Western Blot Yöntem

2-BAJE ve ardından uyguladığımız protein analizi ile Fkbp52-/- uterusta azaldığını gösterdiğimiz PRDX6’nın ekspresyon düzeyini belirlemek için Western Blot yöntemini kullandık. Bu amaçla 2-BAJE için kullanılan fare modelleri ve deney dizaynı tekrar oluşturuldu. C57BL6/129 genetik zeminli VT, Fkbp52-/- ve Pgr-/- fareler overektomize edildi, 2 hafta sonra 2 gün boyunca 2mg/0.1ml P4 enjeksiyonu yapıldıktan

Western Blot (WB) yöntemi ayrıca CD1 genetik zeminli farelerden gebeliğin 1 ve 4. günlerinde toplanan uteruslar ile gebeliğin 5, 8 ve 12. günlerinde toplanan implantasyon bölgelerinde PRDX6 proteininin miktarını belirlemek için uygulandı. 3.5.5. Đmmünopresipitasyon Yöntemi bölümünde anlatılan çökeltilerdeki PRDX6 ve FKBP52 proteinlerinin varlığını saptamak amacıyla WB uygulandı. Kültüre edilen fare embriyonik fibroblastlarındaki (FEF) PRDX6 ve FKBP52 proteinleri de WB ile belirlendi. Western Blot yöntemi uygulanmadan önce uterus, implantasyon bölgesi ya da fibroblastlar homojenize edilerek protein izolasyonu gerçekleştirildi.

3.5.3.1. Doku Homojenizasyonu ve Protein Elde Edilmesi

Đçerisinde uterus ve implantasyon bölgelerinin bulunduğu ependorf tüpleri - 80oC’den çıkarılarak buz üzerine kondu. Dokular tartılarak cam tüpler içerisine alındı. Tüplere 1:100 oranında fosfataz inhibitör kokteyli 1 (Sigma-Aldrich P2850), fosfataz inhibitör kokteyli 2 (Sigma-Aldrich P5726) ve proteaz inhibitör kokteyli (Sigma-Aldrich P8340) içeren Ripa tamponu 0.1 gr dokuya 1 ml olacak şekilde eklendi. Sonikatör ile örnekler homojenize edildi, 15 dakika buz üzerinde bekletildi. Süre bitiminde lizatlar cam tüplerden 1.7 ml’lik plastik tüplere transfer edildi. Yirmi dakika boyunca 14X1000 rpm hızda santrifüj edildi. Süre bitiminde süpernatanlar yeni plastik tüplere alındı. Süpernatanlardaki protein konsantrasyonu BioRad Dc Protein assay (Reagent A-250 ml- cat# 500-0113; Reagent B-1 lt-cat#500-0114; Reagent S-5 ml-cat#500-0115) ile ölçüldü. Öncelikle konsantrasyonu 1.35 µg/µl olan bovine serum albumin/sığır serum albumin (BSA) kullanılarak altı farklı konsantrasyonda standart hazırlandı.

BSA (µl) (1.35 µg/µl konsantrasyon) H2O (µl) 0 25 1 24 3 22 6 19 12.5 12.5 25 0

Tüplere 5’er µl standart ve örnek eklendikten sonra 125 mikrolitre (µl) reaktif A ve 2.5 µl reaktif S’nin karıştırılmasıyla oluşturulan karışımdan 125’er µl eklendi. Daha sonra üzerine 1’er ml reaktif B eklendi ve 15 dakika inkübe edildi. Süre bitiminde sırasıyla BSA standartları, örneklerin içinde liziz edildiği Ripa tamponu ve örnekler spektrofotometrede 750 nanometre (nm) dalga boyunda okutuldu. Protein miktarları matematiksel olarak hesaplandıktan sonra örnekler hazırlandı. Bunun için %10 oranında beta-merkaptoethanol eklenen 5X örnek tamponu lizatlar ile karıştırılarak 1X’e indirgendi. Örnekler kaynar suda kaynatılarak proteinler denatüre edildi, daha sonra kullanılmak üzere -80oC’ye kaldırıldı. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis/sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) sırasında yüklenmek istenen protein konsantrasyonuna bağlı olarak farklı miktarda örnekler bu karışımdan alınarak jele yüklendi.

3.5.3.2. SDS-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)

PRDX6 proteini 25 kDa, FKBP52 proteini ise 52 kDa olduğu için her iki proteinin de tespitini sağlayacak olan %12’lik ayırıcı poliakrilamid jel hazırlandı. Ayırıcı jel için kullanılan solüsyonlar ve oranları aşağıdaki gibiydi:

Hazırlanan jel 1 mm aralıklı iki cam plaka arasına döküldükten sonra 20 dakika boyunca donması beklendi ve toplayıcı poliakrilamid jel hazırlandı. Bunun için kullanılan solüsyonlar ve oranları aşağıdaki gibiydi:

