Fkbp52-/ ve Pgr-/ Fare Uteruslarında Vahşi Tip Uterusa Oranla Ekspresyonu Artan ve Azalan Proteinler

FKBP52’nin PR’den bağımsız rolleri olup olmadığını belirlemek için overektomize edildikten iki hafta sonra P4 enjekte edilen C57BL6/129 genetik zeminli

VT, Pgr-/- ve Fkbp52-/- farelerin uteruslarında 2 Boyutlu Ayrım Jel Elektroforezi ve ardından kütle spektrometrisi (MS) uygulandı, proteom profilleri karşılaştırıldı. Jel elektroforezi sonucunda izoelektrik noktaları pH 4 ile pH 7 arasında olan ve molekül ağırlıkları 10 ile 150 kDa arasında değişen proteinler saptanabildi (Şekil 4.1). Kütle spektrometresi ile aşağıdaki sonuçlar elde edildi.

Şekil 4.1. VT ve Fkbp52-/- fare uteruslarından elde edilen protein ekstraktlarının temsili 2-BAJE

fotoğrafı. Đzoelektrik noktası pH 4 ile 7; moleküler ağırlık 10 ile 150 kDa arasında. a, FKBP52’yi b, PRDX6’yı göstermekte.

Üç genotipe ait tüm örnekler arasında 100 protein istatistiksel olarak önemli derecede değişmişti (p<0.01). En büyük farklılık (PC1 = 63.5) Pgr-/- örnekler ile diğer örnekler arasında, ikinci en büyük farklılık ise (PC2 = 24.4) VT örnekler ile Fkbp52-/- örnekler arasında bulundu.

4.1.1. Fkbp52-/- ve Pgr-/- Fare Uteruslarında Ekspresyonu Artan Proteinler

FKBP52-PR sinyali aracılığıyla çalışan P4 tarafından upregüle

edilen/ekspresyonu artan proteinlerin Adenozin kinaz ve Osteoglisin olduğu bulundu (Çizelge 4.1). Adenozin kinaz, ATP’den adenozine fosfat transferini sağlayan bir adenozin kinaz olup anti-inflamatuvar etkilere sahiptir (210). Osteoglisin, lösince zengin tekrarlar içeren küçük bir proteoglikandır (211).

Çizelge 4.1. PR/FKBP52 sinyali aracılı P4 tarafından upregüle edilen proteinler. Swiss-Prot

veritabanındaki erişim numaraları kullanılmıştır. Kilodalton (kDa) cinsinden moleküler ağırlık (MA) ve izoelektrik noktası (pl) veri tabanı girişlerinden hesaplanmıştır. Ortalama hacim oranları (Oh) ve Student’s t-testi ve ANOVA’nın p değerleri DeCyder versiyon 6.5 yazılımı ile hesaplanmıştır.

4.1.2. Fkbp52-/- ve Pgr-/- Fare Uteruslarında Ekspresyonu Azalan Proteinler

FKBP52-PR sinyali aracılığıyla çalışan P4 tarafından downregüle

edilen/ekspresyonu azalan proteinler olarak Vakuolar ATP Sentaz altbirimi B ve Galektin-1 saptandı (Çizelge 4.2.). Vakuolar ATP Sentaz altbirimi B, vakuolar ATPaz’ın periferal kompleksinin non-katalitik altbirimidir. ATPazlar, membrandan protonların taşınımını ile ATP sentezi ve/ya hidrolizini birleştiren membran bağlı enzim kompleksleridir (212). Galektin-1, hücre-hücre ve hücre-matriks etkileşimlerinin düzenlenmesinde rol oynayan beta-galatozidlere bağlanan bir proteindir (213).

Çizelge 4.2. PR/FKBP52 sinyali aracılı P4 tarafından downregüle edilen proteinler. Swiss-Prot

veritabanındaki erişim numaraları kullanılmıştır. Kilodalton (kDa) cinsinden moleküler ağırlık (MA) ve izoelektrik noktası (pl) veri tabanı girişlerinden hesaplanmıştır. Ortalama hacim oranları (Oh) ve Student’s t-testi ve ANOVA’nın p değerleri DeCyder versiyon 6.5 yazılımı ile hesaplanmıştır.

