159 G‹R‹fi
Marmara Üniversitesi, T›p Fakültesi birinci, ikinci ve üçüncü s›n›f ö¤rencilerinin, hastane e¤itimine bafllamadan önce gerek bilgi ve becerilerini artt›rmak
gerekse davran›fl ve tutumlar› aç›s›ndan klini¤e ha-z›rlamak amac›yla yap›lan uygulamada, 4 veya 5 renciden oluflan küçük gruplar oluflturulmakta, ö¤-renci gruplar› haz›rlad›klar› projeyi, sorumlu e¤itme-nin gözetiminde yürütmektedirler. Bu çal›flma, ö¤-Türk Mikrobiyol Cem Derg (2005) 35:159-162
Laboratuvar Koflullar›nda Elde Edilen Sefoksitine Dirençli
Mutant Bacteroides fragilis Kökenlerinin Di¤er Antibiyotiklere
Çapraz Direnç Durumlar›n›n Araflt›r›lmas› (*)
Nurver ÜLGER (TOPRAK) (**), Tamer ÇOfiKUN (***), Raflit AKDEN‹Z (***), ‹brahim M. AYDIN (***), Ahmet BAN‹S‹ (***), Recep SADE (***), Güner SÖYLET‹R (**)
(*) Bu çal›flma, MaSCo- Marmara T›p Ö¤renci Kongresi'nde (17-18 May›s 2004) sunulmufltur (**) Marmara Üniversitesi T›p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, ‹stanbul
(***) Marmara Üniversitesi T›p Fakültesi, Ö¤rencileri, ‹stanbul
‹letiflim:Nurver Ülger (Toprak) e-posta:nulger@marmara.edu.tr ÖZET
Bu çal›flma 2003-2004 e¤itim-ö¤retim y›l›nda, “Klinik Uygulamaya Girifl Program›” çerçevesinde, Marmara Üniversitesi T›p Fakültesi ö¤rencileri ile yürütülmüfltür. Çal›flma, ö¤rencilerin antibiyotiklere direnç geliflimi konusunda bilgilerini artt›rmalar› ve antibiyotikleri daha ak›lc› kullanmalar› konusunda tutum gelifltirmeleri amaçlanarak planlanm›flt›r. Süpüratif anaerop infeksiyonlardan en s›k izole edilen ve normalde kolon floras›nda bulunan Bacteroides türleri, pek çok antibiyoti¤e direnç göstermektedir. Bu çal›flmada ikisi farkl› hastalar›n d›flk›s›ndan izole edilmifl, di¤eri ATCC standart kökeni olmak üzere toplam üç Bacteroides fragilis kökeni, subinhibitör konsantrasyonla (256μg/ml) bafllayarak ikifler misli artan oranda sefoksitin ile muamele edilmifl, dirençli mutantlar elde edilmifltir. D›flk› izolatlar›na ait sefoksitine dirençli mutantlar›n ayn› zamanda tetrasikline direnç (64μg/ml) ve piperasiline orta düzeyde direnç (64μg/ml) gelifltirdikleri, standart ATCC kökeninden elde edilen mutant›n ise klindamisine direnç (8μg/ml) gelifltirdi¤i, piperasilin M‹K de¤erinde dört misli, tetrasiklin M‹K de¤erinde ise sekiz misli art›fl gösterdi¤i saptanm›flt›r. Çal›flmam›zda ö¤renciler, antibiyotiklerin kullan›m›na ba¤l› dirençli mutant kökenlerin geliflebilece¤ini deneysel olarak görmüfller, direnç gelifliminin en az seviyede olmas› için antibiyotiklerin ak›lc› kullan›lmas› gerekti¤ini benimsemifllerdir.
