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O objetivo primário da avaliação da bioequivalência é comparar as biodisponibilidades entre o produto teste e referência, e demonstrar que é pouco provável que exista qualquer diferença clínica importante entre os mesmos (European Agency for the Evalution of Medicinal Products, 2002). Assim, se dois produtos produzem perfis de concentrações sanguíneas significativamente semelhantes, estes apresentarão respostas, seja terapêutica

ou tóxica, semelhantes (Meredith, 1996). A análise estatística dos dados resultantes de ensaios de bioequivalência inclui a análise de dados discrepantes (outliers), a análise de variância e a determinação do intervalo de confiança 90%.

3.2.3.2.1DADOS DISCREPANTES (OUTLIERS)

Observações que apresentam valores extremamente altos ou baixos, dentro de um conjunto de dados, são chamadas de dados discrepantes da amostra (outliers). Os outliers podem prejudicar a distribuição normal e igualdade de variância da amostra (Zar, 1996).

Um dos problemas mais comuns encontrados em estudos de bioequivalência é a observação, no conjunto de dados, de valores extremamente altos ou baixos. Essas observações atípicas podem representar um grande impacto na avaliação da bioequivalência. A detecção e o tratamento a ser dado a estas observações podem alterar a conclusão da bioequivalência, ou seja, a inclusão ou exclusão destes dados discrepantes pode originar resultados completamente opostos (Chow & Liu, 2000).

Existem basicamente três tipos possíveis de observações atípicas em estudos de bioequivalência (ANVISA, 2002):

o _{valores inesperados na curva de concentração plasmática versus} tempo, para alguns tempos de coleta;

o _{valores extremamente altos ou baixos para determinado parâmetro} farmacocinético em um dos produtos (teste ou referência);

o _{indivíduos incomuns que exibem biodisponibilidade muito inferior} ou muito superior com relação ao produto referência, ou seja, uma diferença muito grande para o perfil da curva de concentração

plasmática versus tempo entre os dois produtos, implicando em valores diferenciados para todas as medidas farmacocinéticas avaliadas.

A observação de valores inesperados em determinadas concentrações da curva de concentração plasmática versus tempo, normalmente, têm um pequeno efeito na comparação das biodisponibilidades. Por outro lado, a presença no conjunto de dados de valores extremamente altos ou baixos para determinado parâmetro farmacocinético, para apenas um dos produtos, significa que a distância entre os valores da medida farmacocinética para o produto teste e o produto referência, de um determinado indivíduo, é muito grande. Este tipo de observação atípica tem um grande impacto na avaliação comparativa, considerando-se o critério da bioequivalência média, pelo fato da média ser um estimador muito sensível à presença de valores extremos (ANVISA, 2002).

Da mesma forma que a observação pontual de determinado parâmetro farmacocinético discrepante pode anular a conclusão de bioequivalência do estudo, a constatação de um indivíduo atípico no conjunto de dados pode rejeitar a bioequivalência entre dois produtos quando na realidade estes são bioequivalentes. A constatação deste dado discrepante pode indicar que a variabilidade da resposta a um dos produtos não é homogênea (falha do produto), ou que o indivíduo faz parte de uma sub-população. Nesse sentido, a seleção e os critérios para inclusão de voluntários nos estudos podem atuar como fatores determinantes no intuito de identificar a presença de voluntários atípicos nos estudos de bioequivalência. (ANVISA, 2002). Entretanto, a presença de voluntários que apresentam comportamento diferenciado não deve implicar em exclusão dos mesmos, pois estes podem fazer parte de uma sub-população, que também poderá consumir o produto testado.

Assim, em função dos riscos envolvidos, é recomendável que, após a identificação destes dados atípicos, a avaliação da bioequivalência seja feita

com e sem estes dados. A exclusão dos dados discrepantes só deve ser aceita se devidamente justificada (Brasil, 2006).

3.2.3.2.2ANÁLISE DE VARIÂNCIA (ANOVA)

A análise de variância (ANOVA) é utilizada, basicamente, para testar a hipótese de igualdade entre as médias de duas populações. Em estudos de bioequivalência, a ANOVA representa uma avaliação preliminar dos resultados de parâmetros farmacocinéticos dos produtos em estudo. Entretanto, é importante ressaltar que esta análise estatística não deve ser utilizada como critério de decisão em estudos de bioequivalência (Metzler, 1991).

