Kondisyonel Knock-out (KO) Fare Model

Geliştirilen yeni teknolojiler sayesinde kondisyonel knock-out ya da dokuya spesifik gen hedeflemesi mümkün olmuştur. Klasik knock-out teknolojisinin hedefi her iki aleli de silmek böylece geni tüm hücrelerde tamamen ortadan kaldırmaktır. Buna karşın kondisyonel knock-out teknolojisinde amaç geni belli bir organ, hücre tipi ya da gelişim safhasında silmektir. Kondisyonel knock-out fareler klasik knock-out farelere göre hem daha uzun yaşarlar hem de kondisyonel knockout metotları daha hassastır. Farklı kondisyonel knockout model yapma teknikleri olmasına karşın en çok kullanılan yöntem Cre-loxP rekombinaz sistemidir. Cre-rekombinaz, loxP olarak adlandırılan iki hedef sekans arasındaki geni makas gibi kesen bir enzimdir. Bu enzim sadece belli hücre tiplerinde eksprese edildiğinden hedef gen sadece bu hücrelerden silinecektir (91). 2.9. FKBP52 Molekülünün Yapısı ve Görevleri

Ovaryan steroid hormonlar olan E2 ve P4 embriyo implantasyonu öncesi uterusun

reseptif hale gelmesinde önemli rollere sahiptirler. FKBP52, steroid hormonların hedef dokularda etkilerini gösterebilmeleri için nükleer reseptörlerin koşaperonu olarak görev yapar.

FKBP12 ile kompleks oluşturup kalsinörin fosfataz aktivitesini inhibe ederek T hücresi sinyal transdüksiyon kaskadını ve interlökin-2 transkripsiyonunu bloke eden makrolid ilaç FK506’ya bağlanan 52 kDaluk protein FKBP52 (FKBP4 olarak da adlandırılır) ilk kez Faber ve arkadaşları tarafından değişmemiş PR kompleksinin bir parçası olarak keşfedilmiştir (92). Ligand olmadığında steroid reseptörler sitoplazma ve/ya nükleusta şaperon ve koşaperon proteinleri ile birlikte bulunur. Bu proteinlere heat-shock protein 90/ısı şoku proteini 90 (Hsp90), Hsp70, 23-kDaluk koşaperon (p23) ve immünofilinler olarak adlandırılan Hsp90’a bağlanan tetratrikopeptit tekrar (TPR) domeyni içeren protein ailesi örnek olarak verilebilir (93). FKBP52, steroid hormon reseptör (SHR) aktivitesini değiştiren bir Hsp90 koşaperonudur. Hsp90 protein katlanması, tümör baskılanması ve hücre sinyalinde rol alan moleküler şaperondur. Steroid hormon reseptörleri liganda bağlanabilmek için gerekli konformasyona ulaşabilmek için Hsp90 ile ilişki kurmak zorundadırlar.

FKBP52, glukokortikoid reseptör (GR) (94), progesteron reseptör (PR) (95) ve androjen reseptör (AR) (96) için pozitif düzenleyici olarak rol almasına karşın östrojen reseptör (ER) ya da mineralokortikoid reseptör (MR) için böyle bir rolü yoktur (94). FKBP52’nin reseptör-şaperon kompleksleri ile işbirliği reseptör-hormon bağlanmasının artmasını sağlar (94), (97), (98) ayrıca hücre içinde reseptör lokalizasyonunu etkiler (99).

FKBP52 bir immünofilindir. Đmmünofilinler, belli immün baskılayıcı ilaçların etkilerine aracılık ettikleri için bu şekilde isimlendirilmişlerdir. Đmmünofilinler 2 aileye ayrılırlar: FK506ya bağlanan proteinler olan FKBPler ve siklosporin A’ya bağlanan proteinler olan siklofilinler (CyP). FKBP ve CyP tipik olarak peptidil prolil izomeraz (PPIaz) aktivitesi gösterirler ve bu PPIaz domeyni ayrıca ilaç bağlanma bölgesini oluşturur (100). Peptidil prolil izomeraz aktivitesi prolin aminoasitini içeren peptit bağlarının cis-trans izomerizasyonunu katalize eder. Tüm proteinlerin değil ancak birçok proteinin düzgün katlanması için gereklidir. FKBP ve CyP ailelerinin bazı üyeleri tetratrikopeptit tekrarı (TPR) domeyni içerirler bu da oldukça korunmuş olan Hsp 90’ın

C terminal ucuna bağlanır ve Hsp90 ile birlikte koşaperon olarak davranırlar. FKBP52 ve ilişkili immünofilinler olan FKBP51 ve Cyp40 korunmuş TPR domeynleri nedeniyle başlangıçta Hsp90’a bağlanan proteinler olarak tanımlanmışlardır (101).

