114
S22Genoma entegre olmayan RNA virüsü aracılığı ile sağlıklı ve osteopetrotik insan mezenkimal kök hücrelerinin feeder-free şartlarda yeniden programlanması
İnci Cevher1, İrem Akar Soycan1, Suray Pehlivanoğlu3, Betül Çelebi Saltık1, Emine Kılıç4, Duygu
Uçkan Çetinkaya1, Fatma Visal Okur1, Duygu Uçkan Çetinkaya2, Fatma Visal Okur2
1Hacettepe Üniversitesi Kök Hücre Araştırma ve Uygulama Merkezi, PediSTEM, Ankara, TÜRKİYE 2Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Pediatrik Hematoloji/ Kemik İliği Transplantasyon Ünitesi,
Ankara, TÜRKİYE
3Necmettin Erbakan Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Konya,
TÜRKİYE
4Hemosoft IT ve Eğitim Servisi Araştırma ve Geliştirme Bölümü, Ankara, TÜRKİYE
Amaç: Bu çalışmanın amacı sağlıklı donör ve nadir görülen çocukluk çağı kalıtsal hastalıklarından biri olan osteopetrozisli hasta kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden hasta/hastalığa özel UPKH’lerin üretilmesi, ileri araştırmalarda kullanılmak üzere bankalama prototipi oluşturulmasıdır. Yüksek yeniden programlama verimliliği ve güvenilirlik profili nedeni ile Sendai viral vektör-aracılı üretim tekniği kullanıldı.
Material ve Metot: Karaketrizasyonları yapılan kemik iliği kaynaklı donör ve hasta mezenkimal kök hücreleri (Kİ-MKH) Cytotune-IPS Sendai yeniden programlama kiti kullanılarak yeniden
programlandı. 6 kuyucuklu doku kültür kabındaki %80-85 konfluent insan MKH’leri SeV vektör (MOI:3) ile transdükte edildi. 7.günde hücreler matrigel kaplı 10 cm’lik doku kültür kabına aktarıldı ve günlük TeSR-E7 besiyeri ile medium değişimi yapıldı. 14.günden itibaren TeSR-E8 mediuma geçildi. Yaklaşık 21.günde gözlemlenmeye başlayan UPKH kolonileri manuel mikrodiseksiyon yöntemi ile seçildi. Hem hasta hem donör kaynaklı UPK hücre hatlarının karakterizasyonu için erken ve geç pasajlarda Alkalen fosfataz (AP), immünofloresan boyama (IF) ve akım sitometrik analizler (FACS) gerçekleştirildi. Ayrıca, üretilen UPKH’lerinden karyotip analizleri yapıldı. Pluripotans özelliklerini göstermek için yapılan embriyonik cisimcik geliştirme ve teratom deneyleri yapıldı. Bulgular: Hem hasta hem de donör Kİ-MKH kaynaklı UPK hücre kolonilerinin tipik insan embriyonik kök hücre koloni morfolojisine sahip olduğu gözlendi (yüksek nükleostaplazmik oran, sınırları belirgin kompakt koloniler). İmmünositokimya boyaması ile erken ve geç pasajlardaki hasta ve donör UPK hücrelerinin insan pluripotent kök hücre belirteçleri olan ALP, SSEA-4 ve TRA-1-81’i ifade ettiği gösterildi. Akım sitometrik analiz ile bu hücrelerin %85-95’ı SSEA-4 ve Oct3/4 yüzey belirteçlerini ifade ederken, CD29 açısından negatif bulundu. Karyotip analizi ile genomik olarak "stabil" oldukları gösterilen bu kolonilerin pluripotants özelliklerini göstermek için planlanmış olan embriyonik cisimcik oluşturma ve teratom geliştirme deneyleri ise halen devam etmektedir. Sonuç: Genoma entegre olmayan viral vektör kullanımına dayalı SeV üretim tekniği; yüksek verimliliği ve güvenilirliği yanında uygulama ve standardizasyonu kolay bir üretim tekniği olması nedeni ile hasta/hastalığa özgü UPKH üretimi ve bu hücrelerin kişiye özel hücresel tedaviler başta olmak üzere ileri araştırmalarda kullanımı amaçlı diğer genetik modifikasyon metotlarından daha avantajlı bir teknoloji gibi gözükmektedir.
Teşekkürler: Bu araştırmanın her aşamasında bilgi ve deneyimlerini paylaşan Dr. Jean J. Kim’e ve devam eden teknik destekleri için Baylor Tıp Fakültesi İnsan Kök Hücre Merkezi’ne teşekkür ederiz. *Bu çalışma Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK), 1003-öncelikli Alanlar Ar- Ge Projeleri Destekleme Programı, Proje No: 213S236, tarafından desteklenmektedir.
