Doku iyileşmesi ve kan damarlarının onarımı cerrahi, travma ve dejeneratif hastalıklar sırasında yıkıcı bir olaydan sonra gereklidir. Yara onarımında görevli çok sayıda hücre tipi vardır. Endotel hücreleri, beyaz kan hücreleri ve özellikle trombositler, büyüme faktörlerini ve sitokinleri serbest bırakarak, önce koagülasyon aşamasında ve sonra olası doku rejenerasyonunda çok önemli bir rol oynar (105). Trombosit kaynaklı faktörler doku rejenerasyonu gerektiren klinik ve cerrahi uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır (106-108). İyileşme sürecinde trombosit türevlerinin yaygın kullanımı için gerekçe, kritik büyüme daktörleri ve diğer sinyal moleküllerinin trombositlerdeki bolluğu ve erişilebilirliğidir (107). Normal koşullar altında, büyüme faktörleri ve biyoaktif peptitler, enflamatuar, onarıcı ve yeniden şekillenme fazı boyunca ardışık olarak ilerleyen, yaralanmalara iyi düzenlenmiş doku iyileştirici bir tepkiye katkıda bulunur (109). Genel olarak, trombositler dinlenme durumundadır ve hemostaz ve yara iyileşmesinde aktif oyuncular olmadan önce bir tetikleyici gerektirir.
Doku onarımı sırasında, aktive trombositler ADP, ATP, serotonin ve pıhtılaşma faktörleri ve normal trombosit aktivitesi için kritik olan kalsiyum ve a-granüller ile birlikte yoğun granüller olarak bilinen 2 tip granül salgılar (110). Trombosit büyüme faktörleri (PGF), hücresel hedeflere sahiptir ve hücrelerin morfometrik ve mitojenik etkilerle göçünü indükleyerek hücre çoğalmasını, farklılaşmasını ve kemotaksiyi teşvik eder. Ayrıca, PGF'ler, mezenkimal kök hücrelerin kemik iliğinden, yağ dokusundan veya kordon kanından genişlemesini teşvik ederek ve olgunlaşmamış hücrelerin farklılaşmasına ve etkili çoğalma hücrelerinin sayısının arttırılmasına ve böylece iyileşme sürecinin arttırılmasına izin verir (111). PGF'ler serbest kaldıktan sonra, tirozin kinaz reseptörlerine bağlanırlar, böylece sinyali açık zarlardan çekirdekli plazma membranından çekirdeğe geçirirler ve sonunda hedef genlerin ekspresyonunu aktive ederler (112).
2.4.1 Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörleri
2.4.1.1 Transforme Edici Büyüme Faktörü β (TGF-b)
Uzun süreli iyileşme ile hem otokrin hem de parakrin şeklinde büyüme faktörü görevi görür; makrofaj ve lenfosit proliferasyonunu inhibe eder; mezenkimal kök hücrelerin
çoğalmasını uyarır; endotel, fibroblastik ve osteoblastik hücre mitogenezini de düzenler. (113)
2.4.1.2 Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü - PDGF
Bir yaradaki ilk büyüme faktörüdür ve bağ dokusunun iyileşmesinden sorumludur; makrofaj ve nötrofillerin kemotaksisini, mezenkimal kök hücrelerin, fibroblastik ve osteoblastik hücrelerin kemotaksisini ve mitogenezini teşvik eder; kollajen sentezini ve kollajenaz sekresyonunu düzenler (114)
2.4.1.3 Fibroblast Büyüme Faktörü - bFGF
Mitojenik etkiye sahip ve düzenleyici, morfolojik ve endokrin rolü olan çok işlevli bir proteindir; endotel hücrelerini, mezenkimal kök hücreleri, osteoblastik hücreleri ve fibroblastik hücreleri düzenler; kondrositlerin mitogenezini teşvik eder; önceden var olan vaskülatürden anjiyojenezi ve yeni kan damarlarının oluşumunu teşvik eder (115).
2.4.1.4 Epidermal Büyüme Faktörü - EGF
DNA sentezine ve hücre çoğalmasına yol açan birkaç genin ekspresyonunu artıran güçlü bir mitojendir; mezenkimal kök hücreleri ve epitelyal hücrelerin mitogenezini düzenler; endotelyal hücrelerin kemotaksisini ve anjiyogenezi teşvik eder; kollajenaz salgısını düzenler (116).
2.4.1.5 Damar Endotel Büyüme Faktörü - VEGF
Olgunlaşmamış damar oluşturmak için endotel hücrelerinin proliferasyonunu ve göçünü uyarır; kollajenaz salgısını düzenler (117).
2.4.1.6 CTGF
uyarır; anjiyogenezi teşvik eder; osteoblastik hücre aktivitesini düzenler; kollajen sentezini düzenler (118).
