Northern Blot Yöntem

Northern Blot (NB) yönteminde de Đn Situ Hibridizasyon (ĐSH) yönteminde olduğu gibi öncelikle kullanılacak problar sentezlendi. Prob sentezlenmesi 3.5.4.1.Đn Situ Hibridizasyon Đçin Prob Hazırlanması bölümünde anlatıldığı gibi olup sadece son basamağı farklıydı. ĐSH yöntemi için 35S ile işaretlenen problar NB yöntemi için 32P ile işaretlendi. Prdx6, Indian hedge hog (Ihh) ve Hoxa10 için 32P ile işaretli cRNA probları hazırlandı.

Northern Blot yöntemi, dokudan izole edilen mRNA miktarını ölçmeye yarayan bir yöntemdir. Bu yöntem, parakuat enjekte edilen CD1 VT ve Fkbp52-/- fare uterusundaki Indian hedge hog (Ihh) ve Hoxa10 mRNA miktarını ölçmek için kullanıldı. Bunun için gebeliklerinin 3. gününde olan CD1 genetik zeminli VT fareler ile gebeliğin 2-4. günlerinde P4 enjeksiyonu yapılan Fkbp52-/- farelere saat 1800’da 2mg/kg parakuat

enjekte edildi. Kontrol grubunda yer alan VT ve Fkbp52-/- farelere ise herhangi bir enjeksiyon yapılmadı. Ertesi gün yani gebeliğin 4. gününde fareler sakrifiye edilip uterusları toplandı. Farklı farelerden elde edilen 2 ya da 3’er uterus örneğine Ihh ve

Hoxa10 için NB uygulandı. Ayrıca gebeliğin 4. gününde bulunan C57BL6/129 genetik

zeminli VT ve Fkbp52-/- üçer farklı fareye ait karaciğer ve uteruslar ile CD1 genetik zeminli VT ve Fkbp52-/- farelere ait uteruslarda Prdx6 mRNA düzeyini belirlemek için de bu yöntem kullanıldı. Northern Blot ayrıca 3.5.8. Progesteron (P4) ve Östrojen (E2)

Uygulaması bölümünde anlatılan fare modellerinde Prdx6 mRNA düzeyini belirlemek için kullanıldı.

Northern Blot yöntemi şu şekilde gerçekleştirildi: öncelikle dokulardan mRNA izolasyonu yapıldı. Bunun için cam tüpler içerisine konan dokuların üzerine yaklaşık 1 ml trizol (Invitrogen, cat#15596-018) eklendi. Dokular sonikatörde homojenize edildi, tüplerin ağzı parafilm ile kapatılarak oda ısısında 5 dakika beklendi. Sıvı kısım 1.7 ml’lik plastik tüplere aktarılarak üzerine 200 µl kloroform (Sigma Aldrich, cat#319988) eklendi, örnekler vortekslendi ve 15 dakika boyunca +4oC’de maksimum hızda santrifüjde döndürüldü. Süpernatan kısmı (şeffaf katman, beyaz ve pembe katmanlar alınmaz) yeni plastik tüplere aktarıldı. Üstlerine 500 µl izopropanol (2-izopropanol) eklendi, vortekslendi, oda ısısında 10 dakika inkübe edildi. 10 dakika boyunca +4oC’de maksimum hızda santrifüjde döndürüldü. Süpernatan atılarak peletlerin üzerine 750 µl %75 etanol ilave edildi, vortekslendi. 5 dakika boyunca +4oC’de maksimum hızda santrifüjde döndürüldü, süpernatan atıldı. Tüplerin ağzı açık bırakılarak peletin 5 dakika boyunca kuruması sağlandı. 30 ya da 50 µl steril ddH2O tüplere eklendi, vortekslendi.

Örnekleri resüspanse etmek zor olduğundan 65oC’lik ısıtıcıda 10 dakika boyunca tutuldular. mRNA konsantrasyonunu ölçmek için örnekler steril ddH2O ile 1:200

oranında dilüye edildi. Örnekler spektrofotometrede okutularak konsantrasyonları mg/ml cinsinden belirlendi.