Anahtar Kelimeler: UPKH, SeV, Osteopetrozis, MKH, Yeniden Programlama
Reprogramming of human mesenchymal stem cells from healthy donors and patients with osteopetrosis with non-integrating RNA virus on feeder-free conditions
İnci Cevher1, İrem Akar Soycan1, Suray Pehlivanoğlu3, Betül Çelebi Saltık1, Emine Kılıç4, Duygu
Uçkan Çetinkaya1, Fatma Visal Okur1, Duygu Uçkan Çetinkaya2, Fatma Visal Okur2
1Hacettepe University Center for Stem Cell Research and Development, PediSTEM, Ankara, TURKEY 2Hacettepe University Faculty of Medicine Pediatric Hematology/Bone Marrow Transplantation Unit,
Ankara, TURKEY
3Necmettin Erbakan University, Faculty of Science, Department of Molecular Biology and Genetics,
Konya, TURKEY
115
Aim: Main purpose of this study is to generate human IPSCs from bone marrow-derived mesencyhmal stem cells of healthy donor and children with osteopetrosis (rare inheritable
childhood disease) and for developing a model for IPSC banking to store/supply ethically approved stem cells for medical research and new treatment. The Sendai virüs vector-based production technique was chosen due to its high reprogramming efficiency and safety profile.
Material and Methods: Bone marrow-derived donor and patient mesenchymal stem cells (BM- MSCs) were reprogrammed by using CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit. 80-85% confluent hMSCs in a 6-well plate were transduced with SeV vectors at an MOI of 3. Cells were replated on day 7 on matrigel-coated 10 cm dishes and fed with TeSR-E7 medium daily. The medium was switched to TeSR-E8 starting from day 14. IPS colonies which started to appear around day 21, were harvested with manual microdissection method. Alkaline phosphatase (AP), immunofluorescence (IF) staining and flowcytometry analysis were performed for characterization of both donor and patient-derived IPSC lines during early and late passages. Embryoid body and teratoma assays have been started in order to show pluripotency and karyotype analyses of generated lines were performed.
Results: Human embryoid stem cell colony morphology was observed in both donor and patient IPSC colonies (cells with increased nucleocytoplasmic ratio forming flat compact colonies with clear borders). By immunocytochemistry staining, it was shown on early and late passages that patient and donor IPSCs expressed human pluripotent stem cell markers such as ALP, SSEA-4 and TRA-1- 81. By flow cytometric analysis, almost 85-95% of the cells were found positive for SSEA-4 and Oct3/4 and negative for CD29. Embryoid body (EB) formation and teratoma assays that are done to assess in vitro and in vivo pluripotency are still in progress. Genomic stability of IPSC lines were evaluated which by karyotype analysis and found as normal.
Conclusion: Generation of human IPSC lines using SeV-based non-integrating viral vectors seems to have an advantage over other genetic modification methods, due to ease of application and standardization besides its high efficiency and reliability.
Acknowledgments: *We are thankful to Jean J. Kim, PhD (Director) for providing expertise and Human Stem Cell Core of Baylor College of Medicine for continous technical support. *This study is supported by The Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK), 1003-Primary Subjects R&D Funding Program, Project No: 213S236.
