Uma vez que as diferenças de permissividade à infecção observadas em algumas células nos experimentos iniciais não estava ocorrendo devido a falta de LAMP, na tentativa de se explicar a razão pela qual esta diferença de infectividade ocorria, testes para avaliar a atividade de exocitose de lisossomos foram realizados nestas células MEF. Inicialmente, a exocitose de lisossomos foi avaliada pela mensuração da atividade de -hexosaminidase no sobrenadante celular após o tratamento com com o ionóforo de cálcio ionomicina (Liu et al., 1978). Uma vez que a exocitose de lisossomos é um evento cálcio dependente (Rodriguez et al., 1997), é esperado que a ionomicina, ao induzir o influxo de cálcio no citoplasma, promova a exocitose de lisossomos, que pode ser mensurada pela atividade da enzima lisossomal β-hexosaminidase no sobrenadante das células após o tratamento com a droga. No primeiro par de células [PS1 (WT) e #48 (L1/L2 -/-)] no qual não houve diferença significativa na invasão (fig. 3A) também não houve diferença na atividade de -hexosaminidase no sobrenadante após o tratamento com ionomicina (fig. 7A), enquanto que no outro par de células [#5 (WT) e #79 (L1/L2 -/-)] a atividade de - hexosaminidase no sobrenadante celular foi maior para a célula #79 em comparação à célula #5 (fig. 7B), resultado similar ao observado para a invasão celular invasão celular (fig. 3B). Assim como a invasão celular pelos amastigotas de T. cruzi foi maior nas células L2 -/- em relação a ambas WT, a atividade de -hexosaminidase do sobrenadante destas células também foi maior em comparação às duas células WT (PS1 e #5) (fig. 7A e B).
Figura 7. A Atividade de -hexosaminidase no sobrenadante celular das células MEF após o tratamento com ionomicina foi semelhante entre as células #48 (L1/L2 -/-) e PS1 (WT) do primeiro par de células analisado (A), mas foi maior na #79 (L1/L2 -/-) em relação a sua WT (#5) (B). A atividade da enzima foi maior no sobrenadante das células L2 -/- em relação a ambas WT (A e B). As células foram tratadas com 10 M de ionomicina em PBS++ durante 10 min. e a atividade de -hexosaminidase foi mensurada tanto no sobrenadante como no extrato celular. Os valores aqui representados são valores relativos à atividade total da enzima nas células analisadas [ -hex (% do total)= -hex no sobrenadante/( -hex no sobrenadante + -hex no extrato celular)] (*p<0,01 em relação às células WT).
Ainda para avaliar a exocitose de lisossomos, após o tratamento com ionomicina as células foram fixadas com formaldeído e marcadas com anticorpo anti- CD63/LIMP-1. Nas células marcadas após a permeabilização com saponina, um claro padrão vesicular de marcação, característico da marcação de lisossomos, pôde ser notado (fig. 8). Na célula #79 (L1/L2 -/-) após o tratamento com ionomicina, é possível notar um padrão de marcação compatível com marcação de membrana (fig. 8 seta larga).
Figura 8. Nas células permeabilizadas, é possível notar uma marcação vesicular característica da marcação de lisossomos com o uso do anticorpo anti-CD63/LIMP- 1. Após o tratamento com ionomicina, nas células #79 (L1/L2 -/-), pode-se observar marcação de membrana com este anticorpo (seta larga). As células foram tratadas com 10 M de ionomicina em PBS++ e imediatamente fixadas com formaldeído. Foram
então permeabilizadas com saponina e marcadas com anticorpo anti-CD63/LIMP-1. Os núcleos foram marcados com DAPI.
Para evitar que o anticorpo entrasse na célula, marcando estruturas intracelulares, as células foram marcadas com o mesmo anticorpo (CD63/LIMP-1) sem serem permeabilizadas. Esta marcação permitiu identificar uma marcação compatível com marcação de membrana (fig. 9 – seta larga) após o tratamento com ionomicina, em todas as células. Aqui estão representadas apenas as células #5 (WT) e #79 (L1/L2 -/-).
Figura 9. Nas células não-permeabilizadas após o tratamento com ionomicina, é possível observar marcação compatível com marcação de membrana pelo anticorpo anti-CD63/LIMP-1 (seta larga). As células foram tratadas com 10 M de ionomicina em PBS++ e imediatamente fixadas com formaldeído. Foram marcadas com anticorpo anti- CD63/LIMP-1 sem que fossem permeabilizadas. Os núcleos foram marcados com DAPI
Assim como no caso da permissividade à invasão pelos AE, as diferenças na liberação de β-hexosaminidase também não estavam, aparentemente, sendo moduladas pela ausência das proteínas LAMP. Para descartar um papel putativo para estas proteínas na modulação da exocitose de lisossomos, a atividade de - hexosaminidase também foi mensurada em células HeLa após tratamento com siRNA. Assim como no caso da invasão celular, apesar de o tratamento com o siRNA ter sido eficaz, como pode ser observado pela diminução na expressão das proteínas LAMP-1 e LAMP-2 no immunoblotting (fig. 10A e B), não foi possível observar alteração na atividade enzimática nas células tratadas com o siRNA contra LAMP-1 e 2 em relação aos controles (fig. 10C).
Figura 10. A interferência por siRNA foi eficaz porém a atividade de - hexosaminidase após o tratamento com ionomicina não foi alterada pelo siRNA em células HeLa. Immunoblotting para LAMP-1 (A) e LAMP-2 (B) e atividade de - hexosaminidase após o tratamento com ionomicina em células HeLa tratadas com siRNA (C). As células foram tratadas por 10 min. com 10 M de ionomicina. O sobrenadante foi recolhido para a avaliação da atividade -hexosaminidase. (L1 e L2 = siRNA anti LAMP-1 e LAMP-2; Lo, Me = siRNA controle recomendados pelo fabricante; NT = não transfectada).
Para confirmar se a atividade de -hexosaminidase no sobrenadante celular após o tratamento com ionomicina era devido, de fato, a exocitose de lisossomos, e não a morte celular, um teste de viabilidade celular foi realizado. Para isso, a atividade de LDH foi mensurada no sobrenadante das células #5 (WT) e #79 (L1/L2 - /-), após o tratamento com ionomicina (fig. 11A). Considerando-se que a exocitose de lisossomos é um processo dependente de cálcio, a mensuração da atividade de LDH, bem como de -hexosaminidase, foi realizada tanto na presença quanto na ausência deste íon (fig. 11A e B). De fato, o tratamento com ionomicina provocou a liberação de LDH para o sobrenadante celular, indicando que houve toxicidade, porém, a atividade de LDH no sobrenadante das células tratadas com ionomicina não sofreu variação quando o cálcio foi adicionado ao PBS (fig. 11A). Já a atividade de -hexosaminidase no sobrenadante celular, mostrou ser dependente da adição de cálcio no PBS (fig 10B), indicando que o fenômeno observado, de liberação de β- hexosaminidase após o tratamento com ionomicina está, de fato, refletindo a exocitose de lisossomos que ocorre nas células em decorrência do influxo de cálcio no citoplasma.
Figura 11. A atividade de LDH no sobrenadante celular está aumentada nas células tratadas com ionomicina em relação às células não tratadas, porém, este fenômeno não é dependente da adição de Ca++ ao PBS (A), enquanto que a atividade de - hexosaminidase, que também aumenta após o tratamento com ionomicina, mostrou ser claramente dependente da adição do íon ao PBS (B). As células foram tratadas por 10 min. com 10 M de ionomicina na ausência (PBS) ou presença de Ca++ (PBS++). O
sobrenadante foi recolhido para a avaliação da atividade de LDH e de -hexosaminidase. Ambos os valores foram expressos como porcentagem do valor total das células.
Com a finalidade de confirmar a importância da exocitose de lisossomos na invasão celular pelos amastigotas extracelulares da cepa G de T. cruzi, foi realizado um experimento de cinética de aquisição do marcador lisossomal CD63/LIMP-1 pelos parasitas internalizados desde momentos bem iniciais da invasão. Para isso, os AE foram centrifugados sobre as células durante 5 min. e incubados a 37 ºC por mais 15 min. e a seguir fixados. O primeiro tempo de fixação foi considerado como tempo 0 e as células foram ainda fixadas após 0,5, 3, 12, 24, 48 e 72h. Os parasitas aderidos foram marcados com soro humano chagásico antes da permeabilização para que fossem diferenciados dos internalizados. Posteriormente as células foram permeabilizadas e marcadas com o marcador lisossomal CD63/LIMP-1. Somente os parasitas internalizados foram contados para a determinação da porcentagem de parasitas internalizados que estavam dentro de vacúolos com características de lisossomos (marcados com CD63/LIMP-1). Assim, os parasitas que aparecem marcados em verde estão, na verdade, dentro de vesículas com características lisossomais. Na figura 12 (tempo 0) é possível a identificação de um parasita aderido (cabeça de seta) e um parasita internalizado e não marcado (seta larga) na célula #5 (WT). Um parasita internalizado e marcado com CD63/LIMP-1 pode ser observado na célula #79 (L1/L2 -/-) (seta estreita), o que significa que este parasita encontra-se dentro de um vacúolo com características lisossomais, uma vez que LIMP foi aqui utilizado como um marcador lisossomal. A marcação de parasitas no tempo 0 significa portanto que parasitas rescém-internalizados encontram-se dentro em lisossomos, um indicativo de que estes parasitas valem-se da exocitose de lisossomos para entrar nestas células.
Figura 12. Na célula #5 (WT) é possível notar um parasita aderido (cabeça de seta) e outro internalizado e não marcado. Na célula # 79 (L1/L2 -/-) é possível notar um parasita internalizado residindo em um vacúolo lisossomal marcado com CD63/LIMP-1 (seta estreita). Os parasitas foram centrifugados sobre as células numa proporção de 20:1 durante 5 min., deixados por mais 15 min. na estufa, fixados e marcados com soro chagásico humano e anticorpo anti-CD63/LIMP-1 e DAPI.
Para o primeiro par de células [PS1 (WT) e #48 (L1/L2 -/-)] não houve diferença na aquisição do marcador lisossomal CD63/LIMP-1 pelos vacúolos dos parasitas internalizados (fig 13A), enquanto que para segundo par de células [#5 (WT) e #79 (L1/L2 -/-)] esta diferença pôde ser observada (fig. 13B). Enquanto que cerca de 50% dos parasitas internalizados pela célula #79 (L1/L2 -/-) já aparecem em vacúolos marcados em momentos iniciais da invasão, menos de 5% dos parasitas que invadiram a célula #5 (WT) encontram-se marcados no tempo 0. Também uma porcentagem maior dos parasitas que invadiram as células L2 -/- encontram-se em vacúolos marcados em comparação aos parasitas que invadiram a célula L1 -/- (fig 13A e B). Estes resultados corroboram a importância da exocitose de lisossomos para a invasão celular, uma vez que nas células mais permissivas à invasão em relação à sua célula selvagem (WT) correspondente (fig. 3A e B) é possível notar uma maior porcentagem de parasitas dentro de vacúolos com características lisossomais (LIMP+) (fig. 13A e B) logo nos momentos iniciais de invasão. Cerca de 3h após a invasão a porcentagem de parasitas internalizados que apresentam-se dentro de vacúolos lisossomais (marcados) é similar em todas as células.
Figura 13. No primeiro par de células [PS1 (WT) e #48 (L1/L2 -/-)] não houve diferença na aquisição do marcador lisossomal pelos vacúolos parasitófors dos parasitas recém-internalizados, enquanto que no segundo par de células há muito mais parasitas dentro de vacúolos lisossomais nas células #79 que nas células #5. Uma diferença importante na aquisição do marcador também pode ser notada nas células L1 -/- em comparação as células L2 -/-. (A) Cinética de aquisição do marcador lisossomal CD63/LIMP-1 no primeiro par de células [PS1 (WT) e #48 (L1/L2 -/-)] e (B) no segundo par [#5 (WT) e #79 (L1/L2 -/-)]. Vinte parasitas:célula foram centrifugados sobre as células durante 5 min., deixados por mais 15 min. na estufa, fixados em diferentes tempos e marcados com soro chagásico humano e anticorpo anti- CD63/LIMP-1 e DAPI. Os gráficos representam o valor relativo de parasitas marcados com o marcador lisossomal em relação aos parasitas intracelulares.
Ainda corroborando a importância da exocitose lisossomal para a invasão dos parasitas nas células MEF, quando estas foram tratadas com a cloroquina, houve redução na taxa de invasão de todas as células (fig. 14). Este resultado pode ser atribuído a diminuição que ocorre na fusão entre os lisossomos e a membrana plasmática ocasionado pelo aumento no pH vesicular promovido pela droga.
Figura 14. A cloroquina diminui significativamente a invasão em todas as células analisadas (*p<0,01 e **p<0,05). As células foram tratadas com 100 M de cloroquina por 1h. Depois deste tempo as células foram lavadas 5 vezes com PBS e depois foi realizado um ensaio de invasão igual ao da fig. 3. Os resultados foram expressos como porcentagem de invasão em relação ao controle, que foi considerado 100%.
4.3. A exocitose de lisossomos também é importante para o processo de