Çekme Sistemleri

3.10.1. Invasão e crescimento intracelular dos parasitas

Para os ensaios de invasão e crescimento intracelular dos parasitas as células (MEF) foram distribuídas em placas de 24 poços sobre lamínula de vidro 24h antes do experimento (8 x 104 células/poço). No momento do experimento os amastigotas extracelulares da cepa G foram colocados em contato com as células numa proporção de 10:1 durante 2h e da cepa CL numa proporção de 30:1 durante 3h. Após este período, as placas foram lavadas 5 vezes com PBS para retirar os parasitas que ainda estivessem no sobrenadante. Para os ensaios de invasão, passadas as 2h, as lamínulas foram fixadas com Bouin durante 5 min. (71,4% de solução supersaturada de ácido pícrico, 23,8% de formaldeído, 4,8% de ácido

acético) e coradas com Giemsa (4 gotas por ml) por 1 hora. Depois deste período as lamínulas foram clarificadas em bateria de acetona:xilol (acetona pura 2 vezes, acetona:xilol (9:1), acetona:xilol (7:3), acetona:xilol (3:7), xilol puro) e montadas sobre lâmina (Cytoseal, Thermo Scientific). Foram contadas aleatoriamente 300 células para determinar a quantidade de parasitas intracelulares e o valor foi expresso como parasitas intracelulares para cada 100 células. Para avaliar o crescimento intracelular dos parasitas, após a lavagem para remoção dos parasitas do sobrenadante, o meio de cultura foi recolocado nos poços e as lamínulas foram fixadas 24, 48 e 72 horas após a infecção. Cem células infectadas foram contadas em cada lamínula para a determinação do número de parasitas por célula infectada. Os valores foram expressos como a quantidade de parasitas em relação ao tempo inicial:

Crescimento em relação ao tempo 2 h = parasitas/célula infectada tempos 24ou 48 h

parasitas/célula infectada tempo 2 h

Também foram realizados ensaios para avaliar o efeito da cloroquina (sigma) na invasão celular em MEF. Para isso as células foram tratadas com 100 M de cloroquina por 1h. Depois deste tempo as células foram lavadas 5 vezes com PBS e o ensaio de invasão procedeu-se como citado anteriormente. DMSO foi usado como controle. Os resultados foram expressos como porcentagem de invasão em relação ao controle, que foi considerado 100%, seguindo a fórmula:

% de infecção = (parasitas intracelulares nas células tratadas com as drogas) x 100 parasitas intracelulares nas células controle

Em outro experimento, células HeLa foram tratadas com diferentes concentrações (1, 2 e 5 M) de vacuolina por 1 hora. As células foram lavadas 5 vezes com PBS, o meio foi trocado e os parasitas interagiram com as células por 2 horas. Depois deste período as lamínulas foram lavadas 5 vezes e o meio de cultura foi restabelecido nas células, que foram fixadas 24 e 48h depois. Trezentas células de cada lamínula foram contadas para determinação da taxa de invasão.

Os dados deste ítem são relativos a pelo menos 3 experimentos independentes realizados em triplicata.

3.10.2. Invasão celular em células tratadas com siRNA

As células [PS1 (WT), #5 (WT) ou HeLa] foram plaqueadas em placas de 6 poços com 3 lamínulas de vidro em cada poço e, 24h após foram tratadas com o siRNA para LAMP-1 e/ou LAMP-2, de acordo com o protocolo do item 3.8 [Interferência de RNA (siRNA)]. Após 72h de tratamento as células foram lavadas e os amastigotas da cepa G foram colocados para interagir com as células numa proporção de 10 parasitas:célula durante 2 horas. As lamínulas foram então fixadas com Bouin e coradas com Giemsa conforme previamente descrito. Uma segunda placa de 6 poços tratadas com os mesmos siRNA foi usada para o preparo de extratos celulares para a avaliação da diminuição da expressão das proteínas LAMP por

immunoblotting. Cada ensaio era realizado em triplicata. Os resultados de pelo

menos 3 experimentos foram expressos nos resultados.

3.10.3. Avaliação da exocitose de lisossomos

Para avaliar a exocitose de lisossomos as células MEF (106 _{células/poço) foram}

plaqueadas em placas de 6 poços 24 h antes do experimento. As células foram tratadas por 10 min. com 10 M de ionomicina diluída em PBS++ _{(PBS com 1 mM de}

CaCl2 e 0,5 mM de MgCl2) ou somente com PBS++ como controle, num volume de 2

ml por poço. A atividade de -hexosaminidase foi avaliada tanto no sobrenadante quanto no extrato celular, conforme descrito no item 3.5 (Determinação da atividade de -hexosaminidase). Para avaliar a viabilidade celular a atividade de lactato desidrogenase (LDH) também foi avaliada nas células #5 (WT) e #79 (L1/L2 -/-) na presença ou na ausência de CaCl2 e MgCl2 após o tratamento com ionomicina,

conforme descrito no item 3.6 [Determinação da atividade de lactato-desidrogenase (LDH)]. Os testes eram realizados em duplicata e pelo menos 4 testes foram realizados. Os resultados expressam as médias dos experimentos. Ainda para avaliar a exocitose de lisossomos, as células MEF (105 células/poço) foram plaqueadas sobre lamínulas de vidro em placas de 24 poços, 24h antes do experimento e também foram submetidas ao tratamento com ionomicina em PBS++, fixadas com formaldeído 3,5% e marcadas com anticorpo anti-CD63/LIMP-1 tanto em células não permeabilizadas quanto em células permeabilizadas, conforme

descrito Np item 3.7 (Imunofluorescência). Células HeLa, tratadas com siRNA conforme descrito no item 3.8 [Interferência de RNA (siRNA)]

também foram avaliadas quanto a atividade de -hexosaminidase após o tratamento 10 M de ionomicina diluída em PBS++ ou, somente com PBS++ como controle. Os testes eram realizados em duplicata e pelo menos 4 testes foram realizados. Os resultados expressam as médias dos experimentos.

3.10.4. Cinética de aquisição de CD63/LIMP-1 e LAMP-1

As células MEF foram plaqueadas em placas de 24 poços (8 x 104 células/poço) , 24h antes do experimento e 20 amastigotas/célula foram centrifugados sobre as células durante 5 min. a 2000 rpm. As placas foram então colocadas por mais 15 min. em estufa de CO2, as lamínulas foram lavadas 5 vezes

em PBS, foram fixadas 0; 0,5; 3; 12; 24;48 e 72h após este tempo com formaldeído 3,5% (Merk) e foram marcadas com CD63/LIMP-1. Para diferenciar os parasitas aderidos dos iternalizados, os primeiros foram marcados com soro chagásico humano antes da permeabilização, conforme descrito no item 3.7 (Imunofluorescência).

Células HeLa e Vero foram utilizadas em um experimento similar, para avaliar a aquisição de LAMP-1 pelos parasitas em momentos iniciais da invasão. Estas células (8 x 104 _{células/poço) foram igualmente plaqueadas 24 horas antes do}

experimento. Os amastigotas foram centrifugados sobre as células numa proporção de 20:1 durante 10 min. As placas foram lavadas 5 vezes em PBS e as lamínulas foram fixadas nos tempos 0, 15, 30 e 60 min., marcadas com anti LAMP-1 e contadas conforme descrito acima. Cem células em cada lamínula foram contadas para a avaliação da porcentagem dos parasitas intracelulares marcados com o marcador CD63/LIMP-1 ou LAMP-1, seguindo a fórmula:

% parasitas LIMP+ = (parasitas intracelulares marcados com LIMP) x 100. Parasitas intracelulares

Pelo menos 3 testes foram realizados em triplicata e os resultados expressam as médias dos resultados.