116
S23Fare fibroblast, fare akciğer kanseri ve fare embriyonik kök hücrelerinde flavopiridol ve geldanamisinin terapötik etkilerinin ve hücre döngüsü bileşenleri, apopitozis, hücre iskeleti ilişkili moleküllerin karşılaştırılması
Hüseyin Aktuğ1, Eda Açıkgöz2, Ayşegül Uysal1, Fatih Oltulu1, Gülperi Öktem1, Gürkan Yiğittürk1,
Kenan Demir1, Altuğ Yavaşoğlu1, Vildan Bozok Çetintaş3 1Ege Üniversitesi Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı, İzmir
2Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı, İzmir 3Ege Üniversitesi Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı, İzmir
GİRİŞ: Fare deri fibroblast hücreleri (MSFs), skuamöz hücreli akciğer kanseri (SqCLCs) ve
embriyonik kök hücrelerinin (mESCs) hücre döngüsü bileşenleri, apoptosis ve hücre iskeleti ilişkili moleküllerdeki benzerlikler ve farklılıkları,bu hücrelerin davranış ve diferansiyasyon kapasitesinde önemli belirleyicilerdir.Apopitotik yolakları açıklamak ve hücre döngüsü-hücre iskeletinin
karşılaştırmalı rolünü ve dağılımını incelemek için tumor biyolojisi ve kök hücre biyolojisinin onkogenesiz ve embriyogenesiz alanlarında birlikte değerlendirilmesi gerekmektedir. Hücre
döngüsü inhibitörü olan flavopridolün (FLV) ve ısı-şok protein inhibitörü olan geldanamisinin (GLD) fare somatic, tumoral ve embriyonik kök hücrelerde özellikle hücre iskeleti proteinleri, hücre döngüsü regülatörleri, hücre polaritesi ve motilitesi üzerindeki değişimlere etkisini araştırmak çalışmanın temel amacıdır.YÖNTEMLER:. Tüm Fare hücre hatlarında; flavopiridol veya geldanamisin öncesi ve sonrası çeşitli gen ekspresyonu analizi, hücre döngüsü-flow cytometric analizi ve hücre iskeleti moleküllerinin immunfloresan analizleri gerçekleştirildi.BULGULAR: Flavopiridol uygulaması SqCLCs hücrelerinde hücre içi iskelet proteinlerinde, hücre polaritesinde ve hücre döngüsü
bileşenlerinde belirgin derecede artışa neden olmuştur.FLV ve GLD uygulaması kanser hücrelerinde apoptozisi tetiklemiştir.Hücre içi iskelet, hücre polaritesi ve motilite genlerinin ekspresyonunun fare embriyonik kök hücrelerine kıyasla skuamöz hücreli akciğer kanseri hücrelerinde anlamlı derecede az olduğu ortaya konmuştur.SONUÇ: Embriyogenesiz ve karsinogenesiz arasındaki benzer/farklı moleküler mekanizmaları ortaya çıkaran bu sonuçlarımız, özellikle kanser hücrelerini hedef alan yeni tedavilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
Anahtar Kelimeler: Hücre iskeleti, Fare embriyonik kök hücre, Hücre döngüsü, Isı şok protein inhibitörü, Hücre döngüsü inhibitörü, Tümör biyolojisi
117
Comparison of cell cycle components, apoptosis and cytoskeleton related molecules and therapeutic effects of flavopiridol and geldanamycin in mouse fibroblast, mouse lung cancer and mouse embryonic stem cells
Hüseyin Aktuğ1, Eda Açıkgöz2, Ayşegül Uysal1, Fatih Oltulu1, Gülperi Öktem1, Gürkan Yiğittürk1,
Kenan Demir1, Altuğ Yavaşoğlu1, Vildan Bozok Çetintaş3
1Department of Histology and Embryology, Ege University, İzmir, Turkey
2Department of Histology and Embryology, Yuzuncu Yil University Faculty of Medicine, Van, Turkey, 3Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Ege University, Izmir, Turkey,
INTRODUCTION: Similarities and differences in cell cycle components, apoptosis and cytoskeleton related molecules among mouse skin fibroblast cells (MSFs), mouse squamous cell lung carcinomas (SqCLCs) and mouse embryonic stem cells (mESCs) are important determinants of the behaviour and differentiation capacity of these cells. To reveal apoptotic pathways and to examine the distribution and the role of cell cycle-cell skeleton comparatively would necessitate tumor biology and stem cell biology to be assessed together in terms of oncogenesis and embryogenesis. METHODS: The primary objectives of this study are to investigate the effects of flavopiridol, a cell cycle inhibitor, and geldanamycin, a heat shock protein inhibitor on mouse somatic, tumor and embryonic stem cells, by specifically focusing on alterations in cytoskeletal proteins, cell polarity and motility as well as cell cycle regulators. To meet these objectives, expression of several genes, cell cycle analysis and immunofluorescence staining of intracellular cytoskeletal molecules were performed in mouse cell lines pre and post flavopiridol or geldanamycin treatment.
RESULTS: Comparative analysis showed that flavopiridol administration significantly increased intracellular skeletal proteins, cell polarity and cell cycle components in SqCLCs. Comparative analysis of gene-array results revealed significantly lower expression levels of genes that are crucial for intracellular skeleton, cell polarity and motility in SqCLCs versus mESCs.
CONCLUSION: Our results revealing differences in molecular mechanisms between embryogenesis and carcinogenesis may prove crucial in developing novel therapeutics that specifically target cancer cells.
Keywords: Cell cytoskeleton, Mouse embryonic stem cell, Cell cycle, Heat shock protein inhibitor, Cell cycle inhibitor, Tumor biology