SPE, NP-HPLC, FIA ve Ag + HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı I., II.

-D & 2nd-D & 3rd-D) analizleri

SPE, NP-HPLC, FIA ve Ag+-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı I., II. ve III. boyut ayrım analizleri; sistem üzerinde 5 temel aĢamanın sırasıyla uygulanması ile, oluĢturulan tek bir analiz programının kontrolünde gerçekleĢtirilmektedir. Kullanılan yazılım ve yapılan uygun programlama yardımıyla, bu aĢamalar tek bir analiz metodunda birleĢtirilerek uygulanabilmektedir (ġekil 3.12; 3.13; 3.14; 3.15 ve 3.16). Uygulanan metot parametreleri & programlaması Çizelge 3.14’de detaylı olarak yer almaktadır.

I. aĢama// SPE tekniğinin uygulandığı I. boyut ayrım basamağı. Hekzan ile

hazırlanan yağ numunesi, gradient pompa (I) ve otomatik enjektör (II) vasıtasıyla sisteme enjekte edilir. Enjeksiyon iĢleminin ardından termostatlı kolon fırınından geçen numune, seçilen uygun pozisyon ile yönlendirme valf-I (6PT/2PS) (III) üzerine adapte edilen diol yapılı SPE kolona (IV) gönderilir. %100 nötral A hareketli fazı kullanılarak gradient program baĢlatılır ve lipit türlerinin SPE kolon (IV) üzerinde ayrımı sağlanır. Yağ numunesindeki nötral lipit fraksiyonun, II. boyut ayrım aĢaması öncesinde polar lipitlerden tamamen izole edilerek ayrımı sağlanır. SPE kolon (IV) üzerinde izole edilen ilk fraksiyon yani nötral lipit fraksiyonu, 2nd

-D HPLC kolonuna (VIII) ulaĢtığı anda valf-I (6PT/2PS) sisteminin pozisyonu değiĢtirilir. Valf pozisyonunun değiĢmesi ile; SPE kolon (IV) üzerinde devam eden I. boyut ayrım analizinin; nötral lipit fraksiyonun tamamen izole edildiği, polar fraksiyonun ise ileriki aĢamada ayrımı sağlanmak üzere kolonda bırakıldığı aĢamada kesilmesi sağlanır. Bu esnada; nötral lipit fraksiyonu devam eden akıĢla birlikte, II. boyut ayrım analizlerinin gerçekleĢtirildiği 2nd

-D HPLC kolonuna (VIII) ulaĢmıĢ olur (ġekil 3.12).

ġekil 3. 12. SPE, NP-HPLC, FIA ve Ag+

-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı I., II. ve III. boyut ayrım analizleri için I. aĢama iĢleyiĢine ait Ģematik gösterim

II. aĢama// NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II. boyut ayrım basamağı. Nötral lipit

fraksiyonun, içerisinde mevcut lipit türlerine (trigliserit, tokoferol, tokotrienol, FFA,

sterol, digliserit, monogliseritlere) ayrımı için, diol yapılı 2nd-D HPLC kolona (VIII) ulaĢmasıyla birlikte; II. boyut ayrım aĢamasına tamamen geçiĢ sağlanır. II. boyut ayrım aĢamasında; gradient pompa (I) üzerinde oluĢturulan nötral lipit hareketli faz gradient programı ile, nötral lipit A ve B çözücüleri sisteme gönderilir. Valf-I (6PT/2PS) (III) sistemi için seçilen uygun pozisyonla sağlanan bu iĢlem; 2nd

-D HPLC kolonu (VIII) üzerinde nötral lipit fraksiyondaki türlerin ayrımını sağlamaktadır. II. boyut ayrım aĢamasında elde edilen veriler/kromatogramlar; I. boyut ayrımda olduğu gibi ELS dedektörde (VII) gözlenmekte ve alıkonma süreleri tespit edilmektedir. ELSD sisteminde (VII); TG, tokol, FFA, sterol, DG ve MG piklerine ait alıkonma sürelerinin tespitinin ardından; bu bileĢiklerin her birisinde mevcut türlerin ayrım aĢamasına; yani III. boyut ayrım analizlerine sırayla geçiĢ yapılır (ġekil 3.13).

