Tıbbi beslenme tedavisi (TBT)

experimental induzida por DSS

A quantificação dos níveis de citocinas do padrão Th1 (IFN- , IL-12 e TNF-), Th2 (IL-4) e Th17 (IL-6 e IL-17A) foi realizada a partir do sobrenadante da cultura dos fragmentos do cólon dos animais submetidos ao modelo de colite ulcerativa. De um modo geral, verificou-se que as concentrações das citocinas nos grupos não expostos à DSS 3% apresentaram-se em baixos níveis (Figura 7). Isto inclui os animais para os quais a potencial cepa probiótica foi administrada de maneira isolada: os níveis de citocinas para estes não foram diferentes daqueles atribuídos aos animais do grupo controle negativo (p > 0,05); com exceção dos níveis de IL-4, que se mostraram mais elevados nos animais tratados com o potencial probiótico quando comparados aos animais do grupo controle negativo (p < 0,05).

Por outro lado, quando os animais foram expostos à DSS 3%, na ausência de qualquer tratamento, os níveis das citocinas aumentaram de forma significativa. O aumento de cinco das seis citocinas pesquisadas foi atenuado ou inibido quando houve tratamento com o potencial probiótico e extrato metanólico sendo administrados isoladamente. A associação entre as terapêuticas, por sua vez, foi capaz de atenuar ou inibir o aumento de todas as citocinas analisadas, sendo a redução dos níveis de IL-4 (p < 0,05) e TNF-α (p < 0,01) mais acentuada quando os animais foram tratados com a associação em relação às terapias isoladas.

Figura 7 – Efeito dos tratamentos sobre os níveis de citocinas em sobrenadante de cultura de cólon no modelo murino de colite. (A) IFN-γ; (B) IL-12; (C) TNF-α; (D) IL-4; (E) IL-6; (F) IL-17.

Veículo Ef32 Veículo Ef32 E.M. Ef32 + E.M.

0 100 200 300 400 *** * _** ** *** DSS 3% ns ns

A

B

C

D

Veículo Ef32 Veículo Ef32 E.M. Ef32 + E.M.

0 15 30 45 60 75 90 *** *** ** *** DSS 3% # + IL -4 ( pg /m l)

Veículo Ef32 Veículo Ef32 E.M. Ef32 + E.M.

0 100 200 300 400 ** *** * DSS 3% # # # # # ns T NF - ( pg /m l)

Veículo Ef32 Veículo Ef32 E.M. Ef32 + E.M.

0 25 50 75 100 125 *** *** *** *** *** DSS 3% ns ns IL -1 2 (p g/ m l)

E

Veículo Ef32 Veículo Ef32 E.M. Ef32 + E.M.

0 20 40 60 80 100 ** * * * ** DSS 3% ns ns IL -1 7 (p g/ m l)

F

Veículo Ef32 Veículo Ef32 E.M. Ef32 + E.M.

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 *** *** *** ** DSS 3% ns ns # # IL -6 ( pg /m l)

Ao final da indução da colite experimental, o cólon dos animais foi removido, sendo parte destinada para cultura do tecido. Após a incubação, o sobrenadante foi recolhido para dosagem de citocinas por ELISA. n = 15. Os dados são representativos de três experimentos independentes. *Média significativamente diferente quando comparada ao grupo controle positivo (p < 0,05). **Média significativamente diferente quando comparada ao grupo controle positivo (p < 0,01). ***Média significativamente diferente quando comparada ao grupo controle positivo (p < 0,001). #Média significativamente diferente quando comparada ao grupo tratado com a associação Ef32 + E.M. (p < 0,05). ##Média significativamente diferente quando comparada ao grupo tratado com a associação Ef32 + E.M. (p < 0,01). ### Média significativamente diferente quando comparada ao grupo tratado com a associação Ef32 + E.M. (p < 0,001). +Média significativamente diferente quando comparada ao grupo controle negativo (p < 0,05). ns = diferença não significativa. Ef32, E. faecium 32; E.M., extrato metanólico de