Northern Blot yönteminde Western Blot yönteminde olduğu gibi öncelikle jel hazırlandı. Western Blot yönteminden farklı olarak jeller dikey olarak değil yatay olarak hazırlandı ve yüklendi. Yürütme solüsyonu için 165ml formaldehit ile 50 ml 3-(N- morfolino) propansülfonik asit (MOPS) karıştırıldı ve son hacim 500 ml olana dek ddH20 eklendi. Bu karışımın 60 ml’si sonraki basamaklar için saklanırken kalan 440

ml’ye 440 ml ddH20 eklenerek toplam hacim 880 ml’ye tamamlandı. 60 ml ddH20 ile

karışım ilave edildi (%0.7 agaroz jel) ve elde edilen karışım yatay düzlemdeki 4 ayrı cam set üzerine döküldü, taraklar yerleştirildi ve donması için 20 dakika boyunca beklendi. 11 µl ddH2O içerisinde 20 µg mRNA olacak şekilde örnekler hazırlandı.

Đçinde 11 µl örnek bulunan tüplere 29 µl örnek tamponu eklendi ve tüpler 65oC’lik ısıtıcıda 5 dakika boyunca tutuldu. Tüplere 5 µl mRNA yükleme boyası eklendi.

Örnekler, jele yüklenmeden önce taraklar çıkarıldı ve metal çubuk yardımıyla Northern Blot setinin içine kondu, üzerine yürütme solüsyonu kondu. Üç jele 13’er µl, kalan jele de 3’er µl olacak şekilde örnekler yüklendi ve 70 voltta 15 dakika boyunca yürütülerek örneklerin jele girmesi sağlandı. Süre sonunda karıştırıcının hızı 5’e ayarlandı böylece tamponun eşit dağılması ve pH’nın aynı kalması sağlandı. Bu şekilde örnekler yaklaşık 2 saat daha yürütüldü. Jel yürürken mRNA kalitesini görebilmek amacıyla artan örnek %1’lik agaroz jelde yürütüldü. Yürütme sonunda 4.8 kb’lik 28sRNA ve 1.9 kb’lik 18sRNA’ya ait 2 bantın görülmesi mRNA’nın iyi kalitede olduğunu gösterdi. Uygulanabilecek bir diğer yöntem de fosfat tamponu içinde konsantrasyonu 30 µg/ml olacak şekilde hazırlanan akridin orange boyasında jellerden birinin 3-5 dakika boyanmasıdır. Jel, ddH2O ile 2 saat ve gece boyunca yıkandıktan

sonra UV ışığı altında incelenerek mRNA kalitesi saptanır.

Elektroforez bitiminde sodyum fosfat tamponu hazırlandı. Jeller bu tampon ile dolu kaplara konarak orbital çalkalayıcı üzerinde 20 dakika boyunca yıkandı. Süre bitiminde tampon değiştirilerek 20 dakika daha yıkandı. 8.5X5.5 cm boyutlarında kalın ve ince filtre kağıtları ile 7.8X5cm boyutlarında por boyutu 0.2 µl olan nitroselüloz membranlar (Whatman Inc, cat#10416096) kesildi. Membranlar 20 dakika boyunca ddH2O içinde tutuldu, süre bitiminde 20 dakika boyunca 20XSSC içinde tutuldu. Jellerin

üzerine konulacağı sandviç hazırlandı. Bunun için, 3 filtre kağıdı 20XSSC içinde ıslatıldı, bunlar plastik bir kap içinde üst üste konurken cam baget ile üstlerinden geçilerek hava kabarcıklarının çıkması sağlandı. Kalın kağıtların üzerine 20XSSC içinde ıslatılmış 1 adet ince kağıt kondu, hava kabarcıkları çıkarıldı. Kağıtların üzerine jel, jelin üzerine de nitroselüloz membran kondu. Membranın üzerine kuru kağıtlar kondu. Kabın içerisine jel hizasına kadar 20XSSC kondu, üstteki kağıtların ıslanmamasına özen gösterildi. En üste su ile dolu erlen konularak ağırlık yapması sağlandı, gece boyu beklendi.

Ertesi gün UV ışığı altında incelenen akridin orange boyamasına yani RNA kalitesine bağlı olarak hibridizasyona devam edilip edilmeyeceğine karar verildi. Nitroselüloz membran sandviçten çıkarılarak üzerine örnek adları ve kullanılacak probun adı yazıldı. Membranlar UV Crosslinker’a konarak mRNA stabilizasyonu sağlandı.

