Até início de 2013, nos laboratórios da rede pública, o teste sorológico ELISA era feito como triagem e somente os resultados positivos ou dentro da faixa cinza, considerados indeterminados eram encaminhados para confirmação pela IFI. Com este fluxo, pelos resultados obtidos neste trabalho vários resultados seriam falso-negativos. Isto porque foi observado em todas as etapas que amostras com resultado negativo no ELISA positivaram na IFI, o que demonstra lacunas na sensibilidade do teste tido como triagem, até então. A ressalva é feita para o uso de kit comercial neste estudo e não o kit de Bio-Manguinhos repassado pelo MS. Porém, em estudos realizados com os kits de Bio-Manguinhos para ELISA e IFI não foram observados resultados concordantes em níveis satisfatórios (Queiroz et al, 2010; Morais, 2011). Foram apresentados dados comparativos da FUNED (Diagnóstico..., 2013) referentes aos testes sorológicos e constatou que de janeiro a julho de 2011 (mesmo período de análise laboratorial deste estudo), de 1394 amostras positivas no ELISA a IFI foi concordante em 44%, com kits de Bio-Manguinhos.
Verifica-se a importância da utilização de mais de uma técnica para o diagnóstico da LVC, a fim de minimizar os resultados falso-negativos e falso-positivos (Alves e Bevilacqua, 2004; Andrade et al., 2006; Silva, 2009; Coura-Vital et
al., 2013). Uma mesma técnica pode apresentar
valores nos coeficientes de incidência bem diferentes com o uso de antígenos distintos, foi o que ocorreu com o teste imunoenzimático ELISA com antígeno L. major-like (6,5/1000 cães), do kit produzido por Bio-Manguinhos, e outro antígeno solúvel L. infantum (11,2/1000 cães) com produção in house (Coura-Vital et al., 2013).
De acordo com Dye et al. (1993) cerca de 20% de casos de infecção por LV podem passar despercebidos pela IFI especialmente em cães na fase de incubação da doença ou soroconversão. Durante estas fases, os níveis de anticorpos em circulação podem ser altamente variáveis e isso pode explicar o baixo nível de concordância entre os ensaios quando os cães assintomáticos são avaliados. Andrade et al. (2006) relataram que em 62,5% de amostras com IFI negativas a PCR foi positiva.
Uma maior associação entre técnicas laboratoriais foi feita com os animais soropositivos necropsiados. Foi possível realizar nova sorologia e comparar a positividade entre diluições usadas na titulação completa de anticorpos com as duas diluições de 1:40 e 1:80 usadas nas três etapas de coleta de sangue. Além da sorologia, foram associados os resultados do parasitológico direto, isolamento em cultura, da PCR de mielocultura, medula e de tecidos. Mais da metade dos cães necropsiados foram soropositivos na segunda coleta e a minoria na terceira coleta, coincidindo com os valores proporcionais de incidência.
Em relação à sorologia dos cães necropsiados observou-se que quase metade apresentou IFI positiva na diluição de 1:40 e a medida que a diluição aumentava a frequência de positividade diminuía. Tanto o resultado indeterminado como a diluição de 1:40 eram na grande maioria de cães com sorologia positiva da 2ª coleta de sangue. Da diluição 1:80 a 1:640 foi observada maior proporção de cães positivos, procedentes da 1ª coleta.
Foi observado que 75% dos cães soropositivos na IFI das três etapas de coleta de sangue apresentaram título no ponto de corte, ou seja, positivo na diluição de 1:40 e o restante na outra diluição feita de 1:80. E, a mesma observação foi
feita ao constatar que dentre os cães necropsiados, com resultado variando de indeterminado a positivo na diluição de 1:1280, a maior proporção registrada foi de IFI positiva na diluição de 1:40 e destes a grande maioria tinha sorologia com este mesmo título na segunda etapa.
Possivelmente, pode-se explicar o resultado indeterminado e soropositivo na menor diluição de 1:40 na sorologia dos cães necropsiados procedentes da segunda coleta levando em consideração o intervalo semestral para a soroconversão. Já na terceira etapa, também com intervalo semestral, a proporção de cães que soroconverteram foi bem menor, ou seja, um terço do quantitativo da coleta anterior. Talvez a retirada dos cães soropositivos até o momento desta última coleta tenha influenciado positivamente neste resultado. A maior diluição positiva dos cães necropsiados da terceira etapa foi de 1:320, diferentemente das primeiras etapas com diluição positiva até 1:1280.
Os baixos títulos de anticorpos dos cães necropsiados podem explicar a baixa positividade do exame parasitológico (apenas 24,4% dos animais), mesmo com a presença de alterações cutâneas em um terço dos cães com sinais clínicos observados durante a necropsia. O diagnóstico microscópico de lâminas coradas pode se tornar difícil se o animal apresentar baixa carga parasitária. Silva (2009) relatou positividade no parasitológico direto em 61% e 74% em cães assintomáticos e sintomáticos, respectivamente, e não observou diferença estatística entre a pele, baço, linfonodo e medula óssea.
Os dois únicos cães com título de 1.1280 não apresentaram positividade no parasitológico direto e não tiveram amostra em meio de cultura. Ambos eram polissintomáticos, com lesões de pele e com alteração no baço. Um deles teve a espécie L. infantum caracterizada em amostra de medula. Queiroz et al. (2010) observaram 100% de positividade da PCR mesmo em amostras de pele sadia, assim como observaram PCR negativa em amostra de lesão de pele de um mesmo cão com PCR positiva de pele íntegra. Estes autores relataram que, com exceção dos animais polissintomáticos, as análises comparativas revelaram baixa concordância entre os testes sorológicos dificultando a replicação
entre elas no diagnóstico da LVC, diretamente dependente do estado evolutivo da doença e da resposta imune do hospedeiro. No estudo que desenvolveram (Queiroz et al., 2010), a positividade de ELISA e IFI no grupo dos assintomáticos foi de 12,5%, passando para 78,6% e 57,1%, respectivamente, no grupo dos oligossintomáticos e chegando a 83,3% para ambos os testes no grupo dos polissintomáticos, tendo como padrão-ouro o resultado sorológico anterior.
A PCR de tecidos foi positiva em 7,6% de todas as amostras de necropsia, diferentemente da PCR de mielocultura com 100,0% de positividade. O isolamento em cultura teve positividade em 21,3% das amostras que puderam ser concluídas, porque todo o material biológico dos cães necropsiados da primeira etapa teve o meio de cultura contaminado e, portanto descartado. Esta taxa de positividade foi baixa quando comparada à alta sensibilidade da PCR por outros autores (Andrade et al., 2006; Queiroz et al., 2010; Coura-Vital et al., 2013). Silva (2009) relatou positividade do isolamento em mielocultura de 58,0% e da PCR de 36,4% para o baço, 27,3% para linfonodo e 50,0% para pele, em cães de três municípios mineiros – Janaúba, Montes Claros e Paracatu. Andrade et al. (2006) observaram maior positividade da PCR em relação à IFI e ao parasitológico direto, e este teste molecular embora tenha tido maior frequência no grupo dos cães sintomáticos especialmente em amostra de pele, não apresentou diferença significativa entre os grupos clínicos ou órgãos examinados. Coura- Vital et al. (2013) relataram que os cães que foram PCR positivos tinham aproximadamente o dobro do risco de soroconversão quando comparados aos cães com PCR- negativa, reforçando a hipótese de que estes animais com sorologia negativa e PCR positiva tiveram contato anterior com o parasita e podem desenvolver a doença.
A PCR associada à RFLP foi capaz de identificar as espécies de Leishmania em dezenove cães com amostras oriundas da mielocultura (10) e de tecidos (10). Um único cão teve a espécie L.
infantum caracterizada em amostra de medula
óssea (sangue e cultura) e de tecido (pele). Em relação à sorologia, a metade dos cães com L.
amazonensis identificada apresentou resultado
resultado apenas positivo. Conforme bula do
fabricante o antígeno de ELISA/S7® é
recombinante, produzido por engenharia genética e que permite a detecção de anticorpos na fase mais precoce da infecção, apresentando sensibilidade média de 89% e especificidade média de 94,3% (a bula não cita reação cruzada). A IFI apresenta o inconveniente de reações cruzadas, inclusive com a LTA, que também é notificada em Juatuba. Já os valores de sensibilidade e especificidade são em média de 90,0% e 80,0%, respectivamente, conforme citado na bula.
Os títulos da IFI variaram de 40 a 640 no grupo de animais com L. amazonensis, mas o maior título foi encontrado em um único animal, os demais foram de 40 e 80. Tolezano et al. (2007) identificaram L. amazonensis em cães urbanos com comprometimento visceral e quadro típico de LV com sorologia negativa para IFI. No grupo dos animais com L. infantum os títulos variaram de 80 a 1.280 sendo que mais da metade apresentou título igual ou superior a 320. Por esta análise verificam-se títulos maiores dentre os animais com L. infantum, cuja resposta dos linfócitos T é que exerce a maior influência sobre a infecção e a produção de anticorpos é abundante, porém deletéria e não protetora (Manual..., 2006).
Courtenay et al. (2002) observaram correlação positiva entre grau parasitário, infectividade, nível de anticorpos anti-Leishmania sp., detecção de DNA do parasita por PCR e presença de sinais clínicos. A evidência de maior possibilidade de concordância entre testes diagnósticos em cão polissintomático foi observada em diversos estudos (Silva, 2009; Queiroz et al., 2010; Coura-Vital, 2011).
Foram observados sinais clínicos em 94,6% dos cães necropsiados. Em relação aos cães com as espécies caracterizadas, observou-se a presença de sinais clínicos em todos e maior comprometimento visceral no grupo da L.
amazonensis (87,5%) quando comparado ao
grupo de L. infantum (54,5%). Este resultado não corresponde ao tropismo clássico relatado na literatura e que diferencia a LT da LV. Silva (2009) identificou, também, as duas espécies de
Leishmania em cães em Paracatu e sugeriu que
fossem feitos estudos posteriores da fauna flebotomínica, contemplando investigação
natural por L. amazonenzis e estudos de infectividade de cães para as espécies de flebotomíneos do complexo flaviscutellata ou outras. Desde a década de 1990 foi observada a expansão tanto da LTA quanto da LV na RMBH (Luz et al., 2001).
Outros autores observaram resultados díspares em seus estudos. Barral et al. (1986) isolaram L.
amazonensis de medula óssea de um caso de
LVH na Bahia. Martinez et al. (2002) identificaram coinfecção por L. amazonensis e L.
infantum em um caso de leishmaniose cutânea
difusa numa criança. Esse foi o primeiro relato de infecção mista onde foram encontradas duas espécies distintas de Leishmania na mesma lesão. Estes autores atribuem melhor crescimento da L. amazonensis em cultura quando comparada a L. infantum. Tolezano et al. (2007) identificaram L. amazonensis em cães urbanos de Araçatuba-SP diagnosticados clinicamente como LV e com alteração no baço. Dias et al. (2010) também identificaram cães de Paracatu-MG com
L. amazonensis e comprometimento visceral,
sem o encontro do vetor típico desta espécie na área.
Mediante a circulação das duas espécies de
Leishmania no município mais estudos são
necessários para possibilitar maior entendimento da epidemiologia da LV e LT, especialmente quanto à evidência que a espécie L. amazonensis possa demonstrar comportamento viscerotrópico nos cães. Em Juatuba são registrados casos de LV e LTA e o estudo bem elaborado no município com levantamento da fauna flebotomínica e sua dispersão é essencial para que se proponha medidas de controle mais específicas e eficientes. Para cada área de transmissão, são necessários estudos epidemiológicos para investigar a(s) espécie(s) de Leishmania circulante(s), bem como os vetores e reservatórios presentes (Ferreira et al., 2012).
Ao comparar os resultados do sequenciamento com a PCR-RFLP observa-se que em apenas dois cães dentre os oito identificados com L.
amazonensis, tanto na pele quanto na medula,
esta espécie apresentou a mesma proximidade genética da L. infantum. Os demais, apesar da distância mínima consideraram a L. infantum como espécie mais próxima.
Na PCR-RFLP foram utilizadas a enzima HaeIII e posteriormente Ava I, por apresentarem fragmentos distintos após digestão do kDNA e os resultados não deixaram dúvidas quanto à identificação das espécies de Leishmania quando comparadas aos padrões usados, o que já foi constatado por outros autores (Andrade et al., 2006).
Os testes diagnósticos foram avaliados tendo a IFI como padrão-ouro, teste este considerado até início de 2013 como de escolha pelo MS para confirmação dos animais soropositivos por reunir as características essenciais de valores considerados satisfatórios de sensibilidade e de especificidade (Alves e Bevilacqua, 2004), mesmo sendo questionado por outros autores (Rosário et al., 2005). O teste de Kappa apresentou fraca concordância do ELISA em relação a IFI e não foi significativo nos demais testes comparados à IFI, também. Como esperado, o ELISA foi mais sensível e o parasitológico direto e por isolamento em cultura, e o PCR foram 100% específicos, demonstrados pelos valores de sensibilidade e especificidade e de VPP e VPN. A acurácia apresentou valores mais altos para o ELISA do que os outros testes, possivelmente por apresentar valores mais próximos entre sensibilidade (valor médio 68%) e especificidade (valor médio 79%) quando comparado aos demais.
Mesmo com todos os avanços os testes sorológicos, ainda, se constituem um desafio para o PCLV na realização de inquéritos censitários. Estudos têm comprovado que as técnicas sorológicas (ELISA e IFI) subestimam o número de cães infectados (Coura-Vital, 2011). Autores sugerem análises de viabilidade para possível inclusão de testes imunocromatográficos (Moraes, 2006), técnicas moleculares no PCLV do Brasil (Andrade et al., 2006; Coura-Vital, 2011). Outros apontam para associação do DAT (Teste de aglutinação direta) e ELISA em substituição à IFI (Ferreira et al., 2007) ou a imuno-histoquímica para confirmação da sorologia negativa ou discordante e a PCR restrita apenas à confirmação dos casos ainda suspeitos (Queiroz et al., 2010).