5 DISCUSSÃO

A colite ulcerativa é uma doença inflamatória intestinal, caracterizada por perda de peso, diarreia e sangramento. O modelo murino da doença utilizado neste estudo mimetiza de forma eficaz a progressão destes sinais clínicos bem como as características morfológicas e patológicas (como o dano à mucosa com infiltrado inflamatório na histologia e a produção de citocinas), de modo a permitir um cenário ideal do estudo de novas terapêuticas. No modelo utilizado, o irritante químico DSS promove uma inflamação no tecido intestinal comparada ao que ocorre em humanos. No entanto, o mecanismo exato da indução e patogênese da colite induzida por este polissacarídeo sulfatado ainda não está bem compreendido (VOWINKEL et al., 2004). Acredita-se que os efeitos tóxicos diretos sobre o epitélio, permitindo a entrada de microrganismos para as camadas subsequentes com consequente estimulação do sistema imune, e a ativação direta das respostas inflamatórias dos macrófagos possam constituir os mecanismos responsáveis pela patogênese neste modelo (MAHLER et al., 1998).

Como consequência da administração do irritante químico aos animais, verificou- se que aqueles que não receberam nenhum tipo de tratamento apresentaram a partir do quarto dia de indução da colite experimental uma perda de peso progressiva e uma elevação significativa do IAD, representado também pelo sangramento nas fezes e diarreia (Figuras 4 e 5). Em outros estudos, o início da progressão dos sinais clínicos pode ser observado desde o primeiro ao quarto dia em camundongos C57BL/6 (MELGAR; KARLSSON; MICHAELSSON, 2005; SASAKI et al., 2005; VOWINKEL et al., 2004) e entre o quinto e sexto dias em camundongos BALB/c (CHUNG et al., 2008; MELGAR; KARLSSON; MICHAELSSON, 2005), sendo essa diferença atribuída à variabilidade genética existente entre as linhagens (MAHLER et al., 1998).

O agravamento dos parâmetros clínicos, no entanto, foi prevenido pelo tratamento dos animais com o potencial probiótico E. faecium 32, o qual foi capaz de abrandar os sinais clínicos, retardando o surgimento da perda de peso corporal em três dias e em um dia o início da elevação do IAD (Figuras 3 e 4). Esses achados corroboram para a possível caracterização de E. faecium 32 como probiótico de fato, cujo objetivo é promover efeitos benéficos à saúde do hospedeiro, tendo como benefício exercido por ele a prevenção do agravamento dos sinais clínicos, aliviando a sintomatologia da colite experimental, sendo este o primeiro estudo com a cepa no sentido de avaliar os seus efeitos benéficos para a saúde. É importante ressaltar que o potencial probiótico foi administrado aos animais pela via oral em período anterior à indução da colite ulcerativa para que pudesse se estabelecer em quantidades adequadas no

trato gastrintestinal e assim exercer os seus efeitos, sendo avaliado neste estudo, portanto, a sua capacidade profilática. Neste mesmo período não foram observados os efeitos adversos de diarreia ou sangramento ou qualquer efeito sobre o peso corporal dos animais (Figura 2). Este dado também contribui para o enquadramento da cepa no conceito de probiótico.

A presença de DSS no lúmen intestinal promove uma alteração da permeabilidade do epitélio pela perda de alguns componentes das junções oclusivas, como a proteína zonula

occludens 1 (ZO-1), que se inicia a partir do primeira dia de exposição (PORITZ et al., 2007).

