T.C.
SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
KONYA, KARAMAN VE AKSARAY ĠLLERĠ KABAKGĠL EKĠM ALANLARINDA GÖRÜLEN VĠRÜS HASTALIKLARININ
SEROLOJĠK VE MOLEKÜLER
YÖNTEMLERLE TESPĠTĠ VE ENFEKSĠYON KAYNAKLARININ BELĠRLENMESĠ
SERKAN YEġĠL DOKTORA TEZĠ Bitki Koruma Anabilim Dalı
Ağustos-2013 KONYA Her Hakkı Saklıdır
iv
ÖZET DOKTORA TEZĠ
KONYA, KARAMAN VE AKSARAY ĠLLERĠ KABAKGĠL EKĠM ALANLARINDA GÖRÜLEN VĠRÜS HASTALIKLARININ SEROLOJĠK VE
MOLEKÜLER YÖNTEMLERLE TESPĠTĠ VE ENFEKSĠYON KAYNAKLARININ BELĠRLENMESĠ
SERKAN YEġĠL
Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı
DanıĢman: Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ 2013, 127 Sayfa
Jüri
Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ Prof. Dr. Nuh BOYRAZ Prof. Dr. Önder TÜRKMEN Yrd. Doç. Dr. Kubilay K. BAġTAġ Yrd. Doç. Dr. Hasibe CĠNGĠLLĠ VURAL
Bu çalışma, Konya, Karaman ve Aksaray illeri kabakgil ekim alanlarındaki virüs enfeksiyonlarını ve bunların enfeksiyon kaynaklarını belirlemek amacıyla gerçekleştirilmiştir. 2009 ve 2010 yıllarında, toplam olarak virüs hastalığı belirtileri gösteren 652 kabakgil bitki örneği, 92 tohum örneği ve 85 yabancı ot örneği toplanmıştır. Virüsler DAS-ELISA ve RT-PCR ile tanımlanmıştır. Sonuçlar, bitki örneklerinin %83,4‟ünün, yabancı ot örneklerinin %50,6‟sının ve tohum örneklerinin ise %8,7‟sinin Zucchini yellow mosaic Potyvirus (ZYMV), Watermelon mosaic Potyvirus-2 (WMV-2), Cucumber mosaic Cucumovirus (CMV), Papaya ringspot Potyvirus-watermelon strain (PRSV-W) veya Squash mosaic Comovirus (SqMV) ile enfekteli olduğunu göstermiştir. Test sonuçlarına gore, bitki örnekleri için ZYMV (%51,7), WMV-2 (%45,2) ve CMV (%21,3), tohum örnekleri için ZYMV (%4,3), WMV-2 (%3,3) ve CMV (%1,1) ve yabancı ot örnekleri için CMV (% 36,5), WMV-2 (%22,3) ve ZYMV (%15,3) hâkim virüslerdir. Bunun yanında, özellikle bitki örneklerinde karışık enfeksiyonların, oldukça yaygın olduğu belirlenmiştir. Testi yapılan hiçbir örnekte ise Cucumber green mottle mosaic Tobamovirus (CGMMV) enfeksiyonu saptanmamıştır.
Aynı zamanda, bu çalışmada, kabakgil bitkilerinden toplanan 17 afid örneği RT-PCR testine tabi tutulmuştur. Bu örneklerde ise CMV, ZYMV (%17,6) ve WMV-2 (%11,7) enfeksiyonları tespit edilmiştir.
Çalışmanın sonraki aşamasında ise 5 ZYMV, 3 WMV-2 ve 2 CMV izolatının dizileri belirlenerek, WMV-2 (KF021298, KF021299 ve KF021300) ve CMV (KC989614 ve KC989615) izolatlarının dizileri GenBank‟a kaydettirilmiştir.
Anahtar Kelimeler: Aksaray, CMV, Cucurbitaceae, Enfeksiyon kaynakları, Karaman, Konya, WMV-2,
v
ABSTRACT
Ph.D THESIS
DETECTION OF VIRUS DISEASES OF CUCURBITS IN KONYA, KARAMAN AND AKSARAY PROVINCES BY SEROLOGIC AND MOLECULAR
METHODS AND DETERMINATION OF INFECTION SOURCES
Serkan YEġĠL
THE GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE OF SELÇUK UNIVERSITY
THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY IN DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION
Advisor: Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ 2013, 127 Pages
Jury
Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ Prof. Dr. Nuh BOYRAZ Prof. Dr. Önder TÜRKMEN Asst. Prof. Dr. Kubilay K. BAġTAġ Asst. Prof. Dr. Hasibe CĠNGĠLLĠ VURAL
This study was conducted in order to determine the virus infections and their infection sources in major cucurbit growing areas in Konya, Karaman and Aksaray provinces. In total, 652 cucurbit plant samples with common symptoms of virus infections, 92 seed samples and 85 weed samples were collected during 2009 and 2010. The viruses were identified by DAS-ELISA and RT-PCR. The results showed that 83,4% of plant samples, 50,6% of weed samples and 8,7% of seed samples were infected with Zucchini yellow mosaic Potyvirus (ZYMV), Watermelon mosaic Potyvirus-2 (WMV-2), Cucumber mosaic Cucumovirus (CMV), Papaya ringspot Potyvirus-watermelon strain (PRSV-W) or Squash mosaic Comovirus (SqMV). According to the test results, predominant viruses were ZYMV (51,7%), WMV-2 (45,2%) and CMV (21,3%) for plant samples, ZYMV (4,3%), WMV-2 (3,3%) and CMV (1,1%) for seed samples and CMV (36,5%), WMV-2 (22,3%) and ZYMV (15,3%) for weed samples. Also mixed infections were determined commonly especially in plant samples. Cucumber green mottle mosaic Tobamovirus (CGMMV) was not determined in any of the tested samples.
In this study, also, 17 aphid samples were collected on cucurbit plants and RT-PCR test was performed. CMV, ZYMV (17,6%) and WMV-2 (11,7%) infections were detected from aphid samples.
In the further stage of the study, isolates of ZYMV (5), WMV-2 (3) and CMV (2) were sequenced and CMV (KC989614-KC989615) and WMV-2 (KF021298-KF021299-KF021300) sequences were submitted to GenBank database.
vi
ÖNSÖZ
Tez çalışmasının her aşamasında yardımcı olan danışman hocam sayın Prof. Dr. Filiz ERTUNÇ‟a, ikinci danışmanım Prof. Dr. Nuh BOYRAZ ve tez izleme komitesi üyesi Yrd. Doç. Dr. Kubilay K. BAŞTAŞ‟a, arazi ve laboratuar çalışmalarında yardımcı olan bölüm stajyer öğrencilerine ve çalışanlarına, maddi destek sağlayan S.Ü. BAP yönetimine teşekkürlerimi sunarım.
Ayrıca eşime ve ailemin tüm bireylerine, verdikleri destek ve gösterdikleri hoşgörüden dolayı sonsuz teşekkür ederim.
Serkan YEŞİL KONYA-2013
vii ĠÇĠNDEKĠLER ÖZET ... iv ABSTRACT ... v ÖNSÖZ ... vi ĠÇĠNDEKĠLER ... vii SĠMGELER VE KISALTMALAR ... ix 1. GĠRĠġ ... 1 2. KAYNAK ARAġTIRMASI ... 5
2.1. Kabakgil Bitkilerinde Virüslerin Tanılanması ve Yaygınlıkları ... 5
2.2. Ülkemizde Kabakgil Virüsleri Üzerinde Yapılan Çalışmalar ... 12
2.3. Enfeksiyon Kaynakları ve Mücadele Yolları ... 21
2.4. Genetik Çalışmalar ... 23
3. MATERYAL VE YÖNTEM ... 27
3.1. Materyal ... 27
3.1.1. Virüs ile enfekteli kabakgil bitki materyalinin temini ... 27
3.1.2. Serolojik testlerde kullanılan materyal ... 27
3.1.3. Moleküler çalışmalarda kullanılan materyal ... 28
3.1.3.1. Total nükleik asit (TNA) ekstraksiyonunda kullanılan materyal ... 28
3.1.3.2. RT-PCR ve PCR testlerinde kullanılan materyal ... 28
3.1.3.3. Agaroz jel elektroforez çalışmalarında kullanılan materyal ... 28
3.1.3.4. Araştırmada kullanılan diğer materyal ... 29
3.2. Yöntem ... 29
3.2.1. Arazi çalışmaları ve örnekleme ... 29
3.2.2. Serolojik test yöntemi (DAS-ELISA) ... 31
3.2.3. Moleküler çalışmalar ... 33
3.2.3.1. Total nükleik asit (TNA) ekstraksiyonu ... 33
3.2.3.2. Komplementer DNA (cDNA) sentezi ... 35
3.2.3.3. PCR çalışmaları ... 36
3.2.3.4. Multiplex-RT-PCR Çalışmaları ... 40
3.2.3.5. Agaroz-Jel Elektroforez Çalışmaları ... 41
3.2.3.6. Dizi Belirleme ve BLAST Analizi Çalışmaları ... 41
4. ARAġTIRMA BULGULARI VE TARTIġMA ... 43
4.1. Kabakgil Üretim Alanlarından Toplanan Örnekler ... 43
4.2. Kabakgil Üretim Alanlarındaki Enfekteli Bitkilerde Görülen Virutik Belirtiler 59 4.3. DAS-ELISA Çalışmaları... 64
4.4. Moleküler Çalışmalar ... 77
4.4.1. TNA (Total Nükleik Asit) ekstraksiyon çalışmaları ... 77
4.4.2. RT-PCR çalışmaları ... 77
4.5. Dizi Belirleme ve BLAST Analizi Çalışmaları ... 87
4.5.1. Hıyar mozayik virüsü (CMV) dizi analizi çalışmaları ... 87
4.5.2. Karpuz mozayik virüsü-2 (WMV-2) dizi analizi çalışmaları ... 89
4.5.3. Kabak sarı mozayik virüsü (ZYMV) dizi analizi çalışmaları ... 90
viii
5.1. Sonuçlar ... 92
5.1.1. DAS-ELISA çalışmalarına ilişkin sonuçlar ... 92
5.1.2. RT-PCR çalışmalarına ilişkin sonuçlar ... 95
5.1.3. Dizi belirleme çalışmalarına ilişkin sonuçlar ... 95
5.2. Öneriler ... 96
6. KAYNAKLAR ... 98
7. EKLER ... 112
ix SĠMGELER VE KISALTMALAR Simgeler % : Yüzde o C : Santigrat derece da : Dekar dk : Dakika g : Gram µg : Mikrogram µl : Mikrolitre µM : Mikromolar M : Molar mg : Miligram ml : Mililitre mM : Milimolar
pH : Hidrojen İyon Konsantrasyonunun Negatif Logaritması pmol : Pikomol
sn : Saniye
U : Unite
V : Volt
Kısaltmalar
AMV : Alfalfa mosaic alfamovirus BPYV : Beet pseudo yellows closterovirus
CABYV : Cucurbit aphid-borne yellows polerovirus cDNA : Komplementer deoksiribonükleikasit
CGMMV : Cucumber green mottle mosaic tobamovirus CMV : Cucumber mosaic cucumovirus
CuNV : Cucumber necrosis tombusvirus CVYV : Cucumber vein yellowing ipomovirus
CYSDV : Cucumber yellow stunting disorder crinivirus DAS-ELISA : Double Antibody Sandwich – ELISA
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay LIYV : Lettuce infectious yellows crinivirus MNSV : Melon necrotic spot carmovirus PAS-ELISA : Protein A Sandwich-ELISA PCR : Polymerase Chain Reaction PRSV-W : Papaya ringspot potyvirus PTA-ELISA : Plate Trapped Antigen - ELISA PYMV : Potato yellow mosaic begomovirus PYVMV : Pumpkin yellow vein mosaic begomovirus RNA : Ribonükleikasit
RNAse : Ribonükleaz enzim rpm : Dakikadaki devir sayısı
RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SDS : Sodium dodecyl sulphate
SLCV : Squash leaf curl begomovirus SqMV : Squash mosaic comovirus TBRV : Tomato black ring nepovirus TBSV : Tomato bushy stunt tombusvirus
x TMV : Tobacco mosaic tobamovirus TNA : Total Nükleik Asit
ToMV : Tomato mosaic tobamovirus ToRSV : Tomato ringspot nepovirus TLCV : Tobacco leaf curl begomovirus TRV : Tobacco rattle tobravirus TSWV : Tomato spotted wilt tospovirus WMV-2 : Watermelon mosaic potyvirus-2 ZLCV : Zucchini lethal chlorosis tospovirus ZYFV : Zucchini yellow fleck potyvirus ZYMV : Zucchini yellow mosaic potyvirus
1. GĠRĠġ
Kabakgil bitkileri Cucurbitaceaea familyası içerisinde yer almaktadır. Bu familya içerisinde yaklaşık 119 cins ve 825 tür bulunmaktadır. Öncelikle tropikal ve subtropikal bölgeler olmak üzere, dünyanın her yerinde bu türlerin bazılarının tarımı yapılmaktadır (Andres, 2004). Kavun (Cucumis melo L.), hıyar (Cucumis sativus L.), kabak (Cucurbita pepo L.), karpuz (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai), bal kabağı (Cucurbita moschata L.), kestane kabağı (Cucurbita maxima L.) ve acur (Cucumis anguria) bu familyada başlıca tarımı yapılan türlerdir (Günay, 1993).
