Yapı iskelesinin in-vitro hücre kültürü ve canlılık testleri

Bu çalışmanın ilk kısmında, fiziksel olarak optimum özellikler gösteren polimer karışımları belirlenerek seçilmiştir. İkinci bölümde ise seçilen PLA/TPU2 karışımlarının yapı-iskelesi olarak potansiyel kullanımını araştırmak amacıyla in- vitro hücre kültürü ve sitotoksisite çalışmaları yapılmıştır. Bu aşamada L-929 sıçan fibroblast hücre hattı kullanılarak üretilen doku iskeleleri üzerinde hücre tutunması

ve çoğalması araştırılmıştır. Ayrıca sitotoksisite testi sırasında toksik etki sonucu kültürde canlı kalan hücre oranı belirlenmiştir.

1.3.4.1. In-vitro hücre kültürü

Hücre kültürü yönteminin temel ilkesi, canlı dokulardan alınan parçaların in vitro koşullarda yaşama ve üremelerini sağlamaktır. Bu amaçla çeşitli canlıların (insan, maymun, fare, tavşan gibi) çeşitli dokuları (böbrek, akciğer, tümör, amniyon zarları) önce parçalanarak tek tek hücrelere ayrılırlar. Bu hücreler çeşitli tuzlar, tampon maddeleri, amino asitler, vitaminler, dana veya at serumu içeren besleyici sıvılarda süspanse edilerek steril tüp veya şişelere koyulur. Bu hücre süspansiyonu 36ºC’de bekletildiğinde hücreler kabın çeperine yapışarak ürerler. Üreme sonucunda oluşan yapıya hücre kültürü denir.

Hücre kültürü çalışmalarında iki tip hücre kullanılır. Bunlar primer hücreler ve devamlı hücre hatlarıdır. Primer hücre kültürleri doku ve organlardan ayrılan hücrelerin 24 saatten daha uzun süre kültür edilmesiyle elde edilir. Diş eti ve pulpa fibroblastları, primer kültür hücrelerine örnektir. Primer hücre kültürlerinde çoğalan hücreler buradan alınıp başka kültürlere ekilebilir ve çoğaltılabilir. Bu şekilde elde edilen ilk alt kültürlere sekonder hücre kültürleri denir ve bir seri kültür işlemlerinden sonra hücre hatları elde edilir. Fakat primer kültürlerin insandan izole edilmesi ve kültürünün yapılması oldukça zordur. Primer kültürler farklı bireylerden alındığı için fonksiyonel durumları yansıtması farklıdır. Devamlı hücre hatları süresiz çoğalabilme özelliğine sahip transformasyona uğramış primer hücrelerdir ve daha kararlı bir fenotipe sahiptir. Devamlı hücreler meydana gelen transformasyondan dolayı in vivo özelliklerinin tümünü koruyamazlar. Devamlı hücre hatları kolaylıkla çoğaltılabilir. Çalışmalarda sıklıkla kullanılan devamlı hücre hatları fare fibroblastları (L929, 3T3) veya insan epitelyal hücreleridir (HeLa) (Tuncer ve Demirci, 2011).

1.3.4.2. Sitotoksisite testi

Uygulanan malzemenin hücrenin yaşamına olan etkisi biyouyumluluğu belirleyici etkendir. Sitotoksisite moleküler olaylar sonucu çeşitli makromoleküllerin sentezlenmesinin engellenmesi ve buna bağlı olarak hücrenin fonksiyonlarında ve

yapısında belirgin hasarlar meydana gelmesi olarak tanımlanır. Sitotoksisite testlerinde hücre kültürleri kullanılarak olası toksikolojik reaksiyonlar in-vitro olarak değerlendirilmektedir. Sitotoksite testleri; hücre canlılığı ve ölümü, hücre membranı, hücre organalleri, protein veya DNA sentezi, hücre bölünmesi vb. ile ilgili detaylı bilgiler verir.

Sitotoksisite değerlendirme yöntemleri dört başlık altında incelenebilir. Bunlar (Tuncer ve Demirci, 2011):

-Canlılık (viability) değerlendiren testler (Kısa dönemde oluşan toksik reaksiyonların etkileri incelenir.),

-Yaşam değerlendiren testler (Uzun dönemde oluşan toksik reaksiyonların etkileri incelenir.),

-Hücre proliferasyonunu değerlendiren testler, -Metabolik sitotoksisite değerlendirme testler şeklinde sıralanabilir.

Bu doktora çalışmasında, canlılık değerlendirmesi Tripan mavisi ve WST-1 uygulanarak yapılmıştır. Tripan mavisi, membran bütünlüğü bozulmuş hücrelerde biriken bir boyadır. Hemositometre yardımı ile tripan mavisi ile boyanmış hücrelerin oranı tespit edilir.

Öncelikle incelenecek hücreler tripan mavisi ile boyanır. Bu boya, canlı hücreler tarafından dışarı atılırken ölü hücreleri koyu mavi renge boyar. Hücreler, hematositometre olarak adlandırılan bir çeşit bölmeli lama damlatılır ve bunun üzerinde mikroskop altında tek tek sayılır. Şekil 1.25’de hematositometre ve mikroskopta hücre sayımı gösterilmiştir. Bu yöntemde, hemositometre yardımı ile tripan mavisi ile boyanmış (canlı olmayan) hücrelerin canlı hücrelere oranı tespit edilir.

Şekil 1.30. Hematositometre ve hücre sayımı (URL-8)

1.3.4.3. Invert ışık mikroskobu

Işık mikroskobu iletim, absorpsiyon, kırınım ve ışık dalgalarının kırılması prensiplerine dayanır ve ilk görünüşte görülmesi mümkün olmayan obje ve numunelerin büyütülmüş ve detaylandırılmış görüntülerini oluşturur. Mikroskoplar objeleri büyütmekte ve aynı anda dereceli bir şekilde objelerin çözünürlüğünü arttırmaktadır. Görüntü büyütülmesi ve çözünürlük eş zamanlı düşünülmesi gereken iki olaydır.

Mikroskoplarda çözünürlük ve görüntü büyütülmesi, ışık ve mikroskop lensleri ile sağlanmaktadır. Lensler, kullanılan ışığı çeşitli amaçlar için yönlendirmemizi sağlamaktadır. Bu süreçte mikroskop içerisindeki numuneler, ışın demetini kırınım ile bükebilen bir konveks mercek ile büyütülür. Işınlar, obje üzerindeki noktalardan ayrılması sonucu konveks merceğin arkasındaki bir noktaya yönlendirilirler ve birbirleri arasında çaprazlama geçişler ile görüntü noktalarını (örneğin odaklama görüntüleri) oluştururlar. Yüksek çözme gücündeki kaliteli mercekler temiz ve detaylı görüntü sağlamak adına çok önemlidirler. Mikroskobun çözme gücü aynı zamanda numuneye ışığı ileten kondansatöre de büyük bir ölçüde bağlıdır (Keller ve Robert, 2006).

Mikroskop altında büyütülmüş görüntünün mikroskop ile görülebilesi için, yüksek düzeyde kontrast gerekmektedir. Kontrastın, ışık yoğunluğu ve ışığın lenslerden geçme açısı değistirilerek, ayarlanması mümkündür. Işığın aydınlatma merceğinden (kondensor) gelme açısı, mikroskopta bulunan ve diyafram adı verilen bölüm ile ayarlanmaktadır. Kontrastı ayarlamada kullanılan bir başka yöntemde, aydınlatma kaynağının önüne konabilen filtrelerdir. Bundan başka, incelenecek olan örneğin çesitli kimyasallar ile boyanması ile de kontrastı güçlendirmek mümkündür. Alternatif olarak, birçok farklı tipte özel olarak geliştirilmiş mikroskop sistemleri ile canlı numunelerin kontrastları iyileştirilebilir. Bu sistemlerden bazıları; eğik ışıklandırma (oblique ilumination), kara yüzey, faz kontrastı, polarize edilmiş ışık, flüoresans, inverted (ter) mikroskobu şeklinde sıralanabilir (Keller ve Robert, 2006). İnverted faz kontrast mikroskobu hücre kültürü çalışmalarında çok önemlidir (Şekil 1.31). İnverted mikroskop, kültür devam ederken hücrelerin büyümesi, morfolojik özellikleri ve kontaminasyon olup olmadığı invert mikroskopta takip edilir. Normal araştırma ışık mikroskobu (florasan ataçmanlı) kültür sonrası testler (canlılık, sitogenetik, hücre sayımı vb.) için gereklidir. Hücreleri gözlemek için de faz kontrast mikroskoplar kullanılır (Smith, 1852; Oktar N., 2009).

Şekil 1.31. Işık miksroskobu (URL-9)