A aplicação mais importante da ANOVA em estudos de bioequivalência é identificar as fontes de variação e estimar a magnitude desta variabilidade dentro das médias dos parâmetros farmacocinéticos determinados. Assim, a partir do resíduo da ANOVA é possível separar os efeitos residuais das fontes de variação e avaliar a magnitude de contribuição de cada fonte de variação sobre a variabilidade observada. Nos estudos de bioequivalência existem basicamente três fontes de variação ou efeito: produto, seqüência e período. A ANOVA as identifica e avalia a contribuição individual de cada fonte na variabilidade total do estudo (Metzler, 1991).

A avaliação do efeito produto deve indicar se existe ou não igualdade entre os produtos avaliados. A constatação do efeito produto não significa que as formulações avaliadas não sejam bioequivalentes, pois o conceito de bioequivalência está definido dentro do intervalo de confiança de 90% (IC 90%), e sob este aspecto, mesmo havendo efeito de produto, se a diferença entre as formulações está dentro dos limites estabelecidos pelos órgãos reguladores, elas serão consideradas bioequivalentes (United States Pharmacopeia, 2007). Desta forma, se o efeito produto for observado pela ANOVA, isso significa que os produtos não são iguais, mas não implica em que os mesmos não sejam clinicamente equivalentes.

O efeito de seqüência relaciona-se com a existência de efeito residual. A existência de efeito residual significa que existem efeitos residuais diferentes nas seqüências de tratamentos. Entretanto, a inexistência do efeito residual não implica, necessariamente, que tais efeitos sejam nulos, mas que se existirem, têm a mesma intensidade em ambas as seqüências de tratamentos. Em planejamentos cruzados, como no caso de estudos de bioequivalência, a presença de efeitos residuais tem um grande impacto na inferência estatística (ANVISA, 2002).

De acordo com a Farmacopéia Americana (United States Pharmacopeia, 2007), esta observação ocorre em 10% dos estudos de bioequivalência. Este efeito pode ser aceitável se: o estudo aplicou dose única; incluiu apenas voluntários sadios e normais; o fármaco não constituiu uma molécula endógena; foi aplicado um período de washout adequado entre os dois períodos; e o estudo contemplou todos os critérios científicos e estatísticos, tais como cumprimento do protocolo de ensaio, metodologia validada, dados obtidos aceitáveis, análise estatística apropriada e intervalos de confiança para os parâmetros farmacocinéticos aceitáveis (Brasil, 2003c). Desta forma, se o estudo contemplou todos os requisitos supracitados, tal efeito não interfere no resultado final observado.

A observação do efeito período na análise não invalida o estudo de bioequivalência. Espera-se que um ensaio bem elaborado e consistente não apresente diferenças estatisticamente significativas entre os períodos. Entretanto, se a mesma for detectada, a causa deve ser investigada (Ormsby, 1994).

3.2.3.2.3INTERVALO DE CONFIANÇA 90%(IC90%)

Atualmente, FDA (Food and Drug Administration), EMEA (European Agency for the Evaluation of Medicinal Products) e ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) aprovam evidências de bioequivalência em termos de biodisponibilidade média relativa, definida por meio dos parâmetros

farmacocinéticos ASC0-t e Cmax. A biodisponibilidade média relativa pode ser

expressa como a razão entre as médias geométricas dos parâmetros farmacocinéticos dos produtos teste e referência. Os órgãos oficiais consideram, atualmente, dois produtos como bioequivalentes se o intervalo de confiança 90% (IC 90%) da razão supracitada, determinada a partir das transformações logarítmicas dos valores dos referidos parâmetros, estiver compreendido entre 80 e 125% (Brasil, 2006; United States, 2004).

A construção do IC 90% para a diferença das médias deve ser baseada nas médias de mínimos quadrados dos dados transformados em logaritmos e no quadrado médio residual da ANOVA. Os antilogaritmos dos limites de confiança obtidos devem constituir o IC 90% para a razão das médias geométricas entre os produtos teste e referência. A conclusão de bioequivalência média entre dois produtos é alcançada quando este intervalo de confiança está compreendido entre 80% e 125% (Brasil, 2003c). Na escala logarítmica, os limites correspondentes a 0,80 e 1,25 são apropriados para as razões das médias geométricas, pois a assimetria é causada pela reconversão dos valores em log para a escala original (Midha et al., 1994). Este método equivale a dois testes unicaudais com hipótese nula de bioinequivalência, ao nível de significância igual a 5% (European Agency for the Evalution of Medicinal Products, 2002; Brasil, 2006).