UMS – 19 Đle Đlgili Çözüm Önerileri

O diagrama da Figura 3.3 ilustra um microsc´opio confocal de varredura a laser, no qual ´e poss´ıvel notar alguns elementos que o comp˜oem. Para se entender os princ´ıpios e m´etodos envolvidos na captura e apresenta¸c˜ao de imagens multiespectrais, este texto se concentra principalmente nos seguintes componentes: fonte laser, espelho dicroico, unidade de varredura XY, lente objetiva e a unidade fotomultiplicadora.

Figura 3.3 – Diagrama esquem´atico de um microsc´opio confocal por fluorescˆencia: (a) controle posicionamento; (b)pin hole fonte; (c) amostra; (d) objetiva; (e) espelho dicr´oico; (f) filtro; (g) pin hole do detetor; (h)fotomultiplicadora.

Fonte(s): LSCM (79).

Um princ´ıpio da microscopia por fluorescˆencia ´e maximizar a captura de luz emitida por fluorescˆencia, minimizando a luz de excita¸c˜ao. Dessa forma, a fonte de luz ´e de extrema importˆancia, pois sua escolha deve estar de acordo com o espectro de absor¸c˜ao da amostra, para que um espectro de emiss˜ao seja obtido. Para isso, lasers s˜ao utilizados, por sua precis˜ao de comprimento de onda ´unica emitida (luz monocrom´atica) e intensidade est´avel.

Uma vez emitido um pulso de laser, esse ´e desviado por um espelho dicr´oico para a unidade de controle de varredura XY, que o redireciona, passando pela lente objetiva, para uma coordenada espec´ıfica na amostra(vetor em vermelho na Figura 3.3). O papel da unidade de controle de varredura XY ´e de varrer a amostra, ponto-a-ponto, linha-a-linha. A Figura 3.4 mostra, `a esquerda, o interior de uma unidade de varredura a laser e, `a direita, como o feixe de laser se comporta nesse processo de varredura da amostra, ao sair da objetiva.

O pulso de laser ao atingir a amostra, provoca a resposta desta, com a emiss˜ao de luz por fluorescˆencia. Essa emiss˜ao faz o caminho inverso do laser, voltando pela objetiva, passando pelo espelho dicr´oico e seguindo em dire¸c˜ao `a fotomultiplicadora - conforme indica vetor cinza na Figura 3.3.

Figura 3.4 – Esquerda: unidade de varredura XY: (1) feixe laser; (2) espelho de varredura em X; (3) espelho de varredura em Y. Direira: movimento de varredura do feixe de laser passando pela objetiva: (1) feixe laser; (2) amostra.

Fonte(s): esq. CONFOCAL (80); dir. RESONANT (85).

Fotomultiplicadoras s˜ao detectores de f´otons muito utilizados pela precis˜ao de medida e ex- celente caracter´ıstica de amplifica¸c˜ao do sinal recebido(26). S˜ao baseados em um tubo(Figura 3.5-esquerda), que utiliza em sua estrutura, um catodo como um detector de f´otons(fotocatodos), e emitem el´etrons em resposta `a absor¸c˜ao de luz. Esses el´etrons s˜ao acelerados por um campo el´etrico, para um emissor secund´ario (segundo fotocatodo) chamado de dynode. O processo de amplifica¸c˜ao ocorre com as sucessivas passagens pelos dynodes, gerando mais e mais el´etrons com ganhos cada vez maiores, para que possam ser mensur´aveis(4, 26). A capacidade de captura simultˆanea de comprimentos de onda de um microsc´opio confocal est´a relacionada ao n´umero de sensores da fotomultiplicadora utilizada.

Figura 3.5 – Esquerda: diagrama de uma fotomultiplicadora de um canal. Direita: fotomultiplicadora linear de 32 canais.

3.2 Microscopia confocal de varredura a laser, por fluorescˆencia 45

A Figura 3.5-direita ilustra uma fotomultiplicadora linear com a capacidade de leitura de 32 comprimentos de onda distintos. O processo de detec¸c˜ao do espectro emitido ´e fundamental para a captura e forma¸c˜ao da imagem multiespectral. A forma¸c˜ao da imagem multiespec- tral ´e feita pelo armazenamento, em frame-buffer, de cada assinatura espectral de emiss˜ao, coletada ponto-a-ponto e ordenada pela respectiva coordenada de varredura do feixe de ex- cita¸c˜ao(Figura 3.6-esquerda), o qual ´e controlado pela unidade de varredura XY. Basicamente, o frame-buffer pode ser visto como uma matriz de mem´oria de dimens˜oes (M xN xC), em que (M xN ) correspondem ao comprimento e largura da amostra, e C `a profundidade dessa ma- triz que armazena as intensidades dos C comprimentos de onda, lidos simultaneamente pela fotomultiplicadora.

Figura 3.6 – esquerda: Ilustra¸c˜ao do processo de varredura pontual; direita: Ima- gem de corte confocal de fibras vegetais.

Fonte(s): Francisco E. G. Guimar˜aes∗

Nota-se que o processo descrito foge da captura convencional de imagem por CCD† _que,

embora forne¸ca a posi¸c˜ao relativa do sinal na amostra, n˜ao possui alto ganho na amplifica¸c˜ao deste, al´em de ser suscet´ıvel a ru´ıdos, quando comparado com fotomultiplicadoras (6, 25, 26). Outra caracter´ıstica importante do CCD diz respeito `a resolu¸c˜ao de captura, que ´e diretamente dependente da densidade de elementos por ´area do dispositivo e de seu respectivo tamanho - que o torna uma op¸c˜ao nada interessante quando se deseja alta resolu¸c˜ao em imagens de microscopia confocal(4, 23, 26).

Na microscopia confocal, o que permite a obten¸c˜ao de uma imagem “limpa”, e um alto ganho na resolu¸c˜ao, ´e o fato da fonte de ilumina¸c˜ao alinhar-se com o ponto focal de forma eficiente(6 apud 7), permitindo um ”corte”(Figura 3.6-direita) na amostra em um mesmo plano focal, bloqueando a interferˆencia de emiss˜oes que estejam fora desse plano e volume ∗_{Imagens gentilmente cedidas por Francisco E. G. Guimar˜aes.}

†_{CCD ou Charge-Coupled Device - um arranjo de elementos compostos por um semicondutor, di´oxido de sil´ıcio}

(SiO2), que armazenam cargas, induzidas por f´otons. A leitura de uma imagem projetada em sua superf´ıcie

´e feita por meio de um registrador serial, para o qual s˜ao transferidas as cargas linha-a-linha paralelamente. Essas cargas por linha s˜ao quantificadas correspondendo `a intensidade do respectivo elemento do CCD(23,26).

´otico. Como a captura ocorre de forma pontual(Figura 3.6-esquerda), o processo de varredura da amostra gera uma quantidade de pixels multiespectrais na ordem de 106 _{pixels por imagem,}

o que torna as informa¸c˜oes espectrais obtidas, uma boa base para an´alises estat´ısticas.

3.3

Visualiza¸c˜ao de imagens multiespectrais por softwa-