CONWIP sistemleri

Trypanosoma cruzi, é modulada diferencialmente em células nocaute para

LAMP.

Inicialmente foi verificado o papel das proteínas de membrana lisossomais LAMP-1 e LAMP-2 na invasão celular por formas AE de T. cruzi. Com esta finalidade foram utilizadas células nocaute para estas proteínas. Três diferentes pares de linhagens de células duplo nocaute e selvagem (WT) foram utilizadas, além de uma linhagem de nocaute para LAMP-1 e outra para LAMP-2. O primeiro par de células WT/dKO era constituído por dois subclones e foram aqui nomeados como WT e L1/L2 -/-. O segundo par [PS1 (WT) e #48 (L1/L2 -/-)] era constituído por MEF imortalizadas por símian vírus (SV) e o terceiro par [#5 (WT) e #79 (L1/L2 -/-)] era composto de células imortalizadas espontaneamente (Andrejewski et al., 1999; Tanaka et al., 2000; Andrejewski et al., 1999; Eskelinen et al., 2004). Estas células eram periodicamente testadas para a confirmação do fenótipo. O teste era realizado por imunofluorescência com anticorpos anti LAMP-1 e anti LAMP-2 e em todas as ocasiões os fenótipos estavam corretos (dado não mostrado).

Os resultados preliminares de invasão celular, realizados com o primeiro par de MEF WT/dKO indicaram que a ausência de LAMP-2 poderia facilitar a invasão celular tanto por amastigotas da cepa G (fig. 1A), quanto por amastigotas da cepa CL (fig. 1B), pois a taxa de invasão estava aumentada tanto nas células L2 -/-, quanto nas células L1/L2 -/- em relação às células WT.

Figura 1. Amastigotas extracelulares da cepa G e CL invadem mais eficientemente subclones de MEF nocaute para LAMP-2 e as duplo nocaute (L1/L2 -/-). Invasão celular por AE das cepas G (A) e CL (B). Amastigotas da cepa G foram deixados em contato com as células por 2h numa proporção parasita:célula de 10:1, enquanto que amastigotas da cepa CL interagiram com as células por 3 horas numa proporção de 30:1 (*p<0,01 em relação às células WT).

Para se multiplicar no citoplasma da célula hospedeira T. cruzi deve escapar do VP. Este escape é de dependente da ação da transialidase (Rubin-de-Celis et al., 2006), que transfere ácido siálico de glicoproteínas celulares para aceptores do parasita, facilitando a ação da proteína formadora de poros TcTox (Hall et al., 1992). Sabe-se que o escape dos AE do VP é mais rápido em células deficientes em ácido siálico (Lec-2) quando comparado ao escape do VP de células CHO controle (Stecconi-Silva et al., 2003). Ademais, as proteínas LAMP-1 e LAMP-2 são altamente glicosiladas e ricas em ácido siálico (Eskelinen et al., 2003). Neste contexto, a multiplicação intracelular dos parasitas foi analisada para verificar se a ausência de LAMP poderia influenciar no escape do VP e conseqüentemente na multiplicação intracelular dos parasitas. Com este primeiro par de células WT/dKO o crescimento dos parasitas foi acompanhado até 72h. O resultado foi expresso em relação à quantidade de parasitas intracelulares no primeiro tempo avaliado (24h). A ausência das proteínas LAMP-1 e/ou LAMP-2 não interferiu na multiplicação dos parasitas, nem da cepa G (fig. 2A), nem da cepa CL (fig. 2B).

Figura 2. A ausência das proteínas LAMP-1 e/ou LAMP-2 não interfere na multiplicação intracelular dos amastigotas extracelulares das cepas G e CL. Os parasitas da cepa G (A) e CL (B) foram colocados em contato com as células nas mesmas proporções e pelo mesmo tempo que para os experimentos de invasão, depois deste tempo as células foram lavadas para remoção dos parasitas do sobrenadante e o meio foi recolocado nas células, que foram fixadas 24, 48 e 72h após a invasão. O número de parasitas por célula infectada foi determinado e aqui foram expressos os valores relativos ao primeiro tempo (24h).

Devido ao fato de que os resultados preliminares com as cepas G e CL foram similares, a não ser pelo fato de que os AE da cepa G são muito mais infectivos que os da cepa CL, os resultados subseqüentes foram todos conduzidos apenas com AE da cepa G. Outros dois pares de células WT/dKO foram testados e, surpreendentemente, os resultados foram conflitantes. Enquanto que para o primeiro par de células [PS1 (WT) e #48 (L1/L2 -/-)] não houve diferença significativa na taxa de invasão (fig. 3A), no segundo par testado [#5 (WT) e #79 (L1/L2 -/-)] os parasitas invadiram as células L1/L2 -/- com maior eficiência em relação à célula selvagem correspondente (fig. 3B). A taxa de invasão nas células L2 -/- foi significativamente maior em relação a ambas WT analisadas (fig. 3A e B).

Figura 3. A taxa de invasão é maior nas células L2 -/- em relação à PS1 (WT) (A) e também é maior nas células L2 -/- e #79 (L1/L2 -/-) em relação a #5 (WT) (B). Os amastigotas extracelulares da cepa G interagiram por 2 horas com as células numa proporção de 10 parasitas:célula (*p<0,01 e **p<0,05em relação às células WT).

A multiplicação intracelular dos parasitas também foi testada nestes outros dois pares de células, e, assim como no primeiro par de células testadas, a ausência de LAMP-1 e/ou LAMP-2 não alterou a multiplicação intracelular dos parasitas (fig. 4).

Figura 4. A ausência das proteínas LAMP-1 e/ou LAMP-2 não interfere significativamente na multiplicação intracelular dos amastigotas extracelulares nas células analisadas. (A) Células [PS1 (WT) e #48 (L1/L2 -/-)], (B) células [#5 (WT) e #79 (L1/L2 -/-)]. Os parasitas foram colocados em contato com as células por 2h numa proporção de 10 parasitas:célula, depois deste tempo as células foram lavadas para remoção dos parasitas do sobrenadante e o meio foi restabelecido nas células, que foram fixadas 2, 24 e 48h após a invasão. O número de parasitas por célula infectada foi determinado e aqui foram expressos os valores relativos ao primeiro tempo (2h).

Como os resultados anteriores de invasão celular nas células nocaute tinham sido contraditórios, e, aparentemente as diferenças de infectividade observadas nas células não eram devido à falta de LAMP, uma vez que não houve diferença significativa na invasão entre as células #48 (L1/L2 -/-) e PS1 (WT), uma metodologia alternativa foi utilizada para descartar a participação de LAMP nas diferenças de infectividade acima observadas. Neste sentido foram realizados experimentos de invasão em células tratadas com siRNA contra LAMP-1 e/ou LAMP-2. Estes testes foram feitos tanto em células HeLa (fig. 5), quanto nas MEF WT (PS1 e #5) (fig. 6). Entretanto, apesar do tratamento com siRNA ter sido efetivo, como pôde ser constatado pela diminuição na expressão das proteínas LAMP-1 e LAMP-2 observada no immnobloting (fig. 5A e B e fig. 6A e B), o tratamento das células com siRNA não promoveu nenhuma alteração na taxa de invasão em relação às células tratadas com siRNA controle ou às células não transfectadas (fig 5C e 6C e D). Este resultado forneceu mais um indício de que, na verdade, as diferentes taxas de invasão anteriormente observadas são independentes das proteínas LAMP-1 e LAMP-2.

Figura 5. O tratamento de células HeLa com siRNA promove diminuição na expressão das proteínas LAMP-1 (A) e LAMP-2 (B), mas não promove alteração na taxa de invasão celular por amastigotas extracelulares de T.

cruzi (C) (L1 e L2 = siRNA anti LAMP-1 e LAMP-2; Lo, Me = siRNA controle

Figura 6. O tratamento de células MEF com siRNA promove diminuição na expressão das proteínas LAMP-1 (A) e LAMP-2 (B), mas não promove alteração na taxa de invasão celular por amastigotas extracelulares de T. cruzi, nem na célula PS1 (WT) (C), nem na célula #5 (WT) (D). (L1 e L2 = siRNA anti LAMP-1 e LAMP-2; Lo, Me = siRNA controle recomendados pelo fabricante; NT = não transfectada).

4.2. A maior taxa de infectividade esteve relacionada à maior exocitose de