Esse aumento da permeabilidade da barreira epitelial intestinal constitui a principal causa da diarreia encontrada neste modelo (YAN et al., 2009). Alterações na estrutura das junções oclusivas e decréscimo da expressão de ZO-1 também têm sido relatados em pacientes com colite ulcerativa (DAS et al., 2012; SCHMITZ et al., 1999). Estudos têm mostrado que algumas cepas probióticas são capazes de reforçar a função da barreira epitelial em modelos de colite ulcerativa induzida por DSS, sendo um dos mecanismos sugeridos para a melhora dos sinais clínicos apresentados nestes casos. O tratamento de camundongos submetidos ao mesmo modelo de colite com o lisado de Lactobacillus casei DN-114 001 foi capaz de reforçar a barreira epitelial por prevenir o decréscimo da expressão de ZO-1 no cólon dos animais (ZAKOSTELSKA et al., 2011). Infere-se que a cepa probiótica utilizada neste estudo pode estar atuando para a manutenção da barreira epitelial da mesma maneira, tendo em vista a redução do quadro diarreico.

O tratamento dos animais expostos à DSS com o extrato metanólico da alga marinha C. mexicana promoveu a atenuação dos sinais clínicos característicos do modelo, inclusive retardando o surgimento e protegendo os animais da perda de peso severa (Figuras 3 e 4). Esse efeito protetor é, possivelmente, resultado da sua ação sobre a redução de IFN- intestinal, o qual influencia na função barreira do epitélio e que será discutido posteriormente. Além disso, esses achados confirmaram a ação sobre a colite ulcerativa experimental do extrato metanólico obtido a partir da alga verde observada em estudo prévio realizado com camundongos BALB/c, no qual mesmo após duas semanas de exposição ao DSS foi capaz de manter peso corporal e IAD dos animais tratados em níveis similares aos dos animais do grupo controle negativo (BITENCOURT, 2011).

Adicionalmente, a associação entre E. faecium 32 e o extrato metanólico de C.

mexicana foi capaz de atenuar os sinais clínicos desenvolvidos em consequência da exposição

à DSS na mesma medida que os tratamentos utilizados isoladamente, como observado ao final da indução (Figuras 3 e 4). Porém, em se tratando do desenvolvimento dos sinais clínicos ao longo do tempo, verificou-se que quando os tratamentos foram utilizados de forma conjunta

houve um retardo ainda maior da progressão dos sinais clínicos quando comparada às terapias isoladas (Figura 4). Embora não haja efeito sinérgico quando se trata da intensidade final dos sinais clínicos, é possível que os efeitos dos componentes isolados somem-se quando associados de modo a promover tal retardo. Assim, a combinação mostra-se uma opção mais vantajosa, considerado que o prolongamento dos períodos de remissão consiste num dos principais objetivos do tratamento da colite ulcerativa (KORNBLUTH; SACHAR, 2010).

O encurtamento do cólon tem sido considerado uma medida morfométrica da severidade da inflamação intestinal e um marcador da colite experimental (SIEGMUND et al., 2001). De fato, o cólon dos animais expostos à DSS sofreu encurtamento significativo quando comparado ao dos animais não expostos. Essa diminuição do comprimento do cólon, contudo, foi atenuada de modo significativo pelos tratamentos com o potencial probiótico E. faecium 32, extrato metanólico de C. mexicana e a associação de ambos (Figura 5). Considerando tal parâmetro um reflexo do processo inflamatório intestinal, os resultados encontrados representam um indicativo de que os tratamentos utilizados constituem atenuantes da inflamação desencadeada pelo irritante químico.

Em se tratando de aspectos morfológicos, o tratamento com o extrato metanólico da alga marinha C. mexicana ou com o potencial probiótico E. faecium 32 foi capaz de atenuar de forma discreta o dano tecidual observado no cólon dos animais tratados causado pela exposição ao DSS, tendo sido a melhora mais pronunciada nos animais tratados com o extrato metanólico (Figuras 6D e 6E). Sugere-se que esse achado seja resultado de um retardo na reparação tecidual em detrimento do efeito sobre a redução das citocinas pró-inflamatórias no intestino. No entanto, de modo surpreendente, a associação das terapêuticas foi capaz de inibir completamente o dano tecidual gerado pelo DSS (Figura 6F), sugerindo que o conjunto pode ter retardado o aparecimento dos danos à mucosa e ainda acelerado o processo de reparo da injúria intestinal. Estudos baseados em cinética poderiam confirmar esta hipótese. A combinação dos efeitos gerados com o tratamento com probiótico, como o reforço na função barreira do epitélio intestinal e redução da produção de citocinas pró-inflamatórias, ao efeito de inibição da migração leucocitária mediada pelo extrato de C. mexicana parece ser responsável pelo reparo tecidual observado. Apesar da demonstração da reparação da mucosa não ser usualmente necessária para a determinação da remissão clínica em pacientes com colite ulcerativa, ela se faz importante, pois reduz o risco de displasia nestes pacientes (KORNBLUTH; SACHAR, 2010), evidenciando novamente a associação como uma opção mais vantajosa quando comparada aos tratamentos isolados.