Trombosit büyüme faktörleri, belirtildiği gibi yaralanmaya hücresel cevabı düzenler. Trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF), makrofajlar, nötrofiller, endotelyal hücrelerin gelmesi ve bunlara aktif hale getirilmelerini sağlamak için trombositlerin ürettiği ilk büyüme faktörleridir ve doku tamirinde rol alır. Ek olarak, transformasyon büyüme faktörü β (TGF-b), yara iyileşme sürecinin başlangıcında, nötrofiller, monositler ve makrofajlar üzerindeki kemotaksisi ve mitogenezi uyarmada kritik rol oynamaktadır. İyileşme sürecinde damar endotel büyüme faktörü (VEGF) [24], damar geçirgenliğini ve neoanjiyogenezi artıran önemli bir katkı sağlar. Ayrıca, Kubota ve arkadaşları [25], bağ dokusu büyüme faktörünün anjiyogenetik aktiviteyi, kıkırdak rejenerasyonunu ve fibrozu arttırdığını göstermiştir. Epitelizasyon, yara kontraskyonu ve remodeling, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile gerçekleşir. Bu kollektif biyolojik özellikler trombosit türevlerinin sadece kanamaları önlemek için değil, aynı zamanda özellikle yara komplikasyonları sırasında iyileşme sürecini desteklemek için de kullanılmasını sağlar. Ayrıca, tek bir rekombinant büyüme faktörünün yüksek konsantrasyonlarda uygulanmasına kıyasla, trombosit türevli ürünlerin kullanımı, yara bölgesinde çoklu sinerjik büyüme farktörlerini sunma potansiyeline sahiptir (119). Bu ürünler arasında trombosit bakımından zengin plazma (TZP), trombosit jeli (TJ), trombosit bakımından zengin fibrin (TZF), serum göz damlaları (E-S) ve PRP göz damlaları (E-TZP) bulunur. Özellikle TZP ve TJ, hücre göçünü ve doku rejenerasyonunu teşvik etmek için tek başlarına veya ikame maddeleriyle kombinasyon halinde uygulanabilir. Bu bağlamda, iskeletli ve kemik iliği veya mezenkimal kök hücreli trombosit türevlerinin kullanımı, klinik uygulamalarda tedavilerin etkinliğini arttırma fırsatını sağlamaktadır.
2.4.2 Trombositten Zengin Kan Ürünlerinin Hazırlanması ve Çeşitleri
Trombosit konsantratları ilk olarak kanama kontrolü amacı ile transfüzyon ürünleri olarak kullanılmıştır. İyileşmeyi arttırmak ve fibrin yapıştırıcıyı yerleştirmek için farede konsantre fibrinin yara iyileşmesi üzerindeki etkisi 1970’li yıllarda kullanımış daha sonra fibrin glue alarak cerrahi sahada hemostaz amacı ile kullanılmıştır. Modern anlamda trombosit konsantratlarının kullanımı ilk olarak Whitman tarafından açıklanmıştır (120). Birinci nesil trombositten zengin kan ürünü olarak adlandirilan TZP ilk olarak 1998’de
dental cerrahide klinik kullanıma girmiştir. 2001 yılında tanımlanan TZF ikinci nesil trombositten zengin kan ürünü olarak adlandırılmaktadır. 2006 yılında Dohan ve arkadaşları ard arda yayınladıkları makaleler ile bu ürünün klinik kullanımını, in vitro ve in vivo etkilerini ve biyolojik özelliklerini tanımlamışlardır (121-124).
Trombositten zengin kan ürünlerinin hazırlanmasında değişik yöntemler mevcuttur. Farklı yöntemlerle elde edilen ürünlerin içeriğindeki trombosit sayısı ve büyüme faktörleri de farklıdır. Buna göre trombosit konsantratları lökosit ve fibrin içerikleri göz önünde bulundurularak 4 kategoriye ayrılmıştır (125):
-Saf trombositten zengin plazma (P-TZP)
-Lökosit ve trombositten zengin plazma (L-TZP) -Saf trombositten zengin fibrin (P-TZF)
-Lökosit ve trombositten zengin fibrin (L-TZF)
TZP’nin hazırlanmasında kan, cerrahiden hemen önce antikoagülanlı steril tüpler ile alınır ve santrifüj edilir. İlk santrifüj basamağında kan kırmızı kan hücreleri, hücresiz plazma (trombositten fakir plazma) ve parlak (buffy) kılıf olarak 3 tabakaya ayırır. Burada trombositler çoğunluktadır. Son olarak, trombosit aktivasyonunu ve fibrin polimerizasyonunu tetiklemek için trombin kalsiyum klorit toplanan krmzı kan hücresiz üstteki iki tabakaya uygılanır. Sorasında sıvı halde elde edilen TZP enjektör ile cerrahi alana uygulanır (125).
