Total nükleik asit (TNA) ekstraksiyonu

Arazi çalışmaları sırasında, kabakgil bitkileri üzerinde görülüp toplanan yaprak bitleri örnekleri ile yapılan DAS-ELISA testleri sonucunda virüs(ler) ile bulaşık olduğu saptanan kabakgil bitki örnekleri, yabancı ot örnekleri ve kabakgil bitkisi tohum örneklerinde bulunan virüs bulaşıklığını belirlemek için gerçekleştirilen RT-PCR çalışmalarında materyal olarak kullanılmak üzere TNA ekstraksiyonları gerçekleştirilmiştir. Kabakgil bitki örneği sayısının çok fazla olması sebebiyle RT-PCR çalışmalarında, ELISA testlerinde yüksek absorbans değeri veren örnekler seçilerek moleküler çalışmalarda kullanılmıştır. Tohum örnekleri, yine ekstraksiyondan önce steril koşullarda çimlendirilmiştir. Bitki ve tohum örneklerinden gerçekleştirilen TNA ekstraksiyonlarında iki farklı yöntem kullanılmıştır.

Birinci yöntem Astruc ve ark. (1996)‟ndan alınmış ve aşağıdaki gibi gerçekleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan tampon çözeltiler Ek-2‟de verilmiştir.

1. Bitki örnekleri ekstraksiyon tamponu (100mM Tris-HCI pH.8,0, 50mM EDTA b-pH. 7,0, 500 mM NaCI, 10mM 2.mercapto-ethanol (1/1000)) içerisinde 1:2 (w/v) oranında sulandırılarak ekstrakte edilmiş ve bitki özsuyu steril tülbentten süzülmüştür.

2. Bitki özsuyundan 1ml alınarak eppendorf tüpleri içerisine yerleştirilmiş ve örnekler 3 dk 4.000 rpm‟de santrifüj edilmiştir.

3. Pelet üzerine % 20‟lik sodium dodecyl sulfat (SDS)‟den 50 μl ilave edilerek vortekste karıştırılmış ve sonra tüpler 65 ºC‟de 30 dk kuru blok ısıtıcıda inkübe edilmiştir.

4. Tüplere 250 μl potasyum asetat (5M) ilave edilerek 20 dakika buz içerisinde bekletilmiş ve daha sonra 15 dk 13.000 rpm‟de santrifüj yapılmıştır.

5. Elde edilen süpernatant iki kısma ayrılmıştır ve 500 μl‟si yeni hazırlanmış eppendorf tüplerine konularak -70 °C‟de saklanmıştır. Geriye kalan 500 μl süpernatant ise yeni hazırlanan eppendorf tüplerine konulup, üzerine % 100‟lük ethanolden 500 μl ilave edilerek 1ml‟ye tamamlanmış ve vortekste karıştırılmıştır.

6. Daha sonra tüplere 50 μl sodyum asetat (3 M) ilave edilip, örnekler tekrar karıştırılarak -70 ºC‟de bir gece bekletilmiştir.

7. Ertesi gün, örnekler 15 dk 14.000 rpm‟de santrifüj edilerek süpernatant kısmı ortamdan uzaklaştırılmıştır.

8. Eppendorf tüpleri filtre kağıdı üzerinde ters çevrilerek 5 dk kurutulmuş ve pellet üzerine % 70‟ lik ethanolden 1ml ilave edilmiştir.

9. Örnekler RNA‟leri çöktürmek amacıyla 5 dk 13.000 rpm‟de santrifüj edilmiş ve tüp içerisindeki ethanol atılarak eppendorf tüpleri kurutma kağıtları ile dikkatlice kurutulmuştur.

10. Elde edilen total RNA‟lar 50 μl RNAse free saf su ile sulandırılarak, -70 ºC‟de muhafaza edilmiştir.

Total nükleik asit izolasyonunda kullanılan diğer bir yöntem ise Foissac ve ark. (2000)‟ndan alınmış ve aşağıdaki gibi gerçekleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan tampon çözeltiler Ek-3‟de verilmiştir.