Além dos parâmetros já discutidos, foram avaliados neste estudo os mediadores inflamatórios em nível de mucosa intestinal. Com a realização da cultura do cólon, foi possível a quantificação dos níveis de diferentes padrões de citocinas (IFN- , IL-12, TNF-α, IL-4, IL-6 e IL-17A) secretados pelo tecido colônico após o procedimento experimental, de modo a reconhecer o perfil de resposta imune no presente modelo frente aos tratamentos aplicados. Verificou-se que as concentrações das citocinas estudadas permaneceram em níveis basais nos animais não expostos à DSS, inclusive quando os animais foram tratados com a potencial cepa probiótica de maneira isolada. No entanto, notou-se que o E. faecium 32 promoveu um aumento nos níveis de IL-4 secretado no cólon quando comparado aos animais do grupo controle negativo. Apesar disso, esse comportamento não foi acompanhado pelas outras citocinas (Figura 7) ou por qualquer alteração indicativa de inflamação na análise histológica (Figura 6). A presença de linfócitos intraepiteliais e da lâmina própria produtores de IL-4 tem sido relatada no cólon de indivíduos saudáveis e relacionada com a homeostase da mucosa intestinal (CAROL et al., 1998), de modo que o aumento de IL-4 na mucosa intestinal dos animais tratados com o potencial probiótico neste estudo poderia também contribuir para a homeostase intestinal (CHEN et al., 2009) sem, todavia, induzir a inflamação, como de fato comprovado pela apresentação normal do tecido.

A exposição da mucosa intestinal à DSS promove uma série de alterações nos padrões de citocinas expressos no cólon. Em um estudo realizado com camundongos C57BL/6, foi observado um aumento significativo na expressão de IFN- , IL-1 , IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α e da quimiocina derivada de queratinócito (KC/CXCL2, homólogo murino da IL-8/CXCL8 humana) no cólon dos animais após cinco dias de tratamento com DSS, sendo que a produção de IFN- , IL-1 , IL-10, IL-12 e TNF-α apresentou aumento significativo ainda no primeiro dia de exposição (YAN et al., 2009). Em outro estudo, verificou-se também um aumento na expressão de IL-6, IL-17, KC/CXCL2 e TNF-α no cólon de camundongos C57BL/6 submetidos à colite aguda por DSS, mostrando que a inflamação aguda exibiu um perfil Th1-Th17 que foi alterado para uma resposta inflamatória predominantemente Th2 na fase crônica, com aumento da expressão de IL-4 e IL-10 e decréscimo concomitante dos níveis de IL-6, IL-17, KC/CXCL2 e TNF-α (ALEX et al., 2009).

Assim como ocorre para os modelos animais, os estudos realizados a partir de amostras humanas apresentam uma variabilidade de resultados no que se refere ao padrão de citocinas envolvido. Olsen et al. (2011) observaram aumento da expressão de IFN- , IL-17A, IL-23, IL-6 e TGF- em biópsia da mucosa colônica de pacientes com colite ulcerativa, apontando para um predominância dos padrões de resposta Th1-Th17. Em um estudo

realizado por Tsukada et al. (2002) também com pacientes com a doença inflamatória intestinal, houve padrões distintos de citocinas expressas em biópsias da mucosa do cólon de acordo com a severidade da doença atribuída ao paciente: pacientes com alto índice de atividade da doença mostraram alta expressão de IL-8/CXCL8, enquanto que pacientes com baixo índice apresentaram alta expressão de IFN- , IL-4 e TNF-α (Th1-Th2).

Neste estudo, em contrapartida aos níveis basais encontrados nos animais sadios, a exposição da mucosa intestinal à DSS, na ausência de qualquer tratamento, promoveu um aumento significativo dos níveis de todas as citocinas pesquisadas (IFN- , IL-12, TNF-α, IL- 6, IL-17A e IL-4,), indicando que além do perfil Th1-Th17 observado em outros estudos (ALEX et al., 2009; MELGAR; KARLSSON; MICHAELSSON, 2005; YAN et al., 2009), o perfil Th2 também se fez presente.

O aumento dos níveis de todas as citocinas, exceto de TNF-α, foi revertido quando os animais foram pré-tratados com E. faecium 32 (Figura 7). O uso de probióticos para o tratamento da colite ulcerativa tanto em modelos animais como em humanos tem promovido efeitos sobre a secreção/expressão de citocinas tanto no ambiente da mucosa intestinal como no soro. Lactobacillus delbruekii e Lactobacillus fermentum foram capazes de reduzir os níveis de IL-6 e TNF-α do cólon de pacientes com colite ulcerativa, sendo esse decréscimo provavelmente resultado da redução da ativação de NF-κB (HEGAZY; EL- BEDEWY, 2010). Em um modelo murino de colite experimental por transferência de células,

Lactobacillus paracasei ST11 reduziu a inflamação intestinal, tendo reduzido a expressão de

IL-1 , IL-6 e IL-12 no cólon dos animais (OLIVEIRA et al., 2011). Outro estudo apontou ainda que a presença de Bifidobacterium infantis em uma cultura de cólon ex vivo exposta à DSS causou a redução dos níveis de IL-17 no sobrenadante, sendo provavelmente resultado da indução da produção de IL-10 pelo probiótico (TANABE; KINUTA; SAITO, 2008).

Os efeitos terapêuticos dos probióticos utilizados nestes estudos se devem, de um modo geral, à atenuação das respostas Th1 e Th17 inflamatórias, refletida pela redução dos níveis de citocinas expressos na mucosa intestinal, ou à indução de uma resposta T regulatória, representada pelo aumento da citocina anti-inflamatória IL-10. No entanto, os mecanismos exatos desses efeitos ainda não foram completamente elucidados. A redução da ativação de NF-κB parece ser um importante mecanismo de diminuição da expressão de mediadores inflamatórios. Esse fator de transcrição é normalmente encontrado no citoplasma das células conjugado à proteína inibitória IκB, cuja fosforilação após a transdução de sinais de natureza inflamatória desencadeia a sua degradação via proteossomo, liberando a transferência de NF-κB para o núcleo celular. Lá o NF-κB desencadeia a transcrição de genes

envolvidos com a resposta inflamatória, incluindo os genes codificantes de citocinas pró- inflamatórias (PASPARAKIS, 2009). A ativação de NF-κB no tecido inflamado de pacientes com colite ulcerativa (HEGAZY; EL-BEDEWY, 2010) e a capacidade de inibição dessa ativação por cepas probióticas fazem deste tipo de terapia uma alternativa promissora livre de efeitos adversos para o tratamento da doença.

Um estudo realizado com células intestinais de porcos verificou que o probiótico

Lactobacillus jensenii TL2937 foi capaz de atenuar a expressão de citocinas pró-inflamatórias

(IL-1α, IL-6 e IL-8/CXCL8) por reduzir a ativação de NF-κB e da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) mediada pela sinalização iniciada pelo TLR4 em resposta ao LPS. A redução da ativação da via de sinalização MAPK se deu pela atenuação da fosforilação de p38, importante componente desta via, sendo esse efeito parcialmente mediado pelo TLR2, do qual L. jensenii TL2937 é um potente estimulador. A inibição da sinalização de MAPK e NF- κB pelo probiótico também parece ser resultado do aumento da expressão dos seus inibidores MAPK fosfatase-1 (MKP-1), A20 e Bcl-3, sendo o aumento dos dois últimos mediado pela estimulação de TLR2 (SHIMAZU et al., 2012). Em outro estudo, um muramil dipeptídeo (MDP), subproduto da digestão do peptideoglicano, promoveu a inibição da colite experimental de modo dependente de NOD2 e reduziu a produção de citocinas pró- inflamatórias (IFN- , IL-6, IL-12 e TNF-α) em resposta aos ligantes de diferentes TLRs por inibir a ativação de NF-κB (WATANABE et al., 2008).

Considerando que, por ser uma bactéria Gram positiva, portanto dotada de peptideoglicanos e MDP em sua parece celular, é possível que a potencial cepa probiótica utilizada neste estudo tenha o mecanismo de ação relacionado com a sua afinidade ao TLR2 e NOD2 expresso ao longo do epitélio intestinal e nas células imunes localizadas na mucosa. A estimulação de TLR2 e/ou NOD2, por sua vez, produziria efeitos inibitórios nas vias de sinalização subjacentes como já demonstrado para outros probióticos (PLANTINGA et al., 2011; SHIDA et al., 2009; WATANABE et al., 2008), com redução da produção inicial das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e IL-12 observada neste estudo. Estudos da interação entre E.

faecium 32 e TLR2/NOD2 e seus efeitos sobre a sinalização NF-κB e MAPK, no entanto,

precisam ser realizados para a confirmação desta hipótese.

A redução nos níveis de IFN- (Figura 7A), por sua vez, compreende provavelmente uma consequência do decréscimo de IL-12 no intestino, uma vez que essa é a principal molécula estimuladora da secreção de IFN- por células TCD4+ do padrão de resposta Th1. A importância do IFN- no modelo de inflamação intestinal induzida por DSS foi relatada em estudos com animais deficientes na sua expressão (IFN- -/-) (ITO et al., 2006).

Seu papel neste modelo está relacionado com seus efeitos deletérios sobre as junções oclusivas que mantêm a barreira epitelial tanto por induzir o decréscimo da expressão das proteínas componentes destas junções como por promover a internalização destas em vacúolos revestidos por actina (BRUEWER et al., 2003; CHIBA et al., 2006; MADARA; STAFFORD, 1989; UTECH et al., 2005). Desta forma, o E. faecium 32 poderia estar atuando indiretamente na manutenção da função barreira da mucosa intestinal por promover a redução de IFN- em camundongos submetidos ao modelo de colite ulcerativa induzido por DSS.

O decréscimo dos níveis de IL-17A (Figura 7F) na mucosa intestinal dos animais tratados com o potencial probiótico é provavelmente uma consequência da redução dos níveis de IL-6 intestinal (Figura 7E), uma vez que esta citocina (na presença de TGF- normalmente expresso no ambiente da mucosa intestinal) é a molécula indutora da diferenciação de células Th17 (DONG, 2008). Dessa forma, o decréscimo de IL-6 pode ter favorecido a redução da quantidade de células Th17 secretoras de IL-17A na mucosa do cólon, contribuindo para a redução desta citocina no ambiente intestinal.

A redução de células Th17 neste ambiente pode também ter sido resultado da ação de células T regulatórias, como tem sido demonstrado para outras bactérias probióticas (MAZMANIAN; ROUND; KASPER, 2008). Bifidobacterium breve Yakult YIT10347, por exemplo, mostrou-se capaz de melhorar a inflamação intestinal de camundongos submetidos ao modelo murino de colite por transferência de células devido à indução de células T regulatórias do tipo 1 (Tr1) produtoras de IL-10; essa indução foi mediada por células dendríticas intestinais CD103+ de maneira TLR2/MyD88-dependente (JEON et al., 2012). Em outro estudo, o polissacarídeo A (PSA), componente da superfície de Bacterioides fragilis