TZF, TZF’den sonra tanımlanan ikinci nesil üründür. Bu yöntemde, kan herhangi bir antikoagülan olmadan alınır ve derhal santrifüj edilir. Doğal bir koagülasyon süreci sonrasında ve kana herhangi bir biyokimyasal ajan uygulanmadan (antikoagülan, trombin veya kalsiyum klorite gerek olmadan) L-TZF kolayca toplanır (121). Bu yöntemin en önemli özellikleri basit ve maliyeti en düşük yöntem olmasıdır (126). TZF protokolü tıbbi bir alete veya kimyasala bağlı değildir, tüm klinisyenler tarafından kolaylıkla uygulanabilir. Fibrin yapıştırıcılar veya TZP’nin aksine kandan türemiş bir ürün değildir.
pıhtılaşma başlar (122). Antikoagülanların yokluğunda trombosit aktivasyonu ve fibrin polimerizasyonu hemen başlar. Fibrinojen ilk başta dolaşımdaki trombin onu fibrine çevirmeden önce tüpün başlangıç kısmında oluşur. Daha sonra ortada toplanır. Trombositler oluşan fibrin ağ içinde hapsolur. Bu nedenle santrifüjden sonra 3 tabaka oluşur; tabanda kırmızı kan hücresi, en üstte hücresiz plazma ve ortada TZF pıhtı. TZF pıhtı, lökosit ve trombositlerin çoğunun yoğunlaştığı güçlü bir fibrin matriks oluşturur(123). Fibrin matrisinde sıkışan sıvılar dışarı atılarak, dirençli otolog fibrin elde edilmektedir. Buna membran şekli verilebilmektedir.
Şekil 2: Santrifüj sonrası oluşan 3 katmanlı tabaka ve trombositten zengin fibrin
TZF’nin içinde bulunan birşelenler başlıca; • Trombositler
• Trombosit büyüme faktörleri • Lökositler
• Sitokinler • Fibrin
• Dolaşımdaki kök hücrelerdir.
Trombositlerin sahip oldukları Α-granülleri birçok büyüme hormonu ve sitokin barındırmaktadır. Bunlar yara iyileşmesi ve olgunlaşmanın üç birleşeni olan anjiogenez, immünite ve epitelyal kapanmayı destekler. Trombositlerin yara alanında toplanması,
hemostazı başlatmak ve desteklemek için aktivasyonları şarttır. Degranülasyonları sonucu yara iyileşmesinin ilk fazını başlatan sitokin ve büyüme faktörlerinin de fibrin matriks içinde salınımını sağlar. TZF oluşum sürecinde kanda antikoagülan olmaması cam tüp içinde yoğun bir trombosit aktivasyonu sağlar. Aktivasyon sonucu trombosit sitokin ve büyüme faktörleri açığa çıkar. Açığa çıkan bu sitokinler yavaş polimerizasyon sonucu oluşan esnek fibrin ağı içinde hapsolur.
TZF daha önce açıklanan büyüme faktörlenini yanısıra birçok sikotini de barındırmaktadır. Bunlardan en önemlileri IL-1β, IL-6 ve TNF-α’dır. IL-1 β enflamasyon kontrolünde kilit role sahiptir. IL-4’ün enflamasyonda temel görevi iyileşmeyi desteklemektir. IL-4 fibroblastlardan kollajen sentezini arttırır. Aynı miktarda serum, TZF ve trombositten fakir plazmadaki IL-1β, IL-4, IL-6, TNF-α ve VEGF miktarları araştırıldığında tüm parametrelerin TZF’de en yüksek miktarda bulunduğunu gösterilmiştir (122).
TZF’nin sahip olduğu fibrin matriks epitelyal hücre ve fibroblastları etkileyerek yara alanını kaplar. Yara kenarlarında epitel hücreleri bazal ve apikal yüklerini kaybederler ve yara alanında bazal ve apikal yönde genişleyerek yarayı kaplarlar. TZF mikrovaskülarizasyon gelişimini sağlayan ve epitelyal hücre göçünü yönlendiren fibrin bazlı doğal bir biyomateryaldir. Açık yaraları korumak ve iyileşmeyi hızlandırmak için bu fibrin matriks ideal bir biyomateryal olarak kabuledilmektedir. TZF’nin bariyer membran olarak kullanıldığı in vitro bir çalışmada TZF membranın kollajen membrana oranla periosteal hücrelerin in vitro olarak üretilmesinde daha uygun bir membran oldu gösterilmiştir (126).