Yapılan iyileştirmeler

A vacuolina é uma droga lisossomotrópica que causa aumento no tamanho dos lisossomos por um mecanismo desconhecido (Huynh & Andrews 2005). Porém, apesar de induzir a vacuolização das células, esta droga não alterou o padrão de infectividade dos parasitas (fig. 16). Como a intensa vacuolização promovida pela vacuolina dificulta a contagem dos parasitas pelo método de fixação com Bouin e coloração com Giemsa (fig. 16, 2 horas), após o tratamento com a droga, os parasitas ficaram em contato com as células por 2h. Depois deste período as lamínulas foram lavadas para remoção dos parasitas do sobrenadante e o meio de cultura foi restabelecido. As lamínulas só foram fixadas 24 (fig. 16, 24 horas) e 48h depois para a determinação do número de parasitas por 100 células.

Figura 16. O tratamento com diferentes concentrações de vacuolina não altera a invasão dos amastigotas extracelulares de T. cruzi em células HeLa. As células foram tratadas por 1h com vacuolina, foram lavadas e os parasitas foram adicionados, permanecendo 2h em contato com as células. Depois deste período as lamínulas foram novamente lavadas o meio de cultura foi restabelecido e estas foram fixadas com Bouin e coradas com Giemsa 24 e 48h depois.

5. Discussão

5.1. A invasão, mas não a multiplicação intracelular dos amastigotas de

Trypanosoma cruzi, é modulada diferencialmente em células nocaute para

LAMP.

Tanto macromoléculas, quanto microorganismos podem ser internalizados ou invadir células de mamíferos em vesículas delimitadas por membranas por um processo genericamente denominado endocitose. A endocitose ocorre por múltiplos mecanismos, que podem, didaticamente, serem divididos em fagocitose e pinocitose, sendo que a pinocitose pode ocorrer por pelo menos quatro mecanismos básicos: macropinocitose, endocitose mediada por clatrina, endocitose mediada por cavéola e endocitose independente de cavéola ou de clatrina (Conner et al., 2003). Adicionalmente, no início da década de 1990, um mecanismo de invasão de células foi descrito para TCT de Trypanosoma cruzi. Este parasita desenvolveu uma estratégia única de invasão celular, valendo-se da exocitose de lisossomos para o sítio de internalização dos parasitas (Tardieux et al., 1992). Quando este mecanismo de invasão celular foi descrito, acreditava-se que era o único responsável pela internalização de TCT de T. cruzi. Entretanto, mais recentemente observou-se que, de fato, apenas cerca de 20% dos parasitas valem-se da exocitose de lisossomos para invadir as células (Woolsey et al., 2003).

No estabelecimento da infecção por T. cruzi as principais formas infectivas são os tripomastigotas, tanto os metacíclicos, no início da infecção, quanto os sanguíneos, para a manutenção da mesma. Entretanto, amastigotas podem circular livremente no sangue de animais infectados (Andrews et al., 1987). Sabe-se que os amastigotas, tanto os intracelulares, quanto os extracelulares, são capazes tanto de invadir culturas celulares in vitro, quanto de promover infecção em camundongos (De Carvalho et al., 1986; Hudson et al., 1984; Andrews et al., 1987; Mortara, 1991; Ley et al., 1988). Assim como os TCT, após invadir as células, os amastigotas escapam do vacúolo parasitóforo, se dividem e se transformam novamente em tripomastigotas, dando continuidade ao ciclo (Ley et al., 1988). Estas características levaram Scharfstein & Morrot (1999) a propor um papel para os AE na

imunopatologia da doença de Chagas. No presente trabalho, estas formas são o alvo de estudo.

Considerando-se que, ao menos formas TCT de T. cruzi, recrutam lisossomos para o sítio de invasão celular, e que LAMP-1 e LAMP-2 são proteínas majoritárias de lisossomos, neste trabalho o possível envolvimento destas proteínas no processo de internalização de AE de T cruzi foi avaliado.

Com este propósito foram utilizadas células nocaute para uma ou ambas as proteínas. Três diferentes pares de linhagens de MEF duplo nocaute e selvagem foram utilizadas, além de uma linhagem de nocaute para LAMP-1 e outra para LAMP-2. Diferentes linhagens de células foram utilizadas, pois, sabe-se que cada par de célula-parasita costuma comportar-se de forma distinta (Mortara et al., 2005; Procópio et al., 1998). Além do mais, o uso de diferentes linhagens celulares é interessante para evitar que eventuais diferenças fenotípicas das células, que possam ocasionar padrões de infectividade distintos, mas que nada tem a ver com a ausência das referidas proteínas, sejam levadas em consideração nos resultados.

O primeiro par de MEF WT/dKO se tratava de um subclone destas células. Neste primeiro par, os testes foram realizados com AE das cepas G e CL. No que diz respeito a este primeiro par de MEF WT/dKO, a taxa de invasão estava aumentada tanto nas células L2 -/-, quanto nas células L1/L2 -/- em relação às células WT. Estes resultados preliminares indicaram que a ausência de LAMP-2 poderia facilitar a invasão celular por amastigotas (fig. 1A e 1B). Outros dois pares de células WT/dKO, o primeiro imortalizado por símiam vírus e o segundo imortalizado espontaneamente, foram testados e usados em todos os testes posteriores envolvendo MEF, com amastigotas da cepa G. Surpreendentemente, os resultados foram conflitantes. Enquanto que para o primeiro par de células [PS1 (WT) e #48 (L1/L2 -/-)] não houve diferença significativa na taxa de invasão (fig. 3A), no segundo par testado [#5 (WT) e #79 (L1/L2 -/-)] os parasitas invadiram as células L1/L2 -/- com maior eficiência em relação à célula selvagem correspondente (fig. 3B). A taxa de invasão nas células L2 -/- foi significativamente maior em relação a ambas WT analisadas (fig. 3A e B).

Durante o processo de internalização do parasita, ocorre a formação de um vacúolo parasitóforo (VP), cuja composição característica da membrana está relacionada ao processo de invasão. O parasita deve escapar deste VP, passando a

residir no citosol da célula, para que haja a multiplicação (Burleigh et al., 1995). O escape do VP é dependente de dois fatores produzidos pelo parasita, a transialidase (Rubin-de-Celis et al., 2006) e a proteína formadora de poro TcTox (Andrews et al., 1990). A transialidase transfere ácido siálico de glicoproteínas celulares para aceptores do parasita, facilitando a ação da TcTox (Hall et al., 1992). Sabe-se que as proteínas LAMP-1 e LAMP-2 são altamente glicosiladas e ricas em ácido siálico (Eskelinen et al., 2003). Levando-se em consideração estas informações, foi verificado se a ausência de LAMP poderia interferir no crescimento intracelular dos parasitas por facilitar o escape do VP. Em nenhuma das células analisadas a ausência das proteínas LAMP-1 e/ou LAMP-2 interferiu na multiplicação dos parasitas (fig. 2A, 2B, 4A e 4B).

Na tentativa de corroborar um suposto papel de LAMP-2 na invasão celular, foram realizados experimentos com siRNA contra LAMP-1 e/ou LAMP-2. Estes testes foram feitos tanto em células HeLa (fig. 5), quanto nas MEF WT (PS1 e #5) (fig. 6). Pelo immnobloting foi possível constatar que o tratamento com os siRNA foi efetivo (fig. 5A e B e fig. 6A e B), entretanto o tratamento com siRNA não promoveu nenhuma alteração na taxa de invasão em relação aos siRNA controle ou às células não transfectadas (fig 5C e 6C e D). Este resultado, somado ao fato de que, apesar da diferença na invasão ter sido observada em dois pares de células [WT/dKO e #5(WT)/#79(L1/L2 -/-)], mas não em um outro par [PS1 (WT)/#48(L1/L2 -/-)] sugerem que o aumento de infectividade observado nas células L2-/-, KO e #79(L1/L2 -/-) ocorre por algum motivo que não a ausência de LAMP-2. Estes resultados fizeram levaram ao seguinte questionamento: se a ausência de LAMP não explica as diferenças nas taxas de invasão observadas em algumas células, o que poderia explicar estas diferenças? A partir desta pergunta os testes subseqüentes foram realizados.

5.2. A maior taxa de infectividade esteve relacionada à maior exocitose de lisossomos em MEF.

Na tentativa de explicar o motivo pelo qual os AE invadiam com maior eficácia algumas linhagens celulares em relação a outras, a exocitose de lisossomos foi avaliada em dois pares de células [PS1 (WT) e #48 (L1/L2 -/-)] e [#5 (WT) e #79

(L1/L2 -/-)], bem como nas células nocaute para apenas uma das proteínas (L1-/- e L2-/-).

A relação entre a exocitose de lisossomos e a invasão de TCT de T. cruzi já foi extensivamente demonstrada (Rodríguez et al., 1996; Tardieux et al., 1992). Ademais, sabe-se que a exocitose de lisossomos (Rodriguez et al., 1997), bem como a invasão celular por TCT T. cruzi são processos dependentes da liberação transiente de cálcio no citoplasma da célula hospedeira (Rodriguez et al., 1999; Rodríguez et al., 1995). Além disso, extratos de AE tanto da cepa G quanto da cepa CL, são capazes de gerar transientes de cálcio no citoplasma de células HeLa (Fernandes et al., 2006).

A exocitose de lisossomos em células não secretórias tem sido associada ao reparo da membrana plasmática (Chakrabarti et al., 2003; Gerasimenko et al., 2001; Reddy et al., 2001). Neste contexto, Andrews (2002) postulou que o parasita talvez subverta este processo constitutivo de reparo da membrana plasmática em seu próprio benefício. De acordo com esta teoria o contato de TCT de T. cruzi com a membrana plasmática da célula promove o influxo de cálcio para o citoplasma da célula, desencadeando uma resposta semelhante ao reparo da membrana plasmática, promovendo a internalização do parasita em vacúolos com características lisossomais.

No presente trabalho, a exocitose de lisossomos foi avaliada inicialmente pela mensuração da atividade de -hexosaminidase no sobrenadante celular após o tratamento com ionomicina. Esta droga, por ser um ionóforo de cálcio, promove um influxo citoplasmático deste íon (Liu et al., 1978), que culmina com a exocitose de lisossomos (Rodriguez et al., 1997). Para avaliar este fenômeno, a atividade da enzima lisossomal -hexosaminidase foi avaliada no sobrenadante e demonstrada em relação à atividade total da enzima no sobrenadante e no extrato celular.

Os resultados da exocitose corroboraram os da invasão, ou seja, nas mesmas células em que a invasão foi significativamente maior em relação aos controles, a liberação de -hexosaminidase para o sobrenadante também foi significativamente maior (fig. 7A e 7B).

Conjuntamente, estes resultados indicam fortemente uma correlação entre a exocitose de lisossomos e a invasão dos amastigotas nestas linhagens celulares.

Estes achados contradizem o paradigma estabelecido previamente de que a exocitose de lisossomos seria importante apenas para a invasão celular por TCT, não sendo um processo crítico para a invasão celular dos AE (Andrade et al., 2005).

Ademais, a exocitose de lisossomos, ou de qualquer outra vesícula citoplasmática, acaba por aumentar a área de superfície da membrana plasmática e diminuir a tensão superficial da mesma, o que deve ser compensado de alguma forma (Morris et al., 2001). Para esta compensação, a reciclagem de membrana plasmática após o processo de exocitose pode ocorrer por endocitose ou por

shedding de pequenas vesículas para o meio extracelular (Chieregatti et al., 2005;

Cocucci et al., 2007). Desta forma, é possível postular que nas MEF nas quais a exocitose de lisossomos é maior, todo o tráfego de membranas da célula está aumentado e conseqüentemente a endocitose também é maior, já que o equilíbrio entre exocitose/endocitose deve ser alcançado (Chieregatti et al., 2005). Esta alta atividade endocítica nestas células poderia então favorecer ainda mais a permissividade das mesmas à invasão pelos AE de T. cruzi.

Para confirmar que, de fato, o tratamento com ionomicina estava promovendo a exocitose de lisossomos, após o tratamento com a droga as células foram fixadas com formaldeído e marcadas com o marcador lisossomal CD63/LIMP-1. Esta proteína foi escolhida como marcador lisossomal, uma vez que, nas células duplo nocaute o uso de LAMP não seria possível. Em situações normais, em células permeabilizadas, o anticorpo anti-CD63/LIMP-1 marca apenas os lisossomos, o que ser traduz como uma marcação vesicular, majoritariamente na região perinuclear, conforme foi observado (fig. 8, controle). Se o tratamento com a droga de fato induz a exocitose de lisossomos, o esperado é, após o tratamento, observar marcação na membrana plasmática das células, já que durante o processo de exocitose os lisossomos migram em direção a membrana plasmática e se fundem a esta. Neste primeiro experimento, com as células permeabilizadas, após o tratamento com ionomicina, é possível notar um padrão de marcação compatível com marcação de membrana na célula #79 (L1/L2 -/-) (fig. 8 seta larga).

As células foram ainda marcadas com o mesmo anticorpo (CD63/LIMP-1) sem serem permeabilizadas. Esta técnica evita que o anticorpo entre na célula, marcando estruturas intracelulares. Esta marcação permitiu identificar uma marcação compatível com marcação de membrana (fig. 9 – seta larga) após o

tratamento com ionomicina, em todas as células avaliadas, embora aqui estejam representadas apenas as células #5 (WT) e #79 (L1/L2 -/-).

A atividade de -hexosaminidase também foi mensurada em células HeLa após tratamento com siRNA. Assim como ocorreu no caso da invasão celular, não foi possível observar alteração na atividade enzimática nas células tratadas com o siRNA em relação aos controles (fig. 10C), indicando que possivelmente a ausência de LAMP não interfere no processo.

Para descartar a hipótese de que a atividade de -hexosaminidase observada no sobrenadante das células estivesse ocorrendo devido à morte celular, e não a exocitose de lisossomos, foi realizado um teste de viabilidade celular, pela mensuração da atividade de LDH no sobrenadante das células. A LDH é uma enzima citoplasmática presente em todas as células e é rapidamente liberada para o sobrenadante quando a membrana plasmática é danificada (Korzeniewski et al., 1983).

As atividades de LDH e de -hexosaminidase foram mensuradas no sobrenadante das células #5 (WT) e #79 (L1/L2 -/-) após o tratamento com ionomicina, tanto na presença quanto na ausência de cálcio (fig. 11A e B), já que a exocitose de lisossomos é dependente deste íon. De fato, o tratamento com ionomicina provocou a liberação de LDH para o sobrenadante celular, indicando que houve toxicidade, porém, a atividade de LDH no sobrenadante das células tratadas com ionomicina não sofreu variação quando o cálcio foi adicionado ao PBS (fig. 11A). Já a atividade de -hexosaminidase no sobrenadante celular, mostrou ser dependente da adição de cálcio no PBS (fig 11B). Este resultado confirma que a atividade de -hexosaminidase observada no sobrenadante ocorre realmente devido à exocitose de lisossomos e não devido apenas à citotoxicidade da ionomicina.

Adicionalmente, uma cinética de aquisição do marcador lisossomal CD63/LIMP-1 foi realizada com o intuito de seguir o tráfego intracelular dos AE recém-internalizados. Na figura 12A estão representadas as células #5 (WT) e #79 (L1/L2-/-) fixadas no tempo 0. Na célula #5 (WT) é possível notar um parasita internalizado e não marcado (seta larga) e um parasita aderido (cabeça de seta). Na célula #79 (L1/L2-/-) há um parasita internalizado e marcado com CD63/LIMP-1 (seta estreita), o que significa que este parasita encontra-se dentro de um vacúolo

com características lisossomais. É importante salientar que esta marcação foi realizada no tempo 0 e que este parasita foi portanto recém-internalizado. Com este resultado é possível assumir que, durante o processo de internalização dos EA, os lisossomos podem migrar para a periferia da célula, no o sítio de internalização do parasita, envolvendo-o. Isso reforça a idéia de que os AE, assim como os TCT, também se valem da exocitose de lisossomos para invadir as células.

Na cinética, a porcentagem de parasitas marcados com CD63/LIMP-1 foi demonstrada em relação ao total de parasitas internalizados. Não houve diferença na aquisição do marcador lisossomal CD63/LIMP-1 pelos vacúolos dos parasitas internalizados pelo primeiro par de células [PS1 (WT) e #48 (L1/L2 -/-)] (fig 13A), no qual também não ocorre diferença no índice de infectividade (fig. 3A). Já no segundo par de células [#5 (WT) e #79 (L1/L2 -/-)], no qual uma diferença significativa na infectividade ocorre (fig. 3B), esta diferença pôde ser observada (fig. 13B). Enquanto que cerca de 50% dos parasitas internalizados pela célula #79 (L1/L2 -/-) já aparecem dentro de vacúolos lisossomais em momentos iniciais da invasão, menos de 5% dos parasitas que invadiram a célula #5 (WT) encontram-se nestes vacúolos no tempo 0. Uma porcentagem maior dos parasitas que invadiram as células L2 -/- encontram-se marcados (dentro de lisossomos) em comparação aos parasitas que invadiram a célula L1 -/- (fig 13A e B). Cerca de 3h após a invasão a porcentagem de parasitas internalizados que se encontram dentro de lisossomos é similar em todas as células. Este resultado reforça a idéia de que as diferenças observadas em relação à infectividade dos parasitas nas diferentes linhagens de MEF analisadas devem-se, de fato, a diferenças na taxa de exocitose de lisossomos.

A cloroquina é um agente anti-malária lisossomotrópico e acidotrópico que possui a capacidade de inibir a proteólise lisossomal, provavelmente porque aumenta o pH do lisossomo (Schneider et al., 1997). Esta droga ainda é um inibidor da endocitose (Sewell et al., 1983; Wileman et al., 1985; Glaumann et al., 1986) e altera a morfologia (Sewell et al., 1983), bem como a distribuição intracelular dos lisossomos (Fernandes et al., 2007b) e inibe a exocitose dos mesmos (Klempner et al., 1983). Neste trabalho, após o tratamento com cloroquina, foi possível notar uma redução na taxa de invasão pelos AE de T. cruzi em todas as MEF testadas (fig. 14). Esta diminuição nas taxas de invasão pode ser reflexo da redução na fusão entre os lisossomos e a membrana plasmática e da endocitose promovida pela droga e mais

uma vez corrobora os dados anteriores no que diz respeito à importância da exocitose de lisossomos para o processo de invasão pelos AE.

5.3. A exocitose de lisossomos também é importante para o processo de invasão por amastigotas de T. cruzi em outros tipos celulares

Com a finalidade de definir se a importância da exocitose de lisossomos para o processo de invasão por EA de T. cruzi era um fenômeno restrito as células MEF ou um processo mais generalizados, uma cinética de aquisição do marcador lisossomal LAMP-1 também foi realizada em momentos bem iniciais da invasão em células Vero e HeLa. Estas células foram escolhidas pois são modelos bem definidos de interação com o T. cruzi. Além disso, trabalhos anteriores já tinham demonstrado AE dentro de vacúolos lisossomais em tempos iniciais da invasão (Fernandes et al., 2007b; Procópio et al., 1998), porém nunca antes dos 20 minutos de invasão, o que deixava na dúvida se os parasitas estavam se valendo dos lisossomos para invadir as células ou se os VP estavam adquirindo o marcador lisossomal posteriormente.

Aqui, para minimizar as dúvidas em relação à importância da exocitose no momento exato da invasão, os amastigotas foram centrifugados sobre as células por apenas 10 min. e as lamínulas foram imediatamente fixadas (tempo 0) e também foram fixadas depois de 15, 30 e 60 minutos. Pelas imagens adquiridas no tempo 0, é possível postular, tanto para células Vero (fig. 15A, seta), quanto para células HeLa (fig. 15B, seta), que os lisossomos estejam migrando para o local de invasão dos parasitas, já que é possível notar parasitas marcados com LAMP-1 (dentro de lisossomos) em regiões distantes da região que concentra os lisossomos nas células (região perinuclear). A quantificação mostra que, de fato, mais de 20% dos parasitas recém internalizados pelas células Vero e aproximadamente 50% dos parasitas em células HeLa apresentam-se em vacúolos LAMP-1+ (fig. 15C) neste primeiro tempo. Este resultado indica que, assim como o que ocorre durante a invasão dos TCT (Rodriguez et al., 1996; Tardieux et al., 1992) a exocitose de lisossomos é provavelmente um fenômeno generalizado, embora não necessariamente majoritário, que colabora com o processo de invasão de EA de T. cruzi.

5.4. A modificação na morfologia dos lisossomos não altera o processo de invasão em células HeLa

A vacuolina é uma pequena molécula que afeta o tráfego de membranas em fibroblastos. Embora o alvo molecular desta droga seja ainda desconhecido, ela induz a formação de grandes vacúolos derivados de endossomos e lisossomos em diversos tipos celulares (Cerny et al., 2004). Como a intensa vacuolização promovida pela vacuolina dificulta a contagem dos parasitas pelo método de fixação com bouin e coloração com giemsa (fig. 16, 2 horas), após o tratamento com a droga, os parasitas ficaram em contato com as células por 2h. Depois deste período as lamínulas foram lavadas para remoção dos parasitas do sobrenadante e o meio de cultura foi restabelecido. As lamínulas só foram fixadas 24 (fig. 16, 24 horas) e 48h depois para a determinação do número de parasitas por 100 células.

A vacuolina, apesar de induzir a vacuolização das células, não altera o padrão de infectividade dos parasitas (fig. 16), o que não é surpreendente, já que esta droga altera a morfologia dos lisossomos mas não interfere na exocitose de lisossomos (Huynh et al., 2005)