4.1.3. Fkbp52-/- Fare Uterusunda Ekspresyonu Artan Proteinler

Bazı proteinlerin ise P4-PR sinyaline bağlı olmadan FKBP52 varlığına bağlı

olarak farklı şekilde eksprese edildiği gözlendi. Fkbp52-/- fare uterusunda VT fare

uterusuna oranla bazı proteinler PR’den bağımsız olarak upregüle edilmişti. Bu proteinler, Vimentin, Desmin, Aldehid Dehidrogenaz Mitokondriyel Öncü, Ökaryotik Başlama Faktörü 4A-1, Yüklü Multiveziküler Gövde Proteini 2, Indoletilamin N- metiltransferaz idi (Çizelge 4.3.). Bu proteinler için VT ile Pgr-/- fare uterusları arasında fark yoktu. Vimentin, organellerin sitoplazmada pozisyonlarının belirlenmesinde rol alan tip 3 ara filamandır. Dolayısıyla hücre bütünlüğünün sağlanmasından sorumlu hücre iskeleti elemanıdır (214). Desmin, sarkomerlerde Z bandı yakınında bulunan tip 3 ara

filamandır (215). Aldehid Dehidrogenaz Mitokondriyel Öncü, alkol türevli asetaldehitlerin detoksifikasyonunda rol alan bir proteindir. Kortikosteroid, biyojenik amin, nörotransmiter ve lipit peroksidasyon metabolizmasında rol alırlar (216). Ökaryotik Başlama Faktörü 4A-1, ökaryotik translasyonun başlama fazında rol alan bir proteindir (217). Yüklü Multiveziküler Gövde Proteini 2, transmembran proteinlerin degradasyon için lizozom lümenine taşınmasına aracılık eden multiveziküler cisimlerin oluşmasında rol alan ESCRT-II kompleksinin bileşenidir (218). Indoletilamin N- metiltransferaz ise triptamin ve yapıca ilişkili bileşenlerin N-metilasyonunu sağlayan bir enzimdir (219).

Çizelge 4.3. Fkbp52-/- fare uterusunda PR’den bağımsız olarak upregüle olan proteinler. Swiss-Prot

veritabanındaki erişim numaraları kullanılmıştır. Kilodalton (kDa) cinsinden moleküler ağırlık (MA) ve izoelektrik noktası (pl) veri tabanı girişlerinden hesaplanmıştır. Ortalama hacim oranları (Oh) ve Student’s t-testi ve ANOVA’nın p değerleri DeCyder versiyon 6.5 yazılımı ile hesaplanmıştır.

4.1.4. Fkbp52-/- Fare Uterusunda Ekspresyonu Azalan Proteinler

Đlginç bir şekilde sadece Peroksiredoksin6 (PRDX6) proteininin Fkbp52-/- fare uterusunda PR’den bağımsız olarak anlamlı ölçüde (p=0.000043) downregüle olduğu gözlendi (Çizelge 4.4). FKBP52, Fkbp52-/- fare uterusunda saptanamamış, VT ve Pgr-/- fare uteruslarında ise değişmemişti, bu da sonuçların güvenirliliğini ortaya koydu (Şekil 4.2).

Çizelge 4.4. Fkbp52-/- fare uterusunda PR’den bağımsız olarak downregüle olan proteinler.

Swiss-Prot veritabanındaki erişim numaraları kullanılmıştır. Kilodalton (kDa) cinsinden

moleküler ağırlık (MA) ve izoelektrik noktası (pl) veri tabanı girişlerinden

hesaplanmıştır. Ortalama hacim oranları (Oh) ve Student’s t-testi ve ANOVA’nın p değerleri DeCyder versiyon 6.5 yazılımı ile hesaplanmıştır.

Şekil 4.2. Overektomize edildikten sonra P4 uygulanan C57BL6/129 genetik zeminli Fkbp52-/-

farelere ait uteruslardaki (n=4) PRDX6 protein düzeyleri VT (n=3) ve Pgr-/- (n=3) farelerin uterusundakilere oranla azalmıştı. FKBP52, Fkbp52/- fare uterusunda saptanamamış, VT ve Pgr-/- fare uteruslarında ise değişmemişti. *p < 0.05. FKBP52 ve PRDX6 protein düzeyleri GAPDH protein düzeylerine oranlanmıştır.

Đki boyutlu jel elektroforezi ve ardından yapılan kütle spektrometresi analizleri sonucunda Fkbp52-/- fare uterusunda istatistiksel olarak downregüle olan tek proteinin PRDX6 olduğunu göstermemiz FKBP52’nin uterusta PR koşaperon fonksiyonundan bağımsız olarak PRDX6 aracılığıyla gerçekleştirdiği bir başka rolü daha olduğunu ortaya koymuştur. Ancak elde edilen bu bulgunun Western Blot ve Đmmünohistokimya yöntemleri ile de doğrulanması gerekliydi. Bunun için C57BL6/129 genetik zeminli VT,

Pgr-/- ve Fkbp52-/- fareler overektomize edildi, iki hafta süreyle dinlendirildikten sonra

2 gün boyunca tek doz intraperitonal P4 (2mg/0.1ml) enjekte edildi, 24 saat sonra

sakrifiye edilerek uterusları toplandı. Üç adet VT, 3 adet Fkbp52-/- ve 2 adet Pgr-/- fareye ait uterusta Western Blot ve Đmmünohistokimya yöntemleri uygulandı.

4.2.Fkbp52-/- Fare Uterusunda Ekspresyonu Azalan PRDX6’nın Western Blot