Daha önceden hazırlanan örnek tamponu (grinding buffer) içerisine virüslerin okside olmasının engellenmesi amacıyla 1/1000 oranında 2-mercaptoethanol ilave edilmiştir. Bitki ve tohum örneklerinden 100‟er mg tartılarak, steril havanda 1ml örnek tamponu varlığında ezilmiştir. Elde edilen her bir örnek ekstraktından 500‟er µl alınıp tüplere konulmuş ve her bir tüpe, karıştırıcı (vorteks)‟da iyice karıştırılan %10‟luk sarkosyl (sodium lauroyl sarcosinate)‟den, 100‟er µl konulmuştur. Tüpler karıştırıldıktan sonra, 70 °C‟de çalışan blok ısıtıcıda, 10 dakika inkübe edilmiş ve ardından 5 dakika buzda tutulmuştur. İnkübasyonun ardından tüplere, 14000 devirde 10 dakika santrifüj uygulanmıştır. Bu arada, çalışılan örnek sayısı kadar yeni tüp hazırlanıp, numaralandırılmıştır. Yeni tüplerin içine eski tüplerden 300µl örnek, 50µl silica, 300 µl 6M NaI ve 150 µl etanol (%99) konulup tüpler karıştırıcı (vorteks)‟da karıştırılmıştır. Daha sonra tüpler çalkalayıcıya alınmış ve oda sıcaklığında 10 dakika tutulmuştur. Çalkalayıcıdan alınan tüplere 6000 devirde 1 dakika santrifüj uygulanmıştır. Santrifüjün ardından tüplerin üstünde kalan sıvı kısımlar dökülmüş ve tüplerde sadece silicalı kısım bırakılmıştır. Ardından, her tüpün içine 500µl yıkama tamponu konulup, katı kısım tamamen çözülene kadar karıştırıcıda karıştırılmış ve tüpler yıkama tamponları ile doluyken 6000 devirde 1 dakika santrifüj yapılmıştır. Aynı şekilde sıvı kısım boşaltılıp tekrar yıkama tamponu konulmuş ve aynı işlem bir daha yapılmıştır. Tüpleri santrifüjden çıkardıktan sonra sıvı kısım atılmış ve kurutma kâğıdına ters şekilde konularak birkaç dakika kurumaya bırakılmıştır. Daha sonra, 150‟şer µl RNAse-free su eklenmiş ve karıştırıcıda karıştırılarak silicanın çözünmesi sağlanmıştır. Ardından örnekler, blok ısıtıcıda 4 dakika boyunca 70°C‟de inkube

edilmiş ve inkübasyonu takiben tüpler santrifüje alınarak, 14000 devirde 3 dakika santrifüj uygulanmıştır. Bu arada, çalışılan örnek sayısı kadar yeni tüpler hazırlanmış ve numaralandırılmıştır. Santrifüj işleminin ardından, tüplerdeki sıvı kısımlardan 145‟er µl yeni hazırlanan tüplere aktarılmıştır. 145 µl hacmindeki total nükleik asit (TNA)‟ler, RT-PCR çalışmaları yapılıncaya kadar, hızlı bir şekilde -20°C‟de çalışan derin dondurucuya kaldırılmıştır.

Ayrıca örnekleme çalışmaları esnasında viral hastalık belirtisi gösteren bitkilerden toplanan afidlerden de TNA izolasyonu yapılmıştır. Bu amaçla Singh ve ark. (1995)‟nın belirtmiş olduğu protokol modifiye edilerek kullanılmıştır. Öncelikle içerisinde 10‟ar adet afid bulunan mikrosantrifüj tüpleri içerisindeki etil alkol uzaklaştırılmış ve sıvı azot bulunan kaplara daldırılarak plastik çubuk yardımıyla afitler toz haline gelinceye kadar ezilmiştir. Tüp içerisine 200 µl RNA izolasyon tamponu (200 mM Tris-HCL, pH:8,5, %1,5 lithium dodecyl sulfat, 300 mM lithium chloride, 10 mM EDTA, %1 sodium deoxycholate, %1 NP-40, %1 2-mercaptoethanol) eklenmiş ve daha sonra karıştırılmıştır. Karışıma 1,6 hacim (320 µl) 5 M potassium acetate (pH:6,5) eklendikten sonra, vorteks ile iyice karışması sağlanmıştır. Ardından tüpler 11.000 rpm hızda 45 dk santrifüj edilerek, üstte kalan sıvı kısımdan 400 µl yeni tüplere aktarılmıştır. Bu tüplere aynı hacimde isopropanol konularak karıştırıldıktan sonra tüpler 11.000 rpm hızda 30 dk santirifüj edilerek RNA‟nın çökmesi sağlanmıştır. Çökelti, 0,5 ml soğuk %70‟lik etil alkol ile yıkanmış ve en son aşama olarak 50 µl steril RNase-free saf su ile sulandırılmıştır. Örnekler PCR reaksiyonlarında kullanılıncaya kadar -20 °C‟de saklanmıştır.

TNA ekstraksiyon çalışmaları sonucunda elde edilen ekstraktlardaki total RNA varlığı ve kalitesi agaroz jel elektroforez çalışmasıyla ve ayrıca nanodropta kontrol edilmiştir.

Total RNA miktarı ve kalitesi yüksek olan örnekler RT-PCR‟na tabi tutulmuştur. RT-PCR işlemi iki aşamada gerçekleştirilmiştir. Birinci aşamada Ters transkripsiyon ile RNA‟ler cDNA (komplementer DNA)‟e dönüştürülmüş ve ikinci aşamada ise virüse spesifik primerlerle çoğaltılmışlardır.