Hibridizasyon öncesi prob ile muamele edilecek membran sayısına göre 1. solüsyon hazırlandı. Bir membran için 15 ml 20XSET, 1 ml %10SDS, 100 ml’ye kadar ddH2O eklendi. 68oC’lik sıcak su banyosunda 10 dakika tutuldu. Plastik poşetlerin içine

konan her bir membran için 20’şer ml 1. solüsyondan kondu, poşetlerin ağzı sıcak mühür (sealer) aracılığıyla kapatıldı ve 30 dakika boyunca 68oC’lik sıcak su banyosunda tutuldu. Bu esnada arta kalan 1. solüsyonun hacmine bağlı olarak içine yeni kimyasallar eklenerek 2. solüsyon oluşturuldu. Örneğin 400 ml 1. solüsyon kaldıysa 0.8 gr Fikol, 0.8 gr PVP, 0.8 gr BSA eklendi. Süre bitiminde 1. solüsyon uzaklaştırılarak 2. solüsyondan her poşet için 45’er ml eklendi ve 2 saat boyunca 68oC’lik sıcak su banyosunda tutuldu.

2. solüsyonun arta kalanı 68oC’lik sıcak su banyosunda tutuldu. Artan 2. solüsyonun miktarına göre 3. solüsyon hazırlandı. Örneğin 90 ml solüsyon arttıysa 450 µl 50 mg/ml tRNA (alkalin tamponu içinde) eklendi. Plastik poşetlere 20 ml 3. solüsyondan eklenerek 2 saat boyunca 68oC’lik sıcak su banyosunda tutuldu. Bu esnada hibridizasyon solüsyonu hazırlandı. Arta kalan 3.solüsyonun miktarına bağlı olarak dekstran sülfat ve 1M fosfat tamponu (Na2PO4) eklendi. Örneğin 3. solüsyondan 30 ml artmış ise 3 gr

dekstran sülfat ve 600 µl 1M Na2PO4 eklendi ve 68oC’de çözünmeye bırakıldı. Bu

karışıma radyoaktif fosfor işaretli (32P) prob ilave edildi. Gece boyunca 68oC’lik sıcak su banyosunda tutuldu. Ertesi gün içinde hibridizasyon solüsyonu bulunan plastik poşete 100 ml I. yıkama solüsyonu konduktan sonra tüm içerik radyoaktif atığa atıldı ve 100 ml yıkama solüsyonu ilave edildi, 68oC’de 1 saat tutuldu. Bu esnada II. yıkama solüsyonu hazırlandı. Süre bitiminde I. yıkama solüsyonu uzaklaştırılarak II. yıkama solüsyonu kondu ve 1 saat boyunca 68oC’de tutuldu. Süre bitiminde membranlar plastik poşetlerden çıkarılarak kurutuldu ve film kasetleri içine yerleştirilerek kasetin ağzı kapatıldı. Kasetin üzerine membranın konduğu tarih yazıldı. Karanlık odada membranların üzerine fotoğraf filmi (Scientific Imaging Film, Kodak, cat#1788207) kondu ve kaset -80oC’ye kaldırıldı. Ertesi gün filmler geliştirme makinesinde geliştirildi. Yeterli sinyal alınamayan filmler için 24, 12 ya da 6 saat sonra tekrar geliştirme yapıldı. Bantlar elde edildikten sonraki aşama membranların strip edilerek (soyma) internal kontrol olan ribozomal protein L7 (Rpl7) ile hibridize edilmesiydi.

Soyma işleminde membranlar soyma solüsyonu içinde 6 dakika kaynatıldı. Açık havada kurutulan membranlar Rpl7 ile hibridize edildiler. 2-3 saat boyunca fotoğraf filmine ekspoze olan filmler geliştirildi. Membranlar tarayıcıda tarandıktan sonra bantlardaki mRNA miktarı Image J analiz programı (NIH) ile analiz edildi ve elde edilen değerler Rpl7 bantlarından elde edilen değerlere oranlandı.

Northern Blot Đçin Kullanılan Solüsyonlar Örnek tamponu

300 µl formamid

30 µl 3-(N-morfolino) propansülfonik asit (MOPS) tamponu 100 µl formaldehid karıştırılıp vortekslenir

RNA yükleme boyası %95 formamid %0.025 bromfenol mavisi %0.025 ksilen siyanol 5 mM EDTA (pH 8.0) %0.025 SDS -20oC’de saklanır.

Sodyum fosfat tamponu

10 ml 1M sodyum fosfat tamponu

I. yıkama solüsyonu