Hazırlanan toplayıcı jel, ayırıcı jel üzerine konan taraklar üzerine döküldü. Jelin donması için 20 dakika beklendikten sonra taraklar çıkarılarak jeller tanka yerleştirildi ve üzeri elektroforez/yürütme solüsyonu ile dolduruldu. Markır (Precision Plus Protein Dual Color Standarts, BioRad cat#161-0374) ve mikrolitresinde 20 mikrogram (µg) protein olacak şekilde örnekler jellere yüklendi. 20 dakika boyunca 70 volt sonraki 90 dakika boyunca 100 volt gücünde elektroforeze tabi tutuldu. Elektroforez sonrası jeller, camların arasından ayrılarak transfer/blotlama solüsyonuna alındı. Bu tampona ayrıca filtre kağıtları ve nitroselüloz membranlar da kondu. Yarı kuru (semi-dry) blotlama tankı (Trans Blot SD Cell, Biorad) üzerine 7x10cm boyutlarında kesilmiş 3 adet filtre kağıdı (Hybond blotting paper, Amersham Biosciences, cat#RPN6101M), 6x9 cm boyutlarında kesilmiş 1 adet nitroselüloz membran (Hybond ECL, Amersham Biosciences, cat#RPN203D), jel ve 3 adet filtre kağıdı sırayla dizildi. Konulan membran sayısına bağlı olarak uygulanacak amper gücü hesaplandı ve jeldeki proteinlerin membrana transferi sağlandı. Hesaplamada, her membranın altındaki ve üstündeki filtre kağıdı sayısı ve filtre kağıdı alanının çarpılması sonucu elde edilen değerdeki amper gücünün 30 dakika boyunca uygulanması baz alındı. Transfer sonrasında membranlar çıkartılıp TBS-T içerisinde yıkandı, ardından %5’lik süt tozu (BioRad, cat#170-6404) içerisinde oda ısısında 1 saat bloklandı. Bloklamadan sonra süt tozu içerisinde 1:1500 dilüsyonda hazırlanan tavşan poliklonal anti-PRDX6 (LF-PA0011; Ab Frontier) antikoru veya 1:1000 dilüsyonda hazırlanan fare monoklonal anti-FKBP52 (Dr. David F.Smith’in

H2O 4.3 ml 1.5M Tris-HCl (pH 8.8) 2.5 ml %40 Akrilamit/Bis-Akrilamit 3 ml %10 SDS 100 µl %25 APS 40 µl TEMED 4 µl H2O 2.86 ml 1.5M Tris-HCl (pH 6.8) 0.5 ml %40 Akrilamit/Bis-Akrilamit 0.5 ml %10 SDS 40 µl %25 APS 16 µl TEMED 4 µl

laboratuvarından alınmıştır) antikoru ile gece boyu +4oC’de soğuk odada sallayıcı cihaz üzerinde inkübe edildi. Ertesi sabah membranlar TBS-T içerisinde 3 kere 10’ar dakika yıkandı ve sonrasında membranlar PRDX6 için %5’lik süt tozu içerisinde 1:5000 oranında hazırlanan peroksidaz konjüge eşşek anti-tavşan sekonder antikoru (Jackson Immunoresearch, cat#711-035-152) veya FKBP52 için %5’lik süt tozu içerisinde 1:5000 oranında hazırlanan peroksidaz konjüge keçi anti-fare sekonder antikoru (Jackson Immunoresearch, cat#115-035-174 ile oda ısısında 1 saat inkübe edildi. Membranlar

TBS-T ile 3 kere 5’er dakika yıkandıktan sonra ECL (Enhanced

Chemiluminisent/Kemiluminisans) (GE Health Care, Amersham, RPN 2106) ile 5 dakika muamele edildi. Sonrasında membranlar karanlık odada fotoğraf filmine (Scientific Imaging Film, Kodak, cat#1788207) ekspoze edildikten sonra film geliştirme makinesinde geliştirildi. Membranlar, TBS-T içerisinde yıkandıktan sonra membrana proteinlerin eşit yüklenip yüklenmediğini belirlemek amacıyla aktin uygulaması için membranlara stripping (soyma) işlemi yapıldı. Bunun için membranlar hazırlanan stripping solüsyonu ile 50oC’lik su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edildi. Ardından membranlar 3 kere 10 dakika TBS-T ile yıkandıktan sonra 1 saat boyunca %5’lik süt tozu ile bloklandı ve %5’lik süt tozu içerisinde 1:500 oranında hazırlanan aktin (keçi poliklonal anti-aktin (sc-1615; Santa Cruz Biotechnology) ile +4oC’de soğuk odada sallayıcı cihaz üzerinde gece boyu inkübe edildi. Ertesi sabah TBS-T ile yıkanan membranlar %5’lik süt tozu içerisinde 1:5000 oranında hazırlanan peroksidaz konjüge eşşek anti-keçi sekonder antikoru (Jackson Immunoresearch, 705-035-147) ile oda ısısında 1 saat inkübe edildi. Daha sonra TBS-T ile yıkama, ECL ile muamele ve film geliştirme aşamaları gerçekleştirildi. Membranlar tarayıcıda tarandıktan sonra Image J analiz programı (NIH) ile bantlardaki protein miktarı analiz edildi ve elde edilen değerler aktin bantlarından elde edilen değerlere oranlandı.

Western Blot Đçin Kullanılan Solüsyonlar

Ripa (Radio-ImmunoPrecipitation Assay) Tamponu 150 mM NaCl

%1 NP4O

%0.5 Sodyum deoksikolat (C24H39NaO4)

%0.1 Sodyum dodesil sülfat (SDS) 50 mM Tris (pH 8) 5X Örnek Tamponu 12.5 ml 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 20 ml %10 SDS 10 ml Gliserol 2.5 ml ddH2O

20 mg brom fenol mavisi (brom phenol blue-BPB)

1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)