Anahtar kelimeler:Bacteroides fragilis, sefoksitin, antibiyotik duyarl›l›k, çapraz direnç
SUMMARY
Investigation of Cross-Resistance to Other Antibiotics in Cefoxitin-Resistant Mutant Bacteroides fragilis Strains Obtained in Laboratory Condition
Students in this study were involved according to “Introduction to Clinical Practice Program” at Marmara University, School of Medicine, during 2003-2004 educational period. The aim of this study was to increase the students' knowledge and awareness about development of antimicrobial resistance in bacteria and acquire attitudes necessary for rational usage of antibiotics. Bacteroides species are the microorganisms most often isolated from patients with suppurative anaerobic infections and resistant to most of the antibiotics. In the present study, 3 cefoxitin -resistant Bacteroides fragilis mutants (two strains from stool specimens of different persons, one strain was ATCC Bacteroides fragilis) were obtained by selection with increasing concentrations of cefoxitin (ranging from subinhibitor concentration to 256μg/ml). The mutant strains showed decreased susceptibilities not only to cefoxitin but also to other antibiotics; two cefoxitin resistant mutants isolated from stool specimens showed resistance to tetracycline (64μg/ml) and intermediate resistance to piperacillin, ATCC strain showed resistance to clindamycin (8μg/ml) and 4-8 fold decreased susceptibilities to piperacillin and tetracyclin respectively. In conclusion, the students demonstrated that usega of antibiotics can encourage the selection of resistance and assumed that in order to minimize the potential development of resistance, rational use of antibiotic is critical.
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2005) 35:159-162
160
rencilere ileriki hekimlik hayatlar›nda do¤ru antibi-yotik kullanma bilincini kazand›rmak amac›yla plan-lanm›flt›r. Gereksiz veya uygun olmayan dozlarda kullan›lan antibiyotiklerin dirençli kökenler yaratabi-lece¤ini göstermek, antibiyotik kullan›m› s›ras›nda normal flora elemanlar›n›n da dirençli hale gelebile-ce¤ini vurgulamak, bu dirençli kökenlerin olufltura-ca¤› muhtemel f›rsatç› infeksiyonlar›n tedavisinde güçlükler yaflanabilece¤ine dikkat çekmek istenmifl-tir.
Bu çal›flmada, pek çok laboratuvarda rutinde kültürü yap›lmayan, varl›¤›ndan flüphe duyulan durumlarda ampirik tedavisi yap›lan, f›rsatç› patojenlerden, ko-lon floras› eleman› Bacteroides fragilis kökenleri se-çilmifltir (1). Anaerop infeksiyonlardan en s›k izole edilen bu türün, artan oranda antibiyotiklere direnç gelifltirdi¤i dünyan›n pek çok ülkesinden bildirilmifl-tir (2, 3).
Çal›flmam›zda çarp›c› bir sonuç elde etmek için, Bacteroides fragilis kökenleri, antianaerop etkiye sa-hip sefalosporinlerden sefoksitinin subinhibitör kon-santrasyonla bafllayarak kademeli olarak artan dozla-r› ile muamaele edilmifl, dirençli mutant kökenler el-de edilmifltir. Bu dirençli kökenlerin di¤er antibiyo-tiklere çapraz direnç oluflturup oluflturmad›klar› arafl-t›r›lm›flt›r.
GEREÇ ve YÖNTEM
Çal›flmam›zda, son bir ayda antibiyotik tedavisi al-mam›fl farkl› iki kiflinin d›flk›s›ndan izole edilen, se-foksitine duyarl› B. fragilis (n:2) ve ATCC 25285 B. fragilis kökenleri kullan›lm›flt›r.
Bakteri izolasyonu ve tan›mlanmas›. D›flk› örnek-leri “Bacteroides Bile Esculin Agar” besiyerine (BBE Agar) ekilmifl, anaerop ortamda, 37°C'de 2-4 gün inkübe edilmifltir. Oluflan koloniler morfolojileri ve aerotolerans özellikleri yönünden incelenmifltir. Sadece anaerob ortamda üreyen gram negatif çomak-lardan, klasik yöntemlerle tan›mlanan ve API 20A (Biomerioux, France) ile do¤rulanan B. fragilis kö-kenleri çal›flmaya al›nm›flt›r (4).
Antibiyotik duyarl›l›k testi. Bakterilerin duyarl›l›k-lar› NCCLS'nin önerdi¤i, agarda dilüsyon
yöntemiy-le çal›fl›lm›fl, ampisilin, sulbaktam/ ampisilin, sefok-sitin, piperasilin, klindamisin, tetrasiklin, metronida-zol ve kloramfenikol antibiyotikleri kullan›lm›flt›r (5). Gerek ana kökenlerin gerekse sefoksitine direnç-li mutantlar›n duyarl›l›k testleri ayn› koflullarda üç kez yap›lm›fl, M‹K (minimal inhibitör konsantrasyo-nu) de¤erlerinde iki ve daha fazla dilüsyonluk de¤i-fliklik direnç geliflimi aç›s›ndan dikkate al›nm›flt›r. Bakterilerde sefoksitine direnç oluflturma. Çal›fl-man›n bafllang›c›nda yap›lan duyarl›l›k testinde, se-foksitin M‹K de¤eri iki B. fragilis kökeninde 16μg/mL, ATCC B. fragilis standart suflunda ise 8μg/mL bulunmufltur. Bakteriler, subinhibitör kon-santrasyonda (d›flk›dan izole edilen kökenler 8μg/mL, standart sufl ise 4μg/mL) sefoksitin içeren, %5' koyun kan›, hemin ve K vitamini bulunduran Brucella agara ekilmifltir. Anaerop artamda 2-4 gün-lük inkübasyonun ard›ndan, az say›da ve küçük kolo-nilerden oluflan üreme tespit edilmifltir. Bu küçük ko-loniler, ayn› konsantrasyonda antibiyotik içeren besi-yerlerine pasajlanm›fl, ayn› koflullarda inkübe edil-mifltir. ‹fllemler iyi bir üreme elde edilinceye kadar sürdürülmüfl ve bu kolonilerden, iki misli sefoksitin içeren (16μg/mL ve 8μg/mL) besiyerlerine pasajlan-m›flt›r. Sefoksitin dozu kademeli olarak (16μg/mL, 32μg/mL, 64μg/mL…fleklinde) artt›r›lm›fl, her bir kademede ayn› ifllemler yap›lm›fl, ve >256μg/mL M‹K de¤erlerine sahip kökenler elde edilmifltir (6). BULGULAR
Ampisilin d›fl›ndaki di¤er antibiyotiklere duyarl› olan; ikisi d›flk›dan izole edilmifl, birisi ATCC stan-dart kökeni olmak üzere üç B. fragilis kökeni, subin-hibitör konsantrasyonla bafllayarak artan oranda se-foksitin ile muamele edilmifl, dirençli mutantlar elde edilmifltir. Bu sefoksitine direnç kazanan mutant kö-kenlerden d›flk›dan izole edilenlerin ayn› zamanda tetrasikline direnç (64μg/ml), piperasiline orta dü-zeyde direnç (64μg/ml) gelifltirdikleri, standart ATCC kökenin ise klindamisine direnç (8μg/ml) ge-lifltirdi¤i, piperasilin M‹K de¤erinde dört misli (iki dilüsyon), tetrasiklin M‹K de¤erinde ise sekiz misli bir art›fl (orta düzey direnç) gösterdi¤i saptanm›flt›r (Tablo1).
161 TARTIfiMA
Ülkemizde, kolay ulafl›labilen ve yayg›n flekilde kul-lan›lan ilaç gruplar›ndan birisini antibiyotikler olufl-turmaktad›r. Kullan›lma oranlar›yla do¤ru iliflkili olarak antibiyotiklere direnç geliflmektedir. Direnç geliflimini s›n›rlamak için önerilen yollardan birisi antibiyotiklerin do¤ru ve kontrollü kullan›lmas›d›r (2). Gelece¤in hekimlerinde, do¤ru antibiyotik kul-lanma bilincini gelifltirmek, gereksiz ve hatal› antibi-yotik kullan›m›n› önleyecek, dolay›s›yla direncin s›-n›rland›r›lmas›na önemli katk› sa¤layacakt›r. Anaerop bakterilerden etken olarak en çok izole edi-len, antibiyotiklere artan oranda direnç gösteren Bacteroides türlerinin halk sa¤l›¤›n› tehdit etti¤i vur-gulanmakta ve gelecekte ciddi problemler yarataca¤› düflünülmektedir (1). Bacteroides türlerinin, ana-eroplara etkili antibiyotiklerden sefoksitine önemli oranda direnç gelifltirdi¤i saptanm›flt›r (7). Direnç oran› ülkelere göre farkl›l›k göstermekle birlikte, yüksek oranlar Kanada (%26.6), ve ‹spanya'dan (%21.5) elde edilmifl, ülkemizde ise farkl› merkez-lerden %6.3 ile %89'e varan oranlarda sefoksitine di-renç bildirilmifltir (8-13). Çal›flmam›zda çarp›c› bir sonuç elde etmek için, normal barsak floras›nda bu-lunan ve cerrahi yara infeksiyonlar›nda en s›k izole edilen anaerop bakterilerden B. fragilis türleri seçil-mifl, bu türler bat›n ameliyatlar›nda proflaksi
ama-c›yla kullan›lan sefoksitin ile muamele edilerek di-rençli mutantlar oluflturulmufltur. Mutant kökenlerin, sefoksitinin yan› s›ra di¤er baz› antibiyotiklere di-renç gelifltirdikleri veya duyarl›l›klar›nda azalma gösterdikleri (M‹K de¤erlerinde art›fl) saptanm›flt›r. Çal›flmalar›ndan esinlendi¤imiz Fang ve ark. (6), sefoksitin ile muamele ederek dirençli iki mutant Bacteroides thetaiotaomicron kökeni gelifltirmifl, bu bakterilerin di¤er beta-laktam grubu antibiyotiklere direnç durumlar›n› araflt›rm›fllard›r. Mutant kökenle-rin piperasilin, sefoperazon, ampisiline de direnç ka-zand›klar›, imipenem ve amoksisilin/klavulanata hassas kalmakla beraber, M‹K de¤erlerinde dört mis-li bir art›fl gemis-lifltirdiklerini gözlemifllerdir. Araflt›rma-c›lar ayn› zamanda ilk bakteriler ile mutant bakteri-lerin ß- laktamaz üretimini, penisilin ba¤layan prote-in yap›lar›n› ve d›fl zar proteprote-inlerprote-ini prote-incelemifllerdir. ‹ki grup aras›nda, üretilen ß- laktamaz miktar› bak›-m›ndan bir farkl›l›k gözlememifl, ancak mutant kö-kenlerin penisilin ba¤layan proteinlerinde %50' den fazla azalma veya kay›p tespit etmifllerdir. Ayr›ca mutant kökenlerin d›fl zar›nda 37 kDa'l›k bir prote-inin bulunmad›¤›n› saptam›fl, bu protein kayb›n›n, geçirgenli¤in azalmas›na neden olabilece¤ini savun-mufllard›r. Bu bilgilerden yola ç›karak, çal›flmam›zda oluflturulan sefoksitine dirençli mutantlarda da ben-zer de¤iflikliklerin gerçekleflebilece¤i, ve benben-zer etki mekanizmas›na sahip ß- laktam grubu antibiyotikler-den piperasiline çapraz direnç geliflmifl olabilece¤i varsay›labilir.
Elde etti¤imiz mutant kökenlerin farkl› etki mekaniz-malar›na sahip; bakteri protein sentezini inhibe ede-rek etki gösteren klindamisine ve tetrasikline de di-renç gelifltirdikleri gözlenmifltir. Fang ve ark.’n›n (6) oluflturdu¤u mutant B. thetaiotaomicron kökenleri-nin de ayn› zamanda klindamisine direnç gelifltirdik-leri, metronidazole ise düflük duyarl›l›k (M‹K: 8μg/ml) gösterdikleri saptanm›flt›r. Literatürde Bac-teroides türlerinden sefoksitine dirençli kökenlerin, klindamisine fenotipik olarak yüksek oranda direnç gösterdi¤ini bildiren çal›flmalar bulunmakla beraber, bu iki grup antibiyoti¤e çapraz direnç oluflumunu aç›klayacak bir mekanizma veya genetik bir ba¤lan-t› henüz belirlenememifltir (14, 15). Kuflkusuz, çok
Antibiyotikler* Sefoksitin Piperasilin Ampisilin Sulbaktam/Ampisilin Tetrasiklin Klindamisin Kloramfenikol Metronidazol Ana köken 16 16 32 2 4 2 8 2 Ana köken 16 16 32 4 4 8 8 4 Ana köken 8 8 32 4 1 2 8 2 Dirençli Mutant >256 64 32 4 64 2 8 4 Dirençli Mutant >256 64 64 4 64 8 16 4 Dirençli Mutant >256 32 64 4 8 8 16 4 Kökenler
B. fragilis 1 B. fragilis 2 ATCC B.fragilis Tablo 1: Antibiyotiklerin, kökenler üzerindeki M‹K de¤erleri (μg/mL)
*NCCLS'e göre antibiyotiklerin duyarl›l›k M‹K de¤erleri: Sefoksitin: ≤ d16μg/mL, piperasilin: ≤ d32μg/mL, ampisilin: ≤ d0,5μg/mL, sulbaktam/ampisilin: ≤ d4/2μg/mL, tetrasiklin: ≤ d4μg/mL, klindamisin: ≤ d2μg/mL,
kloramfenikol: ≤ d8 μg/mL, metronidazol: ≤ d8μg/mL.
N. Ülger (Toprak) ve ark., Laboratuvar Koflullar›nda Elde Edilen Sefoksitine Dirençli Mutant Bacteroides fragilis Kökenlerinin Di¤er Antibiyotiklere Çapraz Direnç Durumlar›n›n Araflt›r›lmas›
Türk Mikrobiyol Cem Derg (2005) 35: 159-162
162
say› ve çeflitte direnç geni tafl›yan ve pek çok antibi-yoti¤e direnç gelifltiren Bacteroides türlerinde, çap-raz direnç oluflumunda farkl› mekanizmalar›n yer alabilece¤i tart›flma götürmez. Ancak, anaerop bak-terilerde, genetik ve moleküler antibiyotik direncine ait elde bulunan veriler birkaç cins veya tür ve az sa-y›da antibiyotikle s›n›rl› olup tüm direnç mekaniz-malar›n› kapsamamaktad›r (16, 17).
Sonuç olarak çal›flmam›zda, bakterilerin kullan›lan antibiyotiklere zaman içinde direnç gelifltirebilecek-leri, bu direncin sadece kullan›lan antibiyotikle s›n›r-l› kalmay›p ayn› zamanda di¤er antibiyotiklere karfl› da gerçekleflebilece¤i deneysel yöntemle gözler önü-ne serilmifltir. Antibiyotiklerin gelifligüzel kullan›m›-n›n önüne geçmek, dolay›s›yla direncin geliflimini s›-n›rlamak için uygun antibiyotik kullan›m› konusun-da, gelece¤in hekim adaylar›n› duyarl› k›lmak ama-c›yla yap›lan bu çal›flman›n yararl› olaca¤›n› umuyo-ruz.
KAYNAKLAR
1. Finegold SM:Anaerobic bacteria: General concepts. “Mandel GL, Bennet JE, Dolin R. (eds): Principles and Practice of Infectious Diseases, 5th ed:”, p2519, Churchill Livingstone, Pennsylvania (2000).
2. Garcia-Rodriguez JA, Garcia-Sanchez JE, Munoz- Bellido JL:Antimicrobial resistance in anaerobic bacteria: Current situation. Anaerobe 1:69 (1995).
3. Ramussen BA, Bush K, Tally FP:Antimicrobial resis-tance in anaerobes. Clin Infect Dis 24 (Suppl 1 ): 110 (1997).
4. Koneman EW, Allen SP, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn W:The Anaerobic Bacteria. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology 5th Ed,p709, J B Lippincott, Philadelphia(1997).
5. National Committee for Clinical Laboratory Standarts: Methods for antimicrobial Susceptibility Testing of Ana-erobic Bacteria, 4th ED, Approved Standart M11-A3, Vol 13, No .26, Villanova (1997).
6. Fang H, Edlund C, Nord CE, Hedberg M:Selection of cefoxitin-resistant Bacteroides thetaiotaomicron mu-tants and mechanisms involved in ß-lactam resistance. Clin Infect Dis 35 (Suppl 1):47 (2002).
7. Nord CE, Hedberg M: Resistance to ß-Lactam antibi-otics in anaerobic bacteria. Rev ‹nfect Dis 12 ( Suppl 2): 231 (1990).
8. Labbe AC, Bourgault AM, Vincelette J, Turgeon PL, Lamothe F:Trends in antimicrobial resistance among cli-nical isolates of the Bacteroides fragilis group from 1992 to 1997 in Montreal, Canada. Antimicrob Agent Chemot-her 43: 2517 (1999).
9. Baquero F, Reig M:Resistance of anaerobic bacteria to antimicrobial agents in Spain. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 11: 1016 (1992).
10. Zandi H, Gürler N: Muayene maddelerinden izole edilen anaerop Gram Negatif çomaklar›n identifikasyonu ve antibiyotiklere duyarl›l›klar›. Türk Mikrobiyol Cem Derg 32:58 (2002).
11. Torun M, Bahar H, Yüksel P: Çeflitli klinik örnekler-den izole edilen Bacteroides fragilis grubu bakterilerin an-timikrobiklere direnç durumlar› ve ß-Laktamaz ak-tiviteleri. ANKEM Derg 14: 104 (2000).
12. Mutlu E, Yücesoy M:Klinik örneklerden soyutlanan anaerop bakterilerde ß-Laktamaz aktivitesi ve antibiyotik direncinin belirlenmesi, XXX.Türk Mikrobiyoloji Kong-resi Kitab›, s300 (2002).
13. Ülger (Toprak) N, Çelik C, Çak›c› O, Söyletir G: Antimicrobial susceptibilities of Bacteroides fragilis and Bacteriodes thetaiotaomicron strains isolated from clinical specimens and human intestinal microbiota. Anaerobe 10: 255 (2004).
14. Aldridge KE: Cross-resistance to ß-lactam-ß-lactamase inhibitor combinations and clindamycin among cefoxitin-resistant and cefoxitin-susceptible strains of the Bacteroides fragilis group. Diagn Microbiol Infect Dis 17:251 (1993).
15. Ülger (Toprak) N, Çak›c› O, Çelik C, Söyletir G: Klindamisine in vitro dirençli Bacteroides fragilis ve Bac-teroides thetaiotomicron kökenlerinin di¤er antibiyotiklere direnç durumu, 6.Antimikrobik Kemoterapi Günleri, P34 (2004).
16. Tally FP, Cuchural GJ, Malamy MH:Mechanisms of resistance and resistance transfer in anaerobic bacteria: Factors influencing antimicrobial therapy. Rev Infect Dis 6 (Suppl 1): 260 (1984).
17. Salyers AA, Shoemaker NB:Resistance gene transfer in anaerobes: New insights, new problems. Clin Infect Dis 23 (Suppl1): 36 (1996).