ġekil 3. 13. SPE, NP-HPLC, FIA ve Ag+_{-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı I., II. ve III. boyut}

ayrım analizleri için II. aĢama iĢleyiĢine ait Ģematik gösterim

III. aĢama// Ag+

-HPLC tekniğinin uygulandığı III. boyut ayrım basamağı. III.

boyut ayrım analizleri için; 2nd

-D HPLC kolonu (VIII) ile ayrımı sağlanan nötral lipitlerin, alıkonma süreleri dikkate alınarak valf-III (10PT/2PS) (IX) üzerine adapte edilen FIA loop sistemlerine (XI) sırayla yönlendirilmeleri ve fraksiyonlar Ģeklinde toplanmaları sağlanır. Loop sistemlerine nötral lipit fraksiyonlarının toplanmaya baĢlaması ile birlikte; valf-III (10PT/2PS) (IX) ve valf-II (6PT/2PS) (V) pozisyonu değiĢtirilir, pompa (I) durdurulur, pompa (X)’nın iĢler hale gelmesi sağlanır. Bu aĢama ile birlikte; III. boyut ayrım aĢaması baĢlatılmıĢ olur. Loop sistemlerinde toplanan nötral lipit bileĢiklerinin, kendi türlerine ayrımını sağlayacak uygun hareketli faz sistemleri, gradient pompa (X) ile sisteme gönderilir. Toplanan fraksiyonların, akıĢ içerisine enjeksiyonu (FIA) Ģeklinde gerçekleĢtirilen III. boyut analizlerinde; Ag+

-HPLC tekniğinin uygulandığı 3rd

-D HPLC kolonu (XII) ve ELSD sistemi (VII) devreye konulmaktadır (ġekil 3.14).

ġekil 3. 14. SPE, NP-HPLC, FIA ve Ag+-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı I., II. ve III. boyut ayrım analizleri için III. aĢama iĢleyiĢine ait Ģematik gösterim

IV. aĢama// NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II. boyut ayrım aĢamasında kalan türlerin tayini. III. boyut ayrım analizlerinin, trigliserit fraksiyonu uygulanmasının

ardından; 2nd

-D HPLC kolonu (VIII) ile lipitlerin tayin aĢamasına tekrar geçiĢ yapılır. II. aĢamada; 2nd

-D HPLC kolonunda lipit türlerinin, valf-III (10PT/2PS) (IX) üzerine adapte edilen FIA loop sistemlerine (XI) sırayla yönlendirilmesi sağlanmıĢtı. Bu iĢlemler esnasında; II. boyut ayrım aĢamasında uygulanan gradient programa, türlerin alıkonma süresine göre ara verilmiĢ ve bazı türlerin daha sonra analiz edilmek üzere 2nd

- D HPLC kolonunda bekletilmesi sağlanmıĢtı. Bekletilen türlerin tayini için; nötral gradient program, bırakıldığı yerden gradient pompa (I) vasıtasıyla tekrar devreye konulmuĢtur (ġekil 3.15).

ġekil 3. 15. SPE, NP-HPLC, FIA ve Ag+_{-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı I., II. ve III. boyut}

ayrım analizleri için IV. aĢama iĢleyiĢine ait Ģematik gösterim

V. aĢama// SPE tekniğinin uygulandığı I. boyut ayrım aĢamasında kalan türlerin tayini. Sistem iĢleyiĢinin son aĢamasında; bir önceki aĢamada olduğu gibi I. boyut

ayrım aĢamasında ara verilen/ kesilen analiz basamağına geri dönülerek, SPE kolonda

(IV) kalan lipit türlerinin tayini sağlanmıĢtır. Valf-I (6PT/2PS) (III) sistemi için uygun

pozisyon seçilmiĢ ve gradient pompa (I) vasıtasıyla nötral gradient programın kaldığı yerden devreye konulması sağlanmıĢtır. SPE kolon (IV) üzerinde bekletilen polar lipit fraksiyonun (fosfolipitlerin) analizi için, sistemin ilk halindeki programlamaya geçmesi sağlanarak, sistem iĢleyiĢi tamamlanmıĢtır (ġekil 3.16). Sistem iĢleyiĢinin tamamlanmasıyla birlikte; birçok yağ analizinin ön iĢlem basamağında yer alan katı faz ekstraksiyon (SPE) tekniğinin, akıĢ enjeksiyon analiz (FIA) ve yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) sistemlerine entegrasyonu sağlanmıĢtır. Böylece yağlarda mevcut türlerin tek bir enjeksiyon ile 3 boyutlu kromatografik tayinleri için, numune ön iĢlemlerinin otomatik olarak gerçekleĢtirilebildiği ve analizci müdahalesinin en aza indirilmesi ile daha kısa sürede, tekrarlanabilirliği yüksek sonuçların elde edilebildiği; on-line SPE-FIA-HPLC yağ analiz sisteminin oluĢturulması ve sistem üzerinde yeni analiz metotlarının geliĢtirilip/uygulanabilirlik kazanması sağlanmıĢtır.

ġekil 3. 16. SPE, NP-HPLC, FIA ve Ag+-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı I., II. ve III. boyut ayrım analizleri için V. aĢama iĢleyiĢine ait Ģematik gösterim

3.4.6.1. Valf pozisyonlarının değiĢtirilme sürelerinin etkisi

BirleĢtirilmiĢ analiz sistemlerinde; fraksiyonların bir sonraki ayrım aