Enzimatik bozunma

Enzimatik bozunma hızı, hidrolitik bozunma hızından daha hızlı olduğundan ve in- vitro koşulları daha gerekçesi yansıttığı için bu bölümde, hazırlanan polimer karışımların enzim eşliğinde biyolojik bozunması araştırılmıştır.

Hazırlanan PLA/TPU2 polimer karışımları ester bazlı polimerlerdir. Çalışmada ilk olarak, karışımı oluşturan bileşenlerin enzimatik bozunma mekanizmaları incelenmiştir. Karışımı oluşturan PLA ve TPU2 polimerlerinin yapılarındaki ester bağlarının enzimatik hidrolizi ile bozunma sürecine uğrayacağı belirtilmiştir. Polimerik biyomalzemelerin enzimatik hidrolizi heterojen bir proses olup, polimer zincirleri ile enzimler arası etkileşimden etkilenir ve genel olarak dört basamakta gerçekleşir (Helena ve diğ.,2004):

i- Bulk çözeltiden katı örnek yüzeyine enzim difüzyonu,

ii- Substratta enzimin adsorbe edilmesi ve bunu sonuncunda enzim-subtrat kompleksinin oluşması,

iii- Hidroliz reaksiyonunun katalizlenmesi,

iv- Çözünen bozunma ürünlerinin katı substrattan çözeltiye difüzyonu.

Yapılan çeşitli çalışmalarda, polimer karışımların bozunma mekanizmaları incelenmiş ve karışımı oluşturan bileşenlerin kimyasal yapılarına ve bozunma mekanizmalarına bağlı olarak, karışımın bozunma hızını pozitif ya da negatif yönde etkileyebileceği öne sürülmüştür (Mahalik ve Madras, 2006). Yapılan literatür çalışmalarında, PLA ve ester bazlı TPU’nun yapılarındaki ester gruplarının hidrolize uğraması ile bozunduğu ancak TPU’nun yapısındaki üretanın ester gruplarından daha yavaş hidrolize uğradığı belirtilmiştir. Bu nedenle PCL bazlı TPU’nun bozunma hızı PLA’dan çok daha yavaştır (Cauich-Rodriguez ve diğ., 2013). Bu tez çalışmasında ise hazırlanan PLA/TPU2 karışımları ile son ürün bozunma hızının kontrol edilebileceği düşünülmüştür.

PLA ve TPU polimerlerinin enzimatik bozunması ile ilgili yapılan çalışmalarda, proteinaz, esteraz gibi çeşitli enzimler kullanıldığı görülmüştür (Tokiwa ve diğ., 2009). Farklı bir çalışmada, polimerlerin ester bağlarının parçalanması ile hidrolitik bozunmaya uğraması sırasında ortamın esterolitik olmasının bozunma hızını arttırdığı belirtilmiştir (Hafeman ve diğ., 2011). Proteinaz ve esteraz enzimleri proteinaz ve esteraz aktivasyonlarının her ikisine de sahiptirler (Myers ve diğ., 1988). Bu tez çalışmasında PLA/TPU2 polimer karışımlarının enzimatik bozunması için Proteinaz K tipi enzim tercih edilmiştir. Bozunma sırasında PLA ve PCL temelli TPU polimerlerinin ester bağlarının rastgele bir şekilde hidrolize uğrayacağı belirtilmiştir (Tokiwa ve diğ., 2009; Mahalik ve Madras, 2006).

Şekil 4.29’da hazırlanan polimer karışımların zamana bağlı enzimatik bozunma hızları verilmiştir. Biyobozunma mekanizmasının polimerlerin hem kimyasal hemde fiziksel özelliklerinden etkilendiği bilinmektedir. Yüzey koşulları (yüzey alanı, hidrofilik ya da hidrofobik özellikler), polimerin birinci derece yapıları (kimyasal yapı, molekül ağırlığı ve molekül ağırlığı dağılımı) ve yüksek düzeyli yapıları (camsı geçiş sıcaklığı, erime sıcaklığı, elastik modül, kristalinite, kristal yapı), polimerlerin ağırlıkça bileşimi, enzim ve enzim koşulları biyobozunma prosesinde önemli rol oynar. Ayrıca enzimatik bozunma çalışmalarında polimerin bozunduğu çözelti ortam koşullarının (sıcaklık, pH vb.) öneminin büyük olduğu, çünkü her bir enzimin aktivasyonu için gerekli koşulların farklı olduğu belirtilmiştir (Mahalik ve Madras, 2006; Azevedo ve Rei, 2005; Tokiwa ve diğ., 2009). Örneğin Tokiwa ve diğ (2009), Tokiwa ve Suzuki (1978) yaptıkları çalışmada polimerin molekül ağırlığının artması ile bozunmasının azaldığı sonucuna varmışlardır.

Doktora çalışması sırasında enzimatik bozunma testleri başlatılmadan önce çeşitli pH ve sıcaklıklarda kontrol deneyleri gerçekleştirilmiş ve bunun sonucunda belirlenen optimum koşullarda çözelti ortamı hazırlanmıştır. Bozunma testleri, sabit 37˚C sıcaklıktaki Tris-HCl (0,05M, pH 8,6) temelli çözeltide yapılmıştır. Test için sabit yüzey alanına sahip (2x2x0,1±0,05mm) film örnekler hazırlanmıştır.

Şekil 4.29 a-c ve 4.30’da saf PLA, saf TPU2 ve uyumlaştırılmış, uyumlaştırılmamış PLA/TPU polimer karışımların biyobozunma testi sırasında farklı günlerde çekilmiş fotoğrafları verilmiştir. Şekil 4.31.a’da biyobozunma sonuçları incelendiğinde, ilk

olarak TPU2’nin PLA’dan daha yavaş bozunmuştur. Elde edilen bu sonuça paralel olarak 50TPU2’nin 20TPU2’den daha yavaş bozunduğu görülmüştür. Elde edilen bu sonuç daha öncede tartışıldığı üzere beklenilen bir sonuç olup, TPU2’nin PLA’dan daha yavaş bozunması ve bileşimdeki TPU2 oranının artması sonucu karışım bozunma hızının düşmesi ile açıklanabilir (Şekil 4.23).

Şekil 4.29. PLA ve TPU2 polimerlerinin biyobozunması sırasında farklı günlerde çekilmiş fotoğrafları a)0.gün, b)5.gün, c)8.gün

a b

c

Şekil 4.30. PLA/TPU2 karışımlarının biyobozunması sırasında farklı günlerde çekilmiş fotoğrafları a)0.gün, b)6.gün, c)8.gün

a

b

Şekil 4.30. (Devam)

Bu çalışmada karışımın performans özelliklerinin iyileştirilmesi amacı ile reaktif ekstrüzyon yöntemi ile uyumlaştırma çalışmaları yapılmıştır. Uyumlaştırma işlemi için PLA/TPU2 karışımına PDI ilave edilmiştir. Uyumlaştırma işlemi sonucunda olası blok kopolimer oluşumları karışımın kompleks viskozitesini arttırmıştır. Karışımların enzimatik bozunma hızı Şekil 4.31’deki kompleks viskozite değerinin artması ile düşmüştür. Enzimatik bozunma hızı en düşük polimer karışım (50TPU2- 3PDI) kompleks viskozite değeri en yüksek olan polimer karışım iken bozunma hızı en yüksek polimer karışım (20TPU2) kompleks viskozite değeri en düşük olan polimer karışımdır. Uyumlaştırılmış ve uyumlaştırılmamış PLA/TPU2 karışımlarının enzimatik bozunma hızları arasındaki ilişki 20TPU2>50TPU2>50TPU2- 0,5PDI>20TPU2-0,5PDI=20TPU2-1PDI>20TPU2-3PDI>50TPU2-1PDI>50TPU2- 3PDI şeklinde sonuç vermiştir. Söz konusu bu sonuçlar literatür ile uyum içerisindedir.

c

Şekil 4.31. Polimer karışımların zamana bağlı enzimatik bozunma hızı a)PLA, TPU2 polimerleri, b)uyumlaştırılmış ve uyumlaştırılmamış 20TPU2, 50TPU2 karışımları, b)uyumlaştırılmış ve uyumlaştırılmamış 20TPU2, 50TPU2 karışımları

4.3.3. In-vitro Hücre Kültürü ve Hücre Canlılık Testi