Başlıca FKBP fonksiyonel domeynleri FKBP12-benzeri domeynler 1 ve 2 (FK1 ve FK2) ve tetratrikopeptid tekrarı (TPR)’dır. FK1 domeyni, immün baskılayıcı ilaç FK506’ya bağlanmayı kolaylaştırır, PPIaz aktivitesine sahiptir (102) ve SHR’nin primer düzenleyici domeynidir (94). Protein katlanmasında hız sınırlayıcı basamak PPIaz aktivitesi FK506’nın bağlanmasıyla inhibe edilir (103). PPIaz domeyni Hsp90’a C- terminal tetratrikopeptid tekrar (TPR) domeyni ile bağlanır (102). FK1 domeyni ayrıca prolinden zengin bölge içerir; bu bölgenin de etkileşim yüzeyi olarak rol aldığı düşünülmektedir. Bu domeyn reseptör düzenlenmesi için önemlidir ve FKBP52’nin farklı fonksiyonlarından büyük ölçüde sorumludur. Şekil 2.7’de reseptör, Hsp90 ve FKBP52 arasındaki tahmin edilen etkileşimler görülmektedir. FKBP52’nin Hsp90 üzerindeki C-terminal EEVD motifi ile TPR domeyni aracılığıyla etkileştiği bilinmektedir. Reseptörün FKBP52 tarafından düzenlenmesi reseptörün LBD’sine lokalizedir. Bu, Hsp90’ın FKBP52 FK1 domeynini LBD’ye yakınlaştırdığı ve prolinden zengin bölgenin reseptör ile etkileştiğini ya da en azından geçici olarak temas ettiğini düşündürmektedir.

Şekil 2.7. FKBP52, Hsp90 ve reseptör arasındaki bilinen (düz ok) ve tahmin edilen (çizgili ok)

etkileşimler görülmektedir. Geldanamisin: Hsp90’a bağlanarak fonksiyonunu inhibe eden antibiyotik (104).

FK1, FK2 domeynine FK bağlayıcı aracılığıyla bağlıdır. FK2, FK1’e benzemesine karşın PPIaz aktivitesi yoktur ve FK506’ya bağlanmaz. FK bağlayıcı, kazein kinaz 2 fosforilasyon bölgesi içerir ve fosforillendiğinde FKBP52 fonksiyonunu ortadan kaldırır (104)(Şekil 2.8).

Şekil 2.8. FKBP52’nin X-ışını kristalografik yapısı (104).

Steroid reseptör/şaperon komplekslerinin bir araya gelmesinde çeşitli Hspler ve koşaperonlar rol alır. Özellikle PR için; bu reseptör sitoplazmada öncelikle Hsp40 ve Hsp70’e bağlanır. Daha sonra Hsp70-Hsp90 organizing protein (Hop)-Hsp90 Hsp70’e bağlanır (105). Hsp70 ve Hop daha sonra bu aracı PR kompleksinden ayrılır, p23 reseptöre bağlı Hsp90’a bağlanır. Hsp90 ve p23’lü PR kompleksi koşaperonlardan birini [FKBP51, FKBP52, CyP40, ya da protein fosfataz 5 (PP5)] Hsp90 bağlanma bölgesine toplar (105) (Şekil 2.9).

Şekil 2.9. Steroid reseptör/şaperon komplekslerinin bir araya gelmesinde rol alan Hsp ve

koşaperonlar. 40: Hsp40, 70: Hsp70, 90: Hsp90, 23: p23, ATP: adenozin trifosfat, ADP: adenozin difosfat (105).

Reseptörün P4’e yüksek afinite ve etkinlikle bağlanabilmesi için Hsp90’ı içeren

olgun kompleks korunmalıdır. Yapılan çalışmalarda her steroid hormon nükleer reseptör (GR, ER ve PR)-Hsp 90 kompleksinin spesifik immünofilinler ile tercihe bağlı bağlanma gösterdiği gösterilmiştir (106). PR için; eğer bu kompleks FKBP52’ye bağlanırsa P4 ligandına optimum bağlanabilir. Ancak FKBP52’nin reseptör-hormon

Şekil 2.10. Reseptör olgunlaşması ve hormon bağlanmasında FKBP52’nin rolü.FKBP52’nin Hsp90

dimeri ile ilişkisi p23 koşaperonu tarafından stabilize edilir. FK1 domeyni reseptörün ligand bağlanma domeyni ile etkileşime geçer (107).

FKBP52, PR aktivitesini etkin hale getirmesine karşın verimli olmayan bazal PR aktivitesi FKBP52 olmadan da gerçekleşir. Hormon bağlanması reseptör-şaperon heterokompleksinin bozulmasına neden olur ve reseptör aktif hale gelerek transkripsiyon faktörü olarak davranır. Hormon bağlanmasından sonra heterokompleks ayrılmasının gerçekleştiği bilinmesine rağmen kompleksin nükleer taşınım sırasında mı yoksa nükleusta mı ayrıldığı bilinmemektedir. Nükleusta PR homodimerler oluşturup transkripsiyon faktörü gibi davranır ve DNA elementlerine bağlanarak gen transkripsiyonunu aktive eder ya da diğer transkripsiyon faktörleri ile etkileşerek transkripsiyonu inhibe eder.