游基因蛋白表現而抑制傷害後血管內膜增生 (Wang et al., 2007) 。另一方面，也有其他研究指出 andrographolide 可以藉由促進 v-Src 經由 ubiquitination 的降解作用(degradation)而抑制 Erk、PI3K 路徑的活化，進而抑制細胞的增生(Liang et al., 2008)。andrographolide 抑制氣球擴張術傷害之後的大鼠血管內膜增生之作用可能經由抗發炎以及抗增生兩種不同作用而來。 andrographolide 被發現可以直接與 NF-B 中的 p50 之 cystein 62 作還原性共價鍵的結合，而抑制發炎反應包含內皮細胞表現 cell adhesion molecule E-selectin 和降低細胞激素和內毒素引起的敗血性休克(septic shock)以及過敏性肺炎(allergic lung inflammation) (Xia et al., 2004) 。在我們的研究結果中發現. 64.

(65) andrographolide 可有效的抑制 p65 轉移至細胞核的 NF-B 活化現象。與之前的研究相對照，發現 andrographolide 可能經由直接與 NF-B 中 p50 的結合而影響 NF-B p65-p50 之 translocation，進而抑制 NF-B 之活化。而其分子機轉仍有待進一步的探討。. 65.

(66) 伍、結論(Conclusion) 穿心蓮是一種中國的傳統草藥，而其萃取物 andrographolide 在之前的研究當中發現具有強效的抗發炎的作用，在本篇研究中發現 andrographolide(20 and 50 M)可有效降低脂多醣體(lipopolysaccharide，LPS)以及干擾素(interferon- ) 在大鼠血管平滑肌細胞中所引發的發炎反應，且其分子機轉研究發現，andrographolide 不影響 NF-B 抑制蛋白 IB-的磷酸化與降解作用，而是直接抑制 p65 進入細胞核內，並影響 NF-B 的活化。在動物實驗中亦證實了 andrographolide 可有效抑制氣球擴張術後引發大鼠頸動脈血管內膜之不正常增生。穿心蓮內酯 andrographolide 可能經由抑制 p65 的轉移作用進而影響 NF-B 的活化，減少了發炎反應的產生，而改善了血管內膜不正常增生的情形。.           66.

(67) 陸、圖表. Figure 1. Chemical structure of andrographolide.. 67.

(68) Cell viability (%). 140 120 100 80 60 40 20 0 resting 20. 50 DMSO 20. 50. LPS + IFN- andrographolide (M). Figure 2. Effect of andrographolide on VSMCs viability. VSMCs (1 105 cells/well)were seeded on 24 well plate until 80-90% confluent and treated with various concentration of andrographolide (20 and 50 M). For the VSMCs with LPS and IFN-  stimulation, the VSMCs were treated with various concentration of andrographolide 20 min followed by stimulation with LPS (50 g/ml) and IFN-(100 unit/ml) cocktail. After different treatment in serum-free DMEM for 24hr, MTT (0.5 mg/ml) was added to each well. Cell viability was measured by a colorimetric assay at 550 nm based on the ability of mitochondria to reduce the tetrazolium dye 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) in viable cells. Absorbency of viability is presented as mean ± S.E.M. of 3 independent experiments. .. 68.

(69) 8. Nitrite (M). *** 6. 4 ###. 2 ###. 0 resting. DMSO. 20. 50. andrographolide (M) LPS (50 g/ml)+IFN-  (100 unit/ml). Figure 3. Effect of andrographolide on LPS/IFN-induced nitric oxide production in VSMCs. VSMCs were seeded on 6 cm dish till 80-90% confluent and treated with various concentration of andrographolide (20 and 50 M) for 20 mins followed by stimulation with LPS (50 g/ml) and IFN-(100 unit/ml) cocktail in serum-free DMEM for 24hr. Cell-free supernatants were assayed for nitrite production. Data are presented as the means ± SEM (n = 4). ***P < 0.001 as compared with the resting group; ###P < 0.001 as compared with the solvent control group.. 69.

(70) iNOS. Relative content of iNOS (folds). -tubulin. 10. *** 8 6. ### ###. 4 2 0 resting DMSO. 20. 50. andrographolide (m) LPS (50 g/ml) + IFN-(100 unit/ml). Figure 4. Effect of andrographolide on LPS/IFN-induced iNOS expression on VSMCs. VSMCs were seeded on 6 cm dish till 80-90% confluent and treated with various concentration of andrographolide (20 and 50 M) for 20 mins followed by stimulation with LPS (50 g/ml) and IFN-(100 unit/ml) cocktail in serum-free DMEM for 24hr. Lane 1, cells treated with DMEM only (resting group) and cells pretreated with solvent control (lane 2, 0.1% DMSO) or andrographolide (lane 3, 20 M and lane 4, 50 M) followed by the addition of LPS/IFN- . ***P < 0.001 as compared with the resting group; ###P < 0.001 as compared with the solvent control group. 70.