Cucurbitaceae familyasındaki sebzelerin yetiştiriciliği çok eski yıllara dayanmaktadır. Theben (Mısır)‟de KAHUN‟un mezarında bulunan belgelerde hıyar ve diğer Cucurbitaceae familyası bitkilerinin M.Ö. 2000-1788 yıllarında yetiştirildiği anlaşılmaktadır. Hıyarın ana vatanı konusunda araştırıcılar Çin, Hindistan, İran ve Anadolu‟yu içine alan bir bölgeden dünyaya yayıldığı konusunda fikir birliği içindedirler. Kabakların ana vatanının Amerika olduğu ve özellikle C. pepo ve C.
moschata‟nın dünyaya buradan yayıldığı, C. maxima‟nın ise Asya kökenli olduğu
bilinmektedir. Kavunun kökeni geniş bir bölge içinde tanımlanmaktadır. Anadolu, Afganistan, İran, Orta Asya ve Güney batı Asya kavunun gen merkezleri arasındadır. Karpuzun ana vatanı Orta Afrika‟dır. Bazı araştırıcılar farklı bölgeleri vurgulasalar da Afrika‟da birçok yabani karpuza bol miktarda rastlanması, karpuzun gen merkezinin Orta Afrika olduğunu kesin bir şekilde kanıtlamıştır (Günay, 1993).
Kabak dünyanın pek çok yerinde olduğu gibi meyvesi için üretilmesinin yanı sıra tohumları ve çiçekleri için de üretilmektedir. Çerezlik kabak yetiştiriciliğinin yemeklik kabak tarımına göre bazı avantajları vardır. Bunlar, sulamanın sık yapılmasına gerek olmaması veya tamamen kıraç koşullarda da çerezlik kabak tarımının yapılabilmesi, ekim nöbeti için uygun bir tür olabilmesi, hasat kolaylığı, kültürel işlemlerin büyük oranda makine ile yapılabilmesi, hastalık ve zararlılar açısından fazla sıkıntıya yol açmaması gibi nedenler sayılabilir. Ülkemizde çerezlik kabak tarımı genelde C. pepo ile yapılmaktadır. Nadiren C. moschata türü de çekirdeklik kabak tarımı için kullanılmaktadır (Yanmaz ve Düzeltir, 2003).
Kavun insan beslenmesi ve sağlığı açısından önemli bir sebze türüdür. Küçük meyveleri turşu sanayinde önemli bir yer alır. Karpuz su içeriği nedeniyle ülkemizde serinletici olarak bilinen bir yaz sebzesidir. Karpuz meyvesinde oldukça yüksek oranda şeker, A, B, C vitaminleri ve birçok mineral madde vardır. Karpuzun taze tüketiminin
yanı sıra kabuklarından ve küçük meyvelerinden turşu ve reçel yapılmaktadır (Vural ve ark., 2000).
Türkiye, dünyada en fazla sebze üreten ülkelerden bir tanesi durumundadır. Çizelge 1.1‟de görüldüğü gibi, ülkemiz, FAO 2010 yılı üretim değerleri verilerine göre dünyada kavun ve karpuz üretiminde ikinci, hıyar üretiminde üçüncü ve kabak üretiminde ise onuncu sırada yer almaktadır. Çin, İran, ABD ve Hindistan ülkemiz ile birlikte dünyada kabakgil üretiminde söz sahibi ülkeler arasında yer almaktadırlar.
Çizelge 1.1. 2010 yılı verilerine göre Dünya‟da kabakgiller üretiminde önde gelen ülkeler ve üretim
miktarları (ton) (Anonymous, 2013)
S Sıra
Bitkiler
Hıyar Kavun Karpuz Kabak
1 Çin 45.546.156 Çin 12.573.147 Çin 66.225.925 Çin 6.666.978 2 İran 1.811.630 Türkiye 1.611.700 Türkiye 3.683.100 Hindistan 4.424.200 3 Türkiye 1.739.190 İran 1.317.600 İran 3.466.880 Rusya 988.580 4 Rusya 1.161.870 Mısır 1.076.770 Brezilya 2.052.930 ABD 792.700 5 ABD 880.530 ABD 1.036.040 ABD 1.893.100 İran 695.600 6 Ukrayna 860.100 İspanya 926.700 Mısır 1.637.090 Mısır 658.234 7 İspanya 682.900 Hindistan 894.000 Özbekistan 1.182.400 Meksika 522.388 8 Mısır 631.408 Fas 567.301 Rusya 1.151.580 Ukrayna 516.900 9 Japonya 587.800 Meksika 561.681 Meksika 1.036.800 İtalya 508.075 10 Endonezya 547.141 Guatemala 480.434 Cezayir 946.200 Türkiye 430.402
Kabakgiller familyası içerisindeki sebzeler, ülkemiz yıllık toplam sebze üretiminin yaklaşık olarak % 30‟unu oluşturmaktadırlar. Çizelge 1.2.‟de bu ürünlerin yıllık üretim miktarları görülmektedir.
Çizelge 1.2. Türkiye‟de 2010 yılı kabakgil bitkileri üretim miktarları (Anonim, 2012)
Bitki türü Üretim miktarı (ton)
Karpuz 3.683.103
Hıyar 1.739.191
Kavun 1.611.695
Sakız kabağı 314.340
Bal kabağı 89.368
Çerezlik kabak (kabak çekirdeği) 26.694
Arazi çalışmalarının gerçekleştirildiği, Konya, Karaman ve Aksaray illeri ve ilçelerinde 2008 yılı verilerine göre sırasıyla; 59.721 da.‟lık tarım alanında 118.333 ton, 47.132 da.‟lık tarım alanında 91.925 ton ve 38.512 da.‟lık tarım alanında 14.106 ton kabakgil bitkisi üretilmiştir. Bu üç il ve ilçelerinde ise toplam olarak 145.365 da.‟lık tarım alanında 224.364 ton kabakgil bitkisi üretilmiştir. Bunların içinde en fazla ekim alanı ve üretim miktarına sahip olanlar ise sırasıyla, çerezlik kabak (59.265 da, 6783,5 ton), karpuz (32.466 da, 100.851 ton) kavun (23.883 da, 50.963 ton) ve sofralık hıyar (20.249 da, 45.193 ton)‟dır (Anonim, 2009a,b,c).
Konya ili ve ilçelerinde kabakgil bitkilerinden en fazla ekim alanı ve üretim miktarına sahip bitkiler sırasıyla; çerezlik kabak (18.390 da, 2.093 ton), kavun (16.500 da, 34.687 ton) ve karpuz (13.325 da, 46.429 ton)‟dur. En fazla ekim alanına sahip olan ilçeleri ise Çumra, Ereğli, Altınekin, Yunak, Meram ve Karatay‟dır (Anonim, 2009a). Örnekleme çalışmaları bu ilçelerdeki ekim alanlarında gerçekleştirilmiştir. Özellikle Çumra ilçesi, hoş lezzet ve aromaya sahip olan kavunu ile tanınmaktadır. Ve bu bölgedeki üreticiler uzun yıllardan beri kavun ve karpuz yetiştiriciliği yapmaktadırlar.
Karaman ili ve ilçelerinde kabakgil bitkilerinden en fazla ekim alanı ve üretim miktarına sahip bitkiler sırasıyla; karpuz (17.770 da, 52.065 ton), sofralık hıyar (9780 da, 15.525 ton) ve çerezlik kabak (8.950 da, 1.052,5 ton)‟tır. En fazla ekim alanına sahip olan ilçeleri ise merkez, Ayrancı ve Kazımkarabekir‟dir (Anonim, 2009b).
Aksaray ili ve ilçelerinde kabakgil bitkilerinden en fazla ekim alanı ve üretim miktarına sahip bitkiler sırasıyla; çerezlik kabak (31.925 da, 3638 ton), sofralık hıyar (2.604 da, 4.562 ton) ve kavun (1.883 da, 2.276 ton)‟dur. En fazla ekim alanına sahip olan ilçeleri ise merkez, Gülağaç ve Ortaköy‟dür (Anonim, 2009c).
Çalışmanın gerçekleştirildiği üretim alanlarında yerel standart ve hibrid kabakgil çeşitlerinin üretimi yapılmaktadır. Ticari amaçlı üretim yapılan alanlarda daha çok hibrid çeşitler kullanılmaktadır. Fakat bölgede en fazla üretimi yapılan kabakgil bitkisi olan çerezlik kabakta hibrid bir çeşit mevcut değildir. Üreticiler daha çok “Nevşehir sivrisi” ve “Çerçeveli” isimli yerli populasyonları kullanmaktadır. Sakızkabağı üretiminde ise koyu yeşil (kara kabak) ve beyaz renkli yerli populasyonlarla birlikte, Profit F1, Akça F1, Zümrüt F1 ve Meram F1 gibi hibrid çeşitler de ekilmektedir. Daha çok Konya‟nın Çumra ilçesinde yoğun bir üretim alanına sahip olan kavun için ise Kırkağaç kavunu (637), Ankara (Hıdır) kavunu, Sürmeli F1, Sinem F1 ve Edalı F1 gibi çeşitler kullanılmaktadır. Karpuz üretiminde Crimson sweet ile Karacan F1, hıyar
üretiminde Tuana F1, Toros F1 ve Altay F1 gibi hibrid çeşitler kullanılırken, acur üretiminde ise yerli populasyonlar tercih edilmektedir.
Kabakgiller pek çok virüs hastalığına konukçuluk etmekte ve bu ürünlerde önemli düzeylerde ürün kayıpları meydana gelmektedir. Dünya‟da kabakgiller familyası içindeki bitki türlerinde zarar yapan ve ekonomik kayıplara neden olan çok sayıda virüs hastalığı bulunmaktadır (Zitter ve ark, 1996). Kabak Sarı Mozayik Virüsü (Zucchini Yellow Mosaic Virus, ZYMV), Hıyar Mozayik Virüsü (Cucumber Mosaic Virus, CMV), Kabak Mozayik Virüsü (Squash Mosaic Virus, SqMV), Karpuz Mozayik Virüsü-2 (Watermelon Mosaic Virus-2, WMV-2) ve Papaya Halka Leke Virüsü (Papaya Ring Spot Virus, PRSV) kabakgillere zarar veren virüslerden bazılarıdır (Lisa ve Lecoq, 1984; Purcifull ve ark, 1984). Bu virüs hastalıkları bitkilerde gelişme geriliğine, şiddetli infeksiyonlar sonucu anormal meyve ve yeşil aksam oluşumuna neden olmakta, hatta meyve oluşumunu tamamen engelleyebilmektedir.
Planlanan bu çalışma ile, Konya, Karaman ve Aksaray illeri kabakgil bitkileri ekim alanlarında sorun olan virüs hastalıkları ve bu hastalıkların enfeksiyon kaynakları serolojik ve moleküler yöntemlerle tespit edilmiştir. Ayrıca, çalışma yapılan üretim alanlarında yoğun olarak izole edilen ZYMV, WMV-2 ve CMV izolatlarının bir kısmının kılıf proteinleri genlerinin nükleotid dizileri kısmi olarak belirlenerek izolatlar arasındaki genetik yakınlıklar ve ayrıca daha önce yapılan çalışmalardan elde edilen sonuçlarla karşılaştarılarak tespit edilen izolatların dünyadaki izolatlarla genetik yakınlıkları belirlenmiştir.
2. KAYNAK ARAġTIRMASI
2.1. Kabakgil Bitkilerinde Virüslerin Tanılanması ve Yaygınlıkları
Kabakgil bitkilerinin üretimi sırasında karşılaşılan sorunların başında hastalıklar ve zararlılar gelmektedir. Zitter (1996), kabakgil sebze türlerinde önemli düzeyde verim ve kalite kaybına yol açan 200‟den fazla hastalık olduğunu bildirmiştir. Kabakgil bitkilerinde hastalıklara neden olan etmenler arasında virüslerin sebep olduğu zararların daha fazla olduğu bildirilmektedir (Yılmaz ve Çığşar, 2006).
Viral hastalıklar dünya çapında önemli ekonomik kayıplara yol açmaktadır. Kabakgil bitkilerinde 50‟den fazla virüs ve 4 viroid enfeksiyon meydana getirebilmektedir. Kabakgil virüslerinin bir kısmı henüz tam olarak karakterize edilememiş olup aynı virüs farklı adlarla isimlendirilmektedir (Lovisolo, 1980).
Kabakgillerden bugüne kadar 35‟den fazla virüs izole edilmiştir (Provvidenti, 1996). Lisa ve Lecoq (1984), kabakgillerde 32 adet virüs ve virüs benzeri hastalık etmeni tespit edildiğini ve bu virüslerin 26 adedinin mekanik olarak özsu ile 9 adedinin ise tohum ile taşındığını rapor etmektedirler. Bunlar içerisinde ise; ZYMV, CMV, SqMV, WMV-2 ve PRSV‟nün kabakgillere zarar veren önemli virüsler olduğunu bildirmektedirler.
Meng ve ark. (2007), Gu ve ark. (2002)‟na atfen, kabakgillerde 46 virüs türünün hastalık yaptığını ve bunlardan en önemlilerinin ise ZYMV, WMV, CMV, PRSV-W ve SqMV olduğunu bildirmektedirler.
Dünya‟da ve ülkemizde, kabakgil ekim alanlarında saptanan virüs hastalıkları Çizelge 2.1‟de gösterilmektedir.
1981 yılında Florida‟da gerçekleştirilen bir çalışmada, yapraklarında mozayik belirtisi gösteren 39 adet kabak örnekleri toplanmış ve SDS-immunodiffusion testi ile WMV-1, WMV–2, WMV-M, SqMV ve CMV‟ne karşı testlenmişlerdir. Bu örneklerin 7 tanesinin WMV-1, 21 tanesinin WMV-2, 8 tanesinin WMV-1+WMV-2, 3 tanesinin de serolojik olarak WMV-2‟ye benzeyen farklı bir virüsle bulaşık olduğu belirlenmiştir. Örneklerin hiçbirinde WMV-M, SqMV ve CMV saptanmamıştır. WMV-2‟ye benzeyen izolatlardan bir tanesi (1119) sera koşullarında sakız kabağına mekanik olarak bulaştırıldığında yapraklarda; sistemik mozayik, damar bantlaşması, kıvrılma ve kabarcık tipinde simptom gösterdiği bildirilmiştir. Bu izolat, aynı zamanda, lif kabağı, karpuz ve hıyarda sistemik infeksiyon, C. amaranthicolor, C. quinoa, Phaseolus
vulgaris ve Pisum sativum “Alaska”‟ da lokal infeksiyonlara neden olmuştur. Virüsün Myzus persicae ile taşındığı tespit edilerek uzun ipliksi partiküllerin yaklaşık 760nm
olduğu kaydedilmiştir. 1119 nolu bu izolatın 1982 yılında Florida‟nın farklı bölgelerinde izole edilen ZYMV‟ne serolojik ve simptomatolojik açılardan oldukça benzer olduğu bildirilmektedir (Purcifull ve ark., 1984).
Çizelge 2.1. Dünya‟da kabakgil üretim alanlarında tespit edilen virüsler
Virüs adı Konukçu bitki türü Ülke Kaynak
WMV-1, WMV-2, CMV Kabak ABD Webb, 1971
WMV-1 (PRSV-W), WMV-2 Bal ve sakız kabağı Avustralya Greber, 1978
CMV, WMV-2 Kabakgiller İran Rahimian ve Izadpanah, 1978
WMV-2 Bal kabağı Irak Shawkat ve Fegla, 1979
CMV, WMV-2, CGMMV Kavun Japonya Yoshida ve ark., 1980
ZYMV Kabak İtalya Lisa ve ark., 1981
WMV-2 Kavun, kabak Ürdün Al-Musa ve ark., 1982
WMV-2, SqMV Kavun ABD Dodds ve ark., 1984
ZYMV Kabakgiller ABD Nameth ve ark., 1985
WMV-1, WMV-2, ZYMV, CMV, SqMV,
SLCV ve LIYV Kabakgiller ABD Nameth ve ark., 1986
ZYMV, WMV-1, CMV Kavun, karpuz Tayland Chang ve ark., 1987
CMV, WMV-2 Kabak ABD Davis ve Mizuki, 1987
WMV-2, PRSV-W, WMV-Morocco Kabakgiller Güney Afrika Meer ve Garnett, 1987
ZYMV, WMV-2 Kabak ABD Crosslin ve ark., 1988
ZYMV Kabak, kavun İran Ghorbani, 1988
ZYMV, CMV, WMV-2 Hıyar Japonya Iwasaki ve Inaba, 1988
CMV, PRSV-W, WMV-2, TRSV Kabak ABD Sammons ve ark., 1989
CMV, PRSV-W, WMV-2, ZYMV Kabakgiller Meksika Delgadillo-Sanches ve ark.,
1989
ZYMV Kabak Çekoslavakya Chod ve Jokes, 1991
CMV, WMV-2, ZYMV Kabak, hıyar Yunanistan Kyriakopoulou ve Varveri,
1991
WMV-2, CMV, PYMV, PYVMV Bal kabağı Hindistan Singh ve ark., 1991
CMV, CVYV, ZYMV Hıyar Ürdün Mansour, 1994
ZYMV Kavun Meksika Orozco ve ark., 1994
WMV-2, SqMV Kabak ABD Celeste ve ark., 1996
ZYMV Kabak Martinik Desbiez ve ark., 1996
CMV, CABYV, PRSV-W, ZYMV Kabakgiller Nepal Dahal ve ark., 1997
WMV-2, PRSV, WMV-2, ZYMV Karpuz, kabak ABD Murphy ve ark., 2000
ZYMV, CABYV, WMV-2, PRSV-W,
CMV Kabakgiller Lübnan Abou-Jawdah ve ark., 2000
WMV-2, PRSV-W, ZYMV Kavun, karpuz Brezilya Oliveira ve ark., 2000
TLCV Hıyar Tayland Samretwanich ve ark., 2000
MNSV Kavun İtalya Tomassoli ve Barba, 2000
ZLCV, CMV, PRSV-W, WMV-2, ZYMV Kabakgiller Brezilya Yuki ve ark., 2000
WMV-2, WMV-M, ZYMV Kabakgiller Güney Afrika Cradock ve ark., 2001
WMV-2, PRSV, ZYMV Kabakgiller Yeni Gine Davis ve ark., 2002
CMV, WMV-2 Kavun İspanya Alonso ve ark., 2003
CMV, PRSV-W, SqMV, ZYMV Kabakgiller ABD Walters ve ark., 2003
WMV, ZYMV, CMV Kabakgiller Türkiye Sevik ve Arli-Sokmen, 2003
CGMMV, WMV-2, PRSV-W Kabakgiller Pakistan Ali ve ark., 2004
CMV, CABYV, BPYV, CVYV, CYSDV,
MNSV, PRSV, WMV, ZYMV Kabakgiller İspanya Juarez ve ark., 2005
ZYMV, PRSV-W, CABYV, WMV,
CYSDV, BPYV, CVYV Kabakgiller Güney Kıbrıs Papayiannis ve ark., 2005
ZYMV, WMV-2, CMV, PRSV-W,
SqMV, MNSV Karpuz, kavun Türkiye Köklü ve Yilmaz, 2006
CMV, ZYMV,. WMV-2, TSWV Kabakgiller İran Massumi ve ark., 2007
BPYV, CABYV, CMV, CYSDV, WMV,
MNSV, ZYMV, CVYV, PRSV Kabakgiller İspanya Kassem ve ark., 2007
Davis ve Mizuki (1987), ABD‟nin New Jersey eyaletinde yaptıkları üç yıllık bir survey çalışmasında; 1983 yılında kabakta CMV ve WMV-2 yoğun olarak görülürken, 1984 yılında PRSV-W‟nin tahripkâr tür olduğunu, kabak ve diğer kabakgillerde şiddetli kayıplara sebep olan ZYMV‟nün ise ilk kez 1985 yılında tespit edildiğini bildirmektedirler. Araştırıcılar, araziden topladıkları hastalıklı bitki örneklerinde ZYMV, WMV-2 ve PRSV-W‟nin karışık enfeksiyonlarına da rastlamışlar. Bu karışık enfeksiyonlu örneklerden, hassas test bitkilerine yapılan yapay inokulasyonlardan sonra, test bitkilerinin ELISA ile test edildiğinde genellikle ZYMV‟nün diğer türleri baskı altına aldığı görülmüştür. Böylece ZYMV‟nün oldukça agresif olduğu ve karışık enfeksiyonlarda PRSV-W ve WMV-2‟ne göre rekabette daha avantajlı olduğunun görüldüğü bildirilmektedir.
1991 yılında Hawai adalarında yapılan bir çalışmada ise kabakgillerde ZYMV, PRSV-W ve CMV tespit edilmiştir (Ullman ve ark., 1991).
Lecoq ve ark. (1992) Fransa‟da kabakgillerin çok sayıda virüs hastalığından etkilendiğini, bunların başında da afitlerle taşınan CMV, WMV-2 ve ZYMV‟nin geldiğini, CABYV virüsünün de üretim alanlarında önemli ölçüde bulunduğunu bildirmektedirler.
Doğu Kaliforniya (ABD)‟da, kabakgil ekim alanlarında yapılan survey çalışmalarında WMV-2 ve ZYMV adlı virüslerin ekonomik manada zararlı olduğu bildirilmektedir (Perring ve ark., 1992).
Dogimont ve ark. (1996) Fransa‟da gerçekleştirdikleri bir çalışmada Cucurbitaceae familyasındaki bitkilerin afit kaynaklı birçok virüsten etkilendiğini bildirmişlerdir. Araştırıcılar çalışmalarında CMV, WMV-2 ve ZYMV adlı virüslerin yaygın olduğunu, bununla birlikte son yıllarda tanımlanan ve Kabakgil Afit Kaynaklı Sarılık Virüsü (CABYV) adı verilen virüsün de kabakgil üretim alanlarında saptandığını bildirmektedirler. Çalışmada CABYV virüsünün Akdeniz bölgesinde yaygın olarak bulunduğu ve kavun, hıyar, kabak ve karpuz bitkilerinde zararlı olduğu bildirilmektedir.
Dahal ve ark. (1997) tarafından Nepal‟in 68 farklı lokasyonunda, papaya ve kabakgil sebzelerinin yetiştirildiği ekim alanlarında gerçekleştirilen survey çalışmasında, ürünlerin yoğun biçimde farklı virüs benzeri belirtiler gösterdiği gözlenmiştir. Bu hastalık belirtilerinin ortalama yaygınlıklarının; papayada %75-100, sakız kabağında %85-100, hıyarda %4-100, balkabağında %4-100 ve su kabağı, choyote kavunu ve karpuzda %10-100 arasında olduğu bildirilmektedir. Yapılan DAS-ELISA ve SDS-immunodiffusion testleri sonucunda, papaya ve sakız kabağından izole edilen
virüsün PRSV-W olduğu tespit edilmiştir. Aynı virüs diğer kabakgillerde de saptanmıştır. Bazı hıyar, choyote kavunu, bal kabağı, sakız kabağı ve acur yaprak örneklerinde CMV ve ZYMV tespit edilmiştir. Kış kavunu, hıyar ve balkabağı örneklerinin bir kısmında ise CABYV saptanmıştır. Çalışmada ELISA testine tabi tutulan hiçbir örnekte WMV-2 ve SqMV‟ne rastlanmamıştır.
İspanya kavun ekim alanlarında 1995-1996 yıllarında yapılan survey çalışmalarında CMV ve WMV-2 en çok saptanan virüsler olurken, PRSV-W ve ZYMV‟ne daha az alanda ve daha düşük şiddetlerde rastlanmıştır (Luis-Artega ve ark., 1998).
Rezende ve ark. (1998), Brezilya‟da kabakgillerde 8 farklı virüsün saptandığını PRSV-W, WMV-2, ZYMV, CMV ve SqMV isimli virüslerin yaygın olduğu belirlenirken, PRSV-W adlı virüsün ise kabakgillerin en yıkıcı patojenlerinden birisi olduğunu ve PRSV-W‟ye karşı kabakgiller içerisinde en hassas türün zucchini kabağı olduğunu bildirmektedirler.
Yuki ve ark. (2000) tarafından, Brezilya‟nın Sao Paula eyaletinde kabakgil yetiştiriciliği yapılan bölgelerinde 1997-1999 yıllarında gerçekleştirilen surveylerde 621 bitki örneği toplanarak PTA-ELISA yöntemiyle virüs enfeksiyonları tespit edilmiştir. PTA-ELISA testleri sonucunda PRSV-W (% 49,1) ve ZYMV (% 24,8) en yaygın virüsler olarak belirlenmiştir. Ayrıca, ZLCV (% 7,8), CMV (% 6,0) ve WMV-2 (% 4,5) tespit edilmiştir.
Abou-Jawdah ve ark. (2000) tarafından 1996-1997 yılında Lübnan‟da gerçekleştirilen bir survey çalışmasında, 67 bahçeden toplam 382 bitki örneği toplanmış ve DAS-ELISA ile CMV, CABYV, MNSV, PRSV-W, SqMV, WMV ve ZYMV‟ne karşı test edilmiştir. Çalışma sonucunda, ZYMV ve CABYV en yaygın virüsler olarak ortaya konulmuştur. Bu virüslerin yaygınlıkları sırasıyla, kabakta %64 ve %65 ve kavunda ise %44 ve %30 olarak tespit edilmiştir. Bu iki virüsü WMV, PRSV-W ve CMV takip etmiştir. MNSV ve SqMV bulaşık örneklerin sırasıyla %1 ve %2‟sinden daha azında tespit edilmiştir. İkili ve üçlü enfeksiyonlar ise örneklerin %37‟sinde görülmüştür. Ayrıca kabakta yapılan çapraz-koruma çalışmalarında, zayıf strain olan ZYMV-WK inokule edilen bitkilerde, kontrole kıyasla şiddetli virüs hastalık belirtilerine karşı önemli ölçüde koruma sağlanmış ve verim artışı görülmüştür. Bununla birlikte, en iyi koruma ve en yüksek verim floating row covers (vektör zararını önleyen özel bir örtü) uygulaması ile sağlanmıştır. Çapraz koruma ile birlikte gümüş malç
uygulaması veya floating row covers uygulamasının korumayı daha da artırdığı bildirilmektedir.
Güney Afrika‟nın KwaZulu-Natal bölgesinde 1997-1998 yıllarında kabakgil ekim alanlarında gerçekleştirilen bir survey çalışmasında; toplanan kabakgil bitki örneklerinde DAS-ELISA testiyle 1997 yılında 4 adet virüsün (ZYMV, 2 WMV-M, CMV), 1998 yılında ise bu dört virüse ilaveten PRSV ve SqMV varlığına bakılmıştır. DAS-ELISA çalışmaları sonucunda en yaygın virüs olarak ZYMV (% 50.67) saptanmıştır. Bu virüsten başka WMV-M (% 24), WMV-2 (% 22.67) ve CMV‟nü (% 6.67) saptamışlardır. Ayrıca örneklerin % 32‟si birden fazla virüs ile enfekteli bulunmuştur (Cradock ve ark., 2001).
Davis ve ark. (2002), Papua, Endonezya, Papua Yeni Gine ve Avusturalya‟nın Torres Strait Adaları, Gove ve Cape York Yarımadasında 1996-2000 yıllarında gerçekleştirdikleri survey çalışmasında, DAS-ELISA ve RT-PCR yöntemi ile kabakgil bitkilerinde CMV, PRSV, WMV-2 ve ZYMV‟ne bakmışlar. Araştırıcılar, bal kabağı (Cucurbita maxima) ve Trichosanthes cucumerina‟da ZYMV; PRSV ve WMV;
Cucurbita moschata‟da ZYMV‟nün tespit edildiğini bildirmektedirler.
Pakistan‟da 2002 yılında gerçekleştirilen bir survey çalışmasında, 28 kabakgil üretim alanından toplanan örneklerde yoğun olarak CGMMV (%46,9), bu virüsü takiben ZYMV (%14,8), WMV (%12,5) ve PRSV (%7,8) tespit edilmiştir. Örneklerde yoğun miktarda ikili (%42) ve üçlü (%8) enfeksiyonlar da saptanmıştır (Ali ve ark., 2004).
Finetti-Sialer ve ark. (2005) tarafından 2000-2001 yıllarında Arnavutluk‟ta, sebze üretim alanlarındaki viral hastalıkları ortaya koymak için gerçekleştirilen çalışmada, viral hastalık belirtileri gösteren 16 adet sakız kabağı, 13 adet karpuz ve 13 adet hıyar bitkisi örneklerini enfekte eden virüsler Dot-blot hibridizasyon yöntemiyle ortaya konulmuştur. Testlemeler sonucunda sakız kabağının 3 tanesinin CMV, 1 tanesinin domates lekeli solgunluk virüsü (TSWV) ve 2 tanesinin WMV–2 ile 3 hıyar örneğinin ise 1 tanesinin CMV ve 1 tanesinin de WMV–2 ile enfekteli olduğu bulunmuştur. Karpuz örnekleri ise hiçbir virüsle bulaşık bulunmamıştır.
Davis ve ark. (2005) tarafından 2002-2003 yıllarında, Cook adalarındaki sebzelerde görülen virüs hastalıklarını ortaya koymak için gerçekleştirilen survey çalışmalarında, karpuz, hıyar, bal kabağı, kavun bitkilerinde CMV‟nün, PRSV-W „nin ise bu kabakgillere ilaveten sakız kabağında da tespit edildiğini bildirmektedirler. Aynı araştırıcılar, çalışma kapsamında DAS-ELISA ve RT-PCR testlerine tabi tutulan
kabakgil bitkileri örneklerinde WMV, ZYMV ve SqMV‟lerinin saptanmadığını bildirmektedirler.
Papayiannis ve ark. (2005), Güney Kıbrıs kabakgil üretim alanlarında sorun olan virüs hastalıklarını ortaya koymak için 2000-2002 yılları arasında gerçekleştirdikleri surveyde 2993 adet hıyar, kavun, kabak ve karpuz örneği toplamışlardır. ZYMV, PRSV-W, WMV, CABYV, CMV ve SqMV DAS-ELISA ile Hıyar sarı bodurlaşma virüsü (CYSDV), Pancar yalancı sarılık virüsü (BPYV) ve Hıyar sarı damar virüsü (CVYV) ise RT-PCR ile saptanmıştır. Çalışma sonucunda, ZYMV %45 bulaşıklık oranı ile kabakgillerdeki en yaygın virüs olarak belirlenmiştir. Örneklerde ZYMV‟nü takiben PRSV-W (%20,8), CABYV (%20,8) ve WMV (%7,8) virüsleri de saptanmıştır. CYSDV çoğunlukla seralarda yetiştirilen ve solgunluk belirtisi gösteren hıyar bitkilerinde saptanırken (%88,1), BPYV ve CVYV sırasıyla, örneklerin sadece %2,4 ve %9,5‟inde bulunmuştur. Bu çalışmada toplanan hiçbir bitki örneğinde CMV ve SqMV tespit edilmemiştir.
Boubourakas ve ark. (2006) tarafından 2000-2003 yıllarında, Yunanistan‟da, sera ve açık alanda yetiştirilen hıyar ve kavun bitkilerinde solgunluğa sebep olan virüslerin yaygınlığını ortaya koymak amacıyla gerçekleştirilen survey çalışmalarında toplanan 73 hıyar, 6 kavun ve 38 yabancı ot örneğinde, CABYV, BPYV ve CYSDV enfeksiyonunu ortaya koymak için DAS-ELISA ve Simplex RT-PCR yöntemleriyle testlenmişlerdir. Testlemeler sonucunda; BPYV hıyar (%67) ve kavun (%66) bitkilerinde baskın virüs olarak saptanmış, bu çalışma ile Yunanistan‟da ilk kez rapor edilen CYSDV (%15) ise sadece 3 bölgede izole edilebilmiş, CABYV ise sadece üç hıyar serasında tespit edilmiştir. Amaranthus retroflexus, Selosia cristata, Sonchus
oleraceus ve Sonchus sp. yabancı ot türlerinin de BPYV için potansiyel bir konukçu
olduğu bildirilmektedir.
Kassem ve ark. (2007) tarafından, İspanya‟nın Murcia şehri kavun ve kabak bahçelerinde, 2003-2004 yıllarında yapılan survey çalışmasında 48 bahçeden (36 kavun, 12 kabak) toplam 924 bitki örneği (700 kavun, 224 kabak) toplanmıştır. Araştırıcılar topladıkları bitki örneklerinde, dot blot hyridization yöntemiyle BPYV, CABYV, CMV, CVYV, CYSDV, PRSV, WMV, ZYMV ve MNSV enfeksiyonlarını tespit etmeye çalışmışlardır. Çalışma sonucunda örneklerin %90‟ının en az bir virüsle bulaşık olduğunu ve kavun örneklerinin %83‟ünün, kabak örneklerinin ise %66‟sının CABYV ile bulaşık olduğunu saptamışlardır. CABYV‟ yi kavun örneklerinde CYSDV, BPYV ve WMV %20-30, kabak örneklerinde ise CVYV ve BPYV %21-28 arasında bulaşıklık
oranları ile takip etmişlerdir. Araştırıcılar ayrıca çoklu enfeksiyon miktarının kavun ve kabak bitkilerinde sırasıyla %66 ve 56 ile oldukça yüksek olduğunu bildirmektedirler. Çoklu enfeksiyonların tamamında CABYV saptanmıştır. Araştırıcılar bu çalışma kapsamında tespit ettikleri CABYV izolatlarını yaptıkları RFLP analizleri ile genetik olarak iki gruba ayırmışlardır.
Massumi ve ark. (2007), İran‟ın farklı bölgelerinde, kabakgil üretimi yapılan seralardaki virüs hastalıklarını ortaya koymak amacıyla 2002-2004 yılları arasında gerçekleştirdikleri survey çalışmalarında rasgele 1304 ve hastalık belirtisi gösteren 1085 bitki ve meyve örneği toplamışlar. Toplanan bu örnekler CMV, SqMV, PRSV-W, WMV-2, ZYMV, CuNV ve TSWV enfeksiyonlarını saptamak için DAS-ELISA testine tabi tutulmuşlar. Test edilen örneklerde CMV (%21,2) ve ZYMV (%18) en yaygın virüsler olarak saptanmışlardır. WMV-2 %4,3 yaygınlık oranıyla 15 bölgede tespit edilirken, TSWV %1,25 yaygınlık oranıyla sadece 2 bölgede tespit edilmiştir. Ayrıca araştırıcılar Hıyar nekroz virüsü (CuNV), SqMV ve PRSV-W‟nin hiçbir örnekte tespit edilmeğini bildirmektedirler.
Meng ve ark. (2007), Dot-blot hibridizasyon yöntemiyle, digoxigenin-etiketli cDNA probları kullanarak kabakgillerde sorun olan ZYMV, WMV, CMV, PRSV-W ve SqMV‟nü enfekteli bitki yaprakları ekstraksiyonundan tanılamışlardır.
Jossey ve Babadoost (2008) tarafından 2004-2006 yıllarında Illinois (ABD)‟de yapılan survey çalışmalarında toplanan kabak örnekleri DAS-ELISA ile CMV, PRSV, SqMV, TRSV, ToRSV, WMV ve ZYMV‟ne karşı testlenmişler ve testleme sonucunda CMV, PRSV, SqMV, TRSV, ToRSV, WMV, ZYMV ve türü teşhis edilememiş bir potyvirüs tespit edilmiştir. Araştırıcılar serolojik olarak teşhis ettikleri TRSV‟nü, RT-PCR çalışmasıyla da tespit etmişler. Surveyin yapıldığı eyalette, WMV‟nün en yaygın virüs olduğu ve bunu SqMV‟nün takip ettiği bildirilmektedir.
2004 ve 2005 yıllarında İran‟da gerçekleştirilen bir survey çalışmasında hastalık belirtisi gösteren toplam 757 kabakgil bitki örneği ve 31 yabancı ot örneği taplanarak WMV varlığı açısından DAS-ELISA ve RT-PCR yöntemleriyle testlenmişlerdir. Spesifik poliklonal antibadi kullanılarak gerçekleştirilen DAS-ELISA testleri sonucu 788 yaprak örneğinden 190 adedinin WMV ile bulaşık olduğu ortaya konmuştur. DAS-ELISA testine tabii tutulan, farklı genuslara ait yabancı ot örneklerinden sadece acı karpuz (Citrullus colocynthis L.) pozitif sonuç vermiştir. Pozitif örneklerden 18 adet izolat seçilerek RT-PCR ile kılıf protein geninin 804 bp‟lik kısmı ile Nlb geninin 18 bp‟lik kısmı WMV-F ve WMV-R primer çifti ile çoğaltılmıştır. RT-PCR çalışması
sonucu elde edilen 18 izolata ait ürünler klonlanıp, dna dizilimleri belirlenmiştir. Dizi analizi sonucunda, 18 izolattan 12 adedinin %96,2-%99,9 oranlarında benzer nükleotidleri taşıdıkları görülmüştür (Sharifi ve ark., 2008).
Vucurovic ve ark. (2012) tarafından, Sırbistan‟da yürütülen bir survey çalışmasında toplanan 700 adet kabak ve balkabağı bitkilerinin, gerçekleştirdikleri DAS-ELISA ve RT-PCR testleri sonucunda ZYMV (%79,2), WMV (%32,2) ve CMV (%12,8) ile bulaşık olduğu belirlenmiştir.
2.2. Ülkemizde Kabakgil Virüsleri Üzerinde Yapılan ÇalıĢmalar
Ülkemizde, kabakgil bitkilerinin yetiştirildiği alanlarda üretimi sınırlayan çok sayıda viral etmen saptanmıştır. Bu etmenlerin ve yaygınlıklarının belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmalar aşağıda özetlenmeye çalışılmıştır.
Erdiller ve Özyanar (1983)‟ın Ankara‟nın Kalaba semti civarında hıyar ekim alanlarından topladıkları örneklerde; mekanik inokulasyon, serolojik testler ve elektron mikroskobu çalışmalarında CMV‟nün bulunduğunu saptamışlardır. Araştırmada aynı zamanda CMV‟nün hıyar bitkilerinin fizyolojik ve biyokimyasal faaliyetleri üzerindeki etkisi, kontrollü koşullarda yetişen sağlam ve hasta bitkilerin primer yaprakları, inokulasyon ile çiçeklenme başlangıcı arasındaki dönemde periyodik olarak solunum, nişasta, protein, indirgenebilir şeker ve klorofil miktarındaki değişimleri araştırmışlardır. İnokulasyondan sonraki ilk hafta içinde nişasta ve indirgenebilir şeker miktarındaki düşüş, solunumdaki artış ile birlikte bitkilerde bu dönemde hızlı bir glukoz parçalanması olayının gerçekleştiğini ve bol miktarda serbest enerjinin açığa çıktığını göstermektedir. Buna karşılık ise sağlam salatalık primer yapraklarında sürekli bir şekilde nişasta birikimi meydana geldiğini görmüşlerdir. Bu olayın ise yaprağın giderek yaşlanması nedenine bağlamışlardır. Sonuç olarak solunum, nişasta ve indirgenebilir şeker miktarları arasında bir ilişkinin olduğunu saptamışlardır.
Nogay (1983), Marmara bölgesinde 9 ilde Cucurbitaceae familyası bitkilerinde görülen virüsleri tanılamış, etmenlerin tohumla taşınıp taşınmadıklarını ve familya içindeki konukçularını saptamıştır. 1979 yılında yapılan surveylerde bölgede hastalık oranları tespit edilmiştir. Alınan örneklerde biyolojik ve serolojik yöntemler, fiziksel özellikler ve elektron mikroskop incelemeleri ile CMV ve WMV-2 belirlenmiştir. CMV‟nin % 10-90 oranında kayıplara neden olduğu tespit edilmiştir. CMV ve WMV-2 izolatlarının Cucurbitaceae familyası bitkilerinde tohumla taşınmadıkları saptanmıştır.
Familya içindeki konukçuları belirlemek için 14 çeşit kullanılmıştır. CMV izolatları hıyar, kabak ve kavun çeşitlerini lokal ve sistemik hastalandırmıştır. Karpuz çeşitlerinden biri hariç diğerlerinde sistemik enfeksiyon görülmemiştir. WMV-2 izolatları denenen bütün çeşitleri hastalandırmıştır.
Nogay ve Yorgancı (1984), Marmara bölgesinde kabakgillerde görülen virüs hastalıkları üzerinde çalışmalar yapmışlardır. Kabakgillerde zararlı virüsleri bitkilerde oluşturdukları reaksiyonlar, fiziksel özellikler, serolojik testler ve elektron mikroskobu yöntemiyle tanımlamışlardır. Yapılan çalışmalar, Anadolu yakasında CMV‟nün, Trakya‟ da ise WMV-2‟ nün hâkim olduğunu göstermiştir.
Akdeniz sahil şeridinde yetiştirilen bazı sebzelerde zararlı virüslerin tanımı serolojik ve biyolojik yöntemler ve elektron mikroskobu yardımı ile yapılmıştır. Domates (Lycopersicon esculentum), biber (Capsicum annum) ve fasulyelerde (Phaseolus vulgaris) TMV; biber, domates ve karpuzda (Citrullus vulgaris) CMV; marulda (Lactuca sativa) Marul Mozayik Virüsü, biberde PVY, karpuz ve kabakta (Cucurbita pepo) ZYMV saptanmıştır (Yılmaz ve Davis, 1985).
Erdiller ve Ertunç (1987), PRSV-W‟nin “Yuva” kavun çeşidinde oluşturduğu fizyolojik ve biyokimyasal değişimleri araştırmışlardır. PRSV-W ile enfekteli bitkilerde protein miktarının arttığı buna karşılık diğer fizyolojik ve biyokimyasal faaliyetlerin azaldığını tespit etmişlerdir.
Özyanar ve Sako (1987), CMV‟nün sarı (CMV-Y) ve Zinnia (CMV-Z) ırkları DAS-ELISA, ön kaplama yapılmadan uygulanan I-ELISA (Indirect-ELISA) ve DIBA (Dot Imminobinding Assay) yöntemleri kullanarak teşhis etmişlerdir. DAS-ELISA yönteminde gözlenen reaksiyonlar iki ırkın ayırt edilmesinde yeterli olsa da absorbans değerleri her zaman I-ELISA yöntemine göre düşük olmuştur. CMV-Y değerleri hem DAS-ELISA hem de I-ELISA yöntemlerinde CMV-Z değerlerinden yüksek bulunmuştur.
Erdiller ve Ertunç (1988), Ankara ili çevresindeki kavun ekim alanlarında 1981-1984 yılları arasında virüs hastalıklarını tespit etmek için survey çalışması gerçekleştirmişlerdir. Toplanan örneklerdeki virüsler biyolojik ve fiziksel özellikleri, serolojik reaksiyonları ve elektron mikroskop incelemeleri ile teşhis edilmişlerdir. Yapılan çalışmalar sonucunda araştırma bölgesinden Hıyar Mozayik Virüsünün (CMV) iki farklı ırkı, Karpuz Mozayik Virüsü-1 (WMV-1) ve Karpuz Mozayik Virüsü-2 (WMV-2)‟nin mevcut olduğu ve bunlar içinde de en yaygın enfeksiyonun WMV-1‟ e ait olduğu saptanmıştır.
Ertunç (1988), CMV‟nün Zinnia (CMV-Z) ve sarı (CMV-Y) ırklarını Dot-ELISA tekniği kullanarak teşhis etmiştir. Araştırıcı Dot-Dot-ELISA tekniğinin, I-Dot-ELISA ve DAS-ELISA tekniklerine göre daha iyi sonuç verdiğini bildirmektedir.
Ertunç (1989), hıyar mozayik virüsünün sarı (CMV-Y) ve Zinnia (CMV-Z) ırkları, latex ile kaplı CMV-Y antiserumunun kullanıldığı latex çöktürme (LF testi ) ve antikorlarla hassaslaştırılmadan önce latex partiküllerinin protein A ile kaplandığı antiserumun kullandığı protein A kaplı latexe bağlı antiserum testi (PALLAS testi) ile serolojik olarak tespit etmiştir. Yapılan çalışma sonucunda her iki testin de, CMV ırklarına kolaylıkla uygulanabildiği ve kısa sürede tespit ettiği görülmüştür.
Çukurova bölgesinde gerçekleştirilen bir çalışmada, kabakgil familyası bitkilerine zarar veren virüs hastalıklarından farklı olarak kavun, karpuz ve hıyar bitkilerinde damar açılması, damar sararması, cüceleşme, sarı mozayik ve üründe önemli miktarda azalmaların nedeni araştırılmıştır. Mekanik inokulasyon çalışmaları, doğal taşınma, vektör taşıma deneyleri, elektron mikroskop incelemeleri sonucu etmenin CVYV olduğu tespit edilmiştir (Yılmaz ve ark., 1991).
Ertunç (1992a) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada, Ankara ilinde yapraklarında sistemik mozayik, meyvelerinde kabarcıklar ve deformasyon belirtileri gösteren kabak bitkilerinde sorun olan viral etmen belirlenmiştir. Araştırıcı, konukçu dizisinin tespiti, serolojik testler, özsu içindeki virüsün fiziksel özelliklerinin tespiti ve elektron mikroskop çalışmaları sonucunda etmenin ZYMV olduğunu bildirmektedir.
Cucurbitaceae familyası kültür bitkisi tohum örneklerinin, CMV‟nü taşıma durumlarını ortaya koymak amacıyla gerçekleştirilen çalışmada tohum örnekleri DAS-ELISA yöntemiyle testlenmişlerdir. Yapılan çalışmalar sonucu 1 karpuz, 1 kavun, 3 hıyar, 2 kabak ve 2 bal kabağı tohumu olmak üzere 9 örneğin etmenle bulaşık olduğu tespit edilmiştir (Ertunç 1992b).
Yılmaz ve ark. (1992), 1991 yılında Akdeniz bölgesinde Adana ve İçel, Ege Bölgesinde İzmir, Manisa ve Afyon, İç Anadolu Bölgesinde Konya illerinden; hıyar, yazlık kabak, kışlık kabaklar, karpuz, kavun, lif kabağı, su kabağı ve acurdan oluşmak üzere toplam 76 örneği DAS-ELISA testine tabi tutmuşlardır. Test sonucunda bu örneklerde ZYMV, WMV–2, CMV, CABYV, PRSV-W virüslerine rastlanmasına rağmen SqMV, ZYFV, WMV-M ve WMV-A virüsleri saptanamamıştır. Bunun yanında söz konusu çalışma bölgelerinde en yaygın virüsün ZYMV olduğu ortaya çıkarılmıştır. Bu çalışma ile CABYV ülkemizde ilk kez rapor edilmiştir.
Fidan (1993), Muğla ilinde seralarda yetiştirilen hıyar bitkilerinde sorun olan viral etmenlerin, gerçekleştirdiği ELISA testi sonucunda ToRSV ve TBRV olduğunu bildirmektedir. Bu hastalıklar, aynı zamanda Türkiye için ilk kayıt olarak belirtilmiştir.
Yılmaz ve ark. (1994), Çukurova bölgesi koşullarında ZYMV‟nün şiddetli ırkının ZYMV‟nün zayıf ırkı (ZYMV-WK) ile kontrolünü amaçlamışlardır. Bitkilere ZYMV‟nün şiddetli ırkı, zayıf ırk, ZYMV+ZYMV-WK birlikte ve kontrol olmak üzere 4 uygulama yapılmıştır. Uygulamalarda verim değerleri yönünden istatistikî olarak fark bulunmamıştır. Ancak meyve sayısı ve meyvenin ticari değeri yönünden farklar gözlenmiştir. Kabak bitkilerinde ticari değeri olan meyve çapraz-koruma yapılan parsellerde % 69-80, korumasız parsellerde % 32; hıyar bitkilerinde çapraz-koruma yapılan parsellerde % 83-87, korumasız parsellerde % 33-40 olarak belirlenmiştir.
Fidan (1995), İzmir ve Muğla illerinde seralarda yetiştirilen bazı sebzelerde 1992-1994 yıllarında survey çalışmaları gerçekleştirmiş ve virüs hastalıkları biyolojik ve serolojik (ELISA) yöntemler kullanarak tespit etmiştir. İzmir ilinde hıyarlarda CMV, Muğla ilinde ToRSV ve TBRV saptanmıştır.
Vargün ve Ertunç (1995), kabak bitkisinde CMV ve ZYMV‟nün birlikte ve ayrı ayrı enfeksiyonlarının bitki gelişim komponentlerine (Bitki boyu, çiçek ve yaprak sayısı, genç, orta ve yaşlı yaprak alanı) etkisini incelemişlerdir. Araştırıcılar gerçekleştirdikleri çalışmalar sonucunda, bitki boyunda en fazla düşüşe ZYMV+CMV uygulaması, çiçek sayısında en fazla düşüşe CMV, yaprak sayısında en fazla düşüşe CMV ve ZYMV karışımının sebep olduğunu bildirmektedirler.
Amasya, Çorum, Samsun ve Tokat illerinde balkabağı, sakız kabağı, karpuz ve kavun bitkilerinde verim ve kaliteyi düşüren virüs hastalıklarını belirlemek için 1995 yılında bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Tarla ve sera koşullarında söz konusu kültür bitkilerindeki simptomlara ve enfekteli bitki yapraklarının özsularının indikatör test bitkilerine mekanik inokulasyonları sonucu bu bitkilerde sergiledikleri belirtilere göre üç ayrı virüs saptanmıştır. Araştırıcılar bal kabağında ve karpuzda CMV, sakız kabağı ve kavunda ZYMV‟nü tespit ettiklerini bildirmektedirler (Çıtır ve ark., 1998).
Antalya ilinde örtü altında kabak yetiştiriciliğinde sorun olan ZYMV‟nün taşınması ve yayılmasında etkili olan yabancı ot ve vektör türlerini belirlemek ve etmenin tohumla taşınma durumunu ortaya koymak amacıyla bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Toplanan kabak bitkisi, yabancı ot, tohum ve afit örneklerindeki viral bulaşıklık I-ELISA testi ile teşhis edilmiş. Araştırma sonucunda ZYMV Aphis
Amaranthus sp., Medicago sp. Vicia sp., Ranunculus sp. Veronica sp. Onobrichus sp., Erysymum sp., Euphorbia sp., Anthemis sp. Cynorus sp. yabancı ot cinslerinde
saptanmıştır. Ayrıca çiftçi tarafından kullanılan tohumların da etmen ile bulaşık oldukları bildirilmektedir (Uçar ve Ertunç, 1998).
Yardımcı ve ark. (2000) Isparta ilinde Cucurbitaceae familyası bitkilerinde hastalığa sebep olan viral etmenleri simptomatolojik ve serolojik yöntemlerle belirlemişlerdir. Çalışma sonucunda enfeksiyona ZYMV, CABYV ve WMV-2 adlı virüslerin sebep olduğu saptanmıştır.
Yılmaz ve Sherwood (2000), kabakgil bitkilerinde sorun olan önemli virüslerden CMV, PRSV-W, SqMV, WMV ve ZYMV‟nün teşhisinde Protein-A ELISA (PAS-ELISA), antijen kaplı ELISA tabağı ve ticari olarak mevcut olan Indirekt ELISA yöntemleri ve bazı kimyasalları karşılaştırarak en uygun metodu belirlemişlerdir. Araştırıcılar, indirekt ELISA metodunu, rutin virüs teşhisi ve arazi survey çalışmaları için en uygun yöntem olarak tespit ederken, izolatlar ve ırklar arası serolojik farklılıklar ve virüs antijen yoğunluklarının belirlenmesi için ise PAS-ELISA yöntemini en uygun metod olarak belirlemişlerdir.
Gümüş ve ark. (2001)‟nın ticari kabakgil tohumlarında gerçekleştirdikleri araştırmada hıyar tohumlarının %36,8, kavun ve kabak tohumlarının %18,5 oranında CMV ile enfekteli olduğunu saptarken hıyar tohumlarının %36,8 oranında CGMMV ile enfekteli olduğunu belirtmişlerdir.
Bostan ve ark. (2002a), tarafından Erzurum ve Artvin illerinde kabakgil ekim alanlarında sorun olan viral etmenleri belirlemek amacıyla survey çalışması gerçekleştirilmiştir. Araştırıcılar, topladıkları örneklerin tamamında serolojik ve biyolojik testler sonucu ZYMV varlığını belirlemişlerdir.
Yine Erzurum ve Artvin illerinde, Bostan ve ark. (2002b) tarafından, seralarda yürütülen bir sürvey çalışmasında mozayik, bronzlaşma, kloroz, deformasyon, yapraklarda kıvrılma ve gelişme geriliği gibi virüs benzeri simptom gösteren domates ve hıyar bitkilerinden yaprak örnekleri alınmış ve DAS-ELISA yöntemi ile testlenmiştir. Araştırıcılar, hıyarlarda % 4,3 oranında CMV tespit ettiklerini bildirmektedirler.
Çağlar ve Yılmaz (2002) tarafından, Çukurova bölgesinde kabakgillerde görülen SqMV‟nü farklı firmaların ithal ettiği kavun tohumlarında serolojik, biyolojik, SDS-PAGE, elektron mikroskop ve ds-RNA analiz yöntemi kullanarak belirlemişlerdir.
Dursunoğlu ve Ertunç (2003), Ankara ili ve çevresinde yetiştirilen kabakgillerde görülen ve kabakgillerin en önemli viral hastalıklarından biri olan CMV izolatlarının serolojik yöntemlerle belirlenmesini amaçladıkları çalışmalarında kabakgil ekim alanlarına 2002 yılında sürveyler düzenlemişlerdir. Sürveylerde topladıkları bitki örneklerinden elde ettikleri izolatları test bitkilerine inokulasyon ve DAS-ELISA yöntemi ile tanılamışlardır.
Sevik ve Arli-Sökmen (2003), Samsun ili kabakgil ekim alanlarında sorun olan virüsleri ve bunların yayılışını belirlemek amacıyla 1999-2000 yıllarında 18 köydeki 45 bahçede surveyler gerçekleştirmişlerdir. Alınan örneklerin biyolojik ve serolojik yöntemler ile testlenmesi sonucu % 53,9 WMV, % 38,8 ZYMV ve % 20,6 CMV tespit edilmiştir. ZYMV ve WMV enfeksiyonları tüm kabakgil bitkilerinde tespit edilirken, CMV karpuz ve balkabakları örneklerinin hiçbirisinde tespit edilememiştir. Aynı araştırıcılar ayrıca, CMV kapsid protein genine spesifik primerler kullanarak, enfekteli bitkilerde CMV enfeksiyonunu RT-PCR yöntemi ile belirlemişlerdir.
Hatay ilinde yetiştirilen kabakgil ekim alanlarındaki ZYMV‟nün yaygınlığını ve taşınma durumunu ortaya koymak için gerçekleştirilen bir çalışmada, Hatay ilinin farklı yörelerinden, 2003 yılında yazlık kabak (C. pepo), kışlık kabaklar (C. maxima ve C.
moschata), kavun (Cucumis melo) ve hıyar (Cucumis sativus) bitkilerinden simptom
gösteren yaprak ve meyve örnekleri toplanmıştır. Simptomlu bitkiler ELlSA ile testlenmiştir. Şiddetli simptom gösteren meyvelerden çıkarılan tohumlar çimlendirilerek her bir çeşitten 100'er fide ELlSA ile testlenmiş, 200'er bitkide simptom gözlemleri yapılmıştır. Tohumlardan %86-94 oranında bitki elde edilmiştir. Özellikle C. pepo ve C.
maxima fidelerinde %2-3 oranında genel kloroz, bodurlaşma ve yaprak deformasyonu
gözlenmiş, ELlSA sonucunda tohumlarından elde edilen fidelerin hiç birinde ZYMV belirlenmemiştir. Şiddetli simptom sergileyen C. sativus örneklerinin hiç birinde ZYMV belirlenememiştir. Şiddetli simptom gösteren C. pepo yapraklarından elde edilen özsu ile biyolojik testleme çalışmaları yapılmıştır. Mekanik inokulasyondan iki hafta sonra değişik test bitkilerinde ZYMV'ne özgü simptomlar gözlenmiştir. ELISA sonucunda ZYMV ile enfekteli olduğu belirlenen C. pepo bitkileri üzerinde 7 gün süre ile beslenen
Myzus persicae bireyleri l0'arlı gruplar halinde sağlıklı C. pepo fideleri üzerine
aktarılarak 3 gün süre ile tutulmuştur. Afitle taşıma çalışmalarında kullanılan test bitkilerinde üç hafta içerisinde yapraklarda klorotik ve mozayik lekelenmeler, şekil bozukluğu, bodurlaşma ve fide ölümleri gibi belirtiler ortaya çıkmıştır (Sertkaya ve ark, 2004).
Dağ (2005) tarafından, Gaziantep ili kabakgil ekim alanlarında sorun olan viral etmenleri ortaya koymak için 2004 yılında gerçekleştirilen survey çalışmasında toplanan örnekler DAS-ELISA yöntemiyle CMV, CABYV, ZYMV, ToMV, PVX, PVY, PMMV „ye karşı testlenmiştir. Yapılan testler sonucunda 56 örnekten 10 tanesinin bir veya daha fazla virüsle bulaşık olduğu ortaya konulmuştur. Bununla birlikte mevcut örneklerden 20 tanesinin CMV, 24‟ünün ZYMV ve 3 örneğin ise PVY ile bulaşık olduğu bildirilmektedir.
Adana, Mersin, Hatay ve Şanlıurfa illerinde üretimi yapılan kavun, domates ve biberlerde zararlı CMV izolatlarının tanımlanmaları, sınıflandırılmaları, çoğalttıkları satellit-RNA‟lerin büyüklerini ve satellit-RNA‟ların virüs üzerindeki etkisini araştırmak amacıyla bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Çalışma kapsamında yapılan surveylerle toplanan örnekler ELISA ile testlenmiş ve CMV ile enfekteli oldukları belirlenen kavun, domates ve biber bitkilerinden alınan örnekler mekanik inokulasyon yöntemi ile test bitkileri dahil olmak üzere kavun, domates, biber bitkilerine de aşılanmıştır. CMV izolatları enfekteli bitkilerden arılaştırılarak virionların elektrik ortamındaki hareket hızları kontrol edilmiştir. İzolatların RNA-1, RNA-2, kılıf proteini ve 2a proteinini kodlayan genleri üzerinde bazı bölgeler RT-PCR ile çoğaltılmıştır. PCR ürünleri RFLP çalışmasında MluI, Eco RI, Hind III, Bam HI ve Msp I endonükleaz restriksiyon enzimleri ile kesilmiş ve agaroz jelde görüntülenmiştir. Sonuçlar CMV-K, CMV-D ve CMV-B izolatlarının alt grup IA‟ ya ait olduğunu, üç izolatında 700 bp satellit-RNA‟ni çoğalttıkları, CMV-K‟nın zayıf ırk olduğunu ve bu ırkta simptomun satellit-RNA‟den kaynaklanabileceğini, CMV-K‟nın çapraz koruma (cross-protection)‟da kontrol ajanı olarak kullanılabileceğini ortaya koymuştur (Çağlar, 2006).
Köklü ve Yılmaz (2006), Tekirdağ, Edirne ve Kırklareli çevresinde, 2005 yılında, 17 kavun ve 19 karpuz bahçesinde yürüttükleri survey çalışmasında topladıkları 502 bitki örneğinde; CMV, PRSV-W, SqMV, MNSV, CGMMV, ZYMV ve WMV-2 virüslerinin bulaşıklıklarını ELISA testi ile ortaya koymaya çalışmışlardır. DAS-ELISA çalışmaları sonucunda; Tekirdağ ilinden toplanan 235 örneğin 167‟sinin, Edirne‟den toplanan 187 örneğin 103‟ünün ve Kırklareli‟den toplanan 80 örneğin 63‟ünün, toplam 502 örneğin 333 adedinin ise çalışılan virüslerle bulaşık olduğunu belirlemişlerdir. Serolojik testler, örneklerin çalışılan 7 virüsten 6‟sı ile bulaşık olduğunu göstermiştir. Karpuz örneklerinde, bulaşıklık oranları; ZYMV için %45,5, WMV-2 için %34,2, CMV için %19,9, PRSV-W için %2,1, SqMV için %1,8 ve MNSV için %0,4 iken kavun örneklerinde ise; ZYMV için %40,3, WMV-2 için 31,2, CMV için
%7,2, PRSV-W için %2,3, SqMV için %0,5 ve MNSV için %1,8 olarak saptanmıştır. WMV-2+ZYMV ikili enfeksiyonu oldukça yoğun olup, kavun örneklerinde %16,7, karpuz örneklerinde ise %11,4 oranında bulunmuştur.
Adana ve İçel illeri ile çevresinde, 2006- 2007 yılları arasında, örtü altı ve açık alanda yetiştirilen kabakgillerde saptanan ZYMV izolatının (ZYMV-FM) biyolojik, serolojik ve moleküler yöntemler kullanılarak tanısının yapılması ve bitki aktivatörlerinin ZYMV mücadelesinde kullanım olanaklarının araştırılması amacıyla bir çalışma gerçekleştirilmiştir. Araziden toplanan ve virüslü olduğundan şüphelenilen bitkiler, öncelikle ELISA yöntemi ile testlenmiş ve hastalık oranı % 51,2 olarak hesaplanmıştır. ZYMV ile infekteli olan örnekler içerisinde biri kodlanarak, mekanik inokulasyon ve vektör ile taşıma denemesi çalışmalarında kullanılmıştır. Araştırıcı, ZYMV ile infekteli örnekleri aynı zamanda RT-PCR ve IC-RT-PCR yöntemleri ile de teyit etmiştir. Kabakgillerde ZYMV‟ne karşı dayanıklılığın uyarılması çalışmalarında ise, ACTIGARD, MESSENGER ve ISR-2000 bitki aktivatörleri kullanılarak saksı ve arazi denemeleri ile bu hastalığa karşı etkinlikleri belirlenmiştir. ACTIGARD uygulandıktan 48 saat, MESSENGER ve ISR 2000 uygulandıktan 72 saat sonra ZYMV uygulanan bitkilerde kontrol bitkilerine göre simptom çıkış süresinde farklılıklar gözlenmiştir. Yapılan histokimyasal boyamalar ile de; bitki aktivatörleri uygulanan bitkilerde teşvik edilmiş dayanıklılıktan dolayı meydana gelen Lignin sentezi ile H2O2
birikiminin varlığı saptanmıştır (Çalışkan, 2007).
Karamanlı (2007) tarafından, 2006- 2007 yılları arasında, Kuzey Kıbrıs Türk Cumhuriyeti‟nde yetiştirilen kabakgillerde zararlı CMV ve ZYMV‟nün biyolojik, serolojik ve moleküler tanısının yapılması amacıyla bir çalışma yürütülmüştür. Çalışmada, araziden toplanan virüslü olduğundan şüphelenilen bitkiler, öncelikle ELISA yöntemi ile testlenmiş ve hastalık oranı CMV için % 8,07 ve ZYMV için % 34,5 olarak saptanmıştır. Ayrıca her iki virüsün karışık hastalık oranı da % 7,4 olarak saptanmıştır. Ayrıca, CMV ve ZYMV ile infekteli indikatör bitkilerinden total RNA ekstraksiyonu yapılmış ve bunlar RT- PCR yönteminde kullanılmıştır. Agaroz jel elektroforezde CMV ve ZYMV için sırasıyla 250 ve 650 bp‟lik band büyüklükleri gözlenmiştir.
Kaya ve Erkan (2007) tarafından İzmir, Aydın, Manisa ve Balıkesir illerinde gerçekleştirilen bir çalışmada; kabakgil alanlarında sorun olan viral etmenler belirlenmiştir. 2003 yılında toplanan örneklerdeki en yaygın viral etmenler kavun bitkilerinde %43,88 ve sakız kabağı bitkilerinde %30,32 oranı ile WMV-2, karpuz
bitkilerinde %24,16 oranında PRSV-W ve hıyar bitkilerinde %13,15 oranı ile CMV olarak belirlenmiştir. WMV-2 tüm kabakgillerde ve PRSV-W yalnızca karpuzlarda tespit edilirken, ZYMV hıyar ve karpuz örneklerinde, SqMV ve CGMMV ise hiçbir kabakgil örneğinde saptanmamıştır. 2004 yılında toplanan örneklerde ise WMV-2, kavun bitkilerinde %65, sakız kabağı bitkilerinde %50, bal kabağı bitkilerinde %88,8 ve hıyar bitkilerinde CMV %65 oranlarıyla belirlenmiştir. Ayrıca karışık enfeksiyonlar da tespit edilmiştir.
Paylan (2011) tarafından, ülkemizde taze tüketim ve tohumluk üretimi için öneme sahip olan bazı sebze türlerinin tohumlarındaki viral hastalık etmenlerinin bulunma durumlarını belirlemek, enfekteli olan tohumlardaki virüsleri elimine etmek ve bu etmenler için bir savaşım programı geliştirmek amacıyla bir çalışma yapılmıştır. Araştırma kapsamında, toplam 325 adet tohum örneğindeki viral etmenlerin tanılanmasında biyolojik, serolojik ve moleküler yöntemler kullanılmıştır. Araştırıcı, değişik virüslere karşı testlenen 30 karpuz örneğinin %17‟sinde CMV, 32 kavun örneğinin %38‟inde CMV ve %6‟sında SqMV, 30 hıyar örneğinin %13‟ünde CMV, 15 kabak örneğinin %27‟sinde CMV ve %20‟sinde ZYMV tespit edildiğini ve araştırmada kullanılan farklı sebze türlerine ait tohum örneklerindeki viral etmenlerin bulunuşlarının genel olarak %0-69 arasında değiştiğini bildirmektedir. Araştırıcı ayrıca, enfekteli 8 sebze tohum örneğine 10 farklı inaktifleştirme uygulaması gerçekleştirmiş ve bu uygulamaların sebze tohumlarındaki çimlenme değerleri üzerine olan etkilerini araştırmıştır. Bu çalışmalar sonucunda, viral etmenlerin konsantrasyonlarının azaltması açısından en etkili yöntemlerin HCL (%51), sıcak su (%42) ve ozon (%32) uygulamaları olduğu görülmüştür. HCL ve ozon uygulamalarınınn tohumların çimlenme değerleri üzerinde olumsuz etkileri olmazken, sıcak su uygulamaları çimlenme değerlerini önemli derecede olumsuz etkilemiş ve tohumların çimlenme güçlerini ortalama olarak %94‟ten %31‟e düşürdüğü tespit edilmiştir.
Topkaya ve Ertunç (2012) tarafından Ankara ve Antalya kabakgil üretim alanlarında gerçekleştirilen survey çalışmalarında; Ankara‟dan toplanan 118 bitki örneğinin ZYMV (%50,8), WMV-2 (%65,2), CMV (%21,1), PRSV-W (%20,3), SqMV (%2,5) ve CGMMV (%11,6); Antalya‟dan toplanan 79 balkabağı örneklerinin ZYMV (%21,5) ve WMV-2 (%59,4) ile bulaşık olduğu yapılan DAS-ELISA testleri sonucu ortaya konmuştur.
2.3. Enfeksiyon Kaynakları ve Mücadele Yolları
Kabakgil virüslerinin başlıca enfeksiyon kaynakları tohum, enfekteli bitkiler ve böcek vektörlerdir. Kabakgil sebzelerinde virüslerin ilk enfeksiyonları tesadüfidir ve çoğunlukla tarlada enfeksiyon noktalarında lokalize olmaktadır. Mevsim sonuna doğru yaprak biti türlerinin kolonizasyonu ile bitkiden bitkiye sıralar boyunca yayılma olmaktadır. Kabakgil bitkileri sıra aralarında genişledikçe, virüs yayılımı daha karmaşık bir hal almaya başlamaktadır (Raccah, 1999).
CMV, birçok bitkide 60‟dan fazla yaprak biti türü ile non-persistent olarak taşınabilmektedir. Ayrıca, bu virüsün mekanik inokulasyonla da Chenopodium
amaranticolor‟da klorotik lokal lezyon, Cucumis sativus‟da sistemik mozayik, Lycopersicon esculentum‟da mozayik ve yaprak deformasyonları ve N. tabaccum‟da da
lokal lezyon oluşturduğu bildirilmektedir. CMV‟nün belirtileri türe, gelişim dönemine, sıcaklığa ve virüs ırkına göre büyük değişiklik göstermektedir. Bu belirtiler gelişen genç yapraklardaki hafif sararmalar (kloroz), büyüme noktalarının şiddetli biçimde yanması ve bitki ölümlerini içerir. Enfekteli bitkilerin genç yapraklarında çoğunlukla klorotik lekeler ve yapraklarda daralma, şiddetli kıvrılma ve şekil bozuklukları görülebilmektedir. Hastalığın ilerleyen döneminde bitkide çoğunlukla bodurluk gözlenmekte, taç yapraklar tamamen yanabilmekte ve büyüme noktası ölebilmektedir (Francki, 1980; Kaper ve Waterworth, 1981; Yang ve ark., 1993).
Sharma ve ark. (1984) tarafından yapılan çalışmalarda CMV‟nün kavun ırkının %10-28 oranında kavun tohumlarıyla taşınabildiğini belirlemişlerdir.
Gera (1999) tarafından yapılan bir çalışma sonucunda CGMMV‟nün hıyar tohumlarıyla %8 gibi bir oranla taşınabildiği belirlenmiştir.
Powell ve Schlege (1970) SqMV ile bulaşık kavun bitkilerinden elde ettikleri kavun tohumlarının %12 sinin embriyosunda ve bu tohumlardan elde ettikleri fidelerin de % 22‟ sinde SqMV‟nü saptamışlardır. Tohumlar çimlendikten sonra fidelerde görülebilir bir virüs artışı olmasına rağmen 30 günlük bir gözlem sonucunda hastalıklı tohumların çimlendirilmesi ile oluşan infekteli fakat simptomsuz bitkilerden alınan tohumlarda %13 oranında virüs saptanmıştır. SqMV infeksiyonu ile kavun meyve ağırlığı, büyüklüğü, tohum sayısı, tohum ağırlığı ve tohumların çimlenme yüzdesinde bir azalma ortaya çıkmıştır. İki yıl boyunca depolanan tohumlarda infeksiyon oranında % 23 ten, % 5‟ e doğru bir azalma saptanmıştır. Provvidenti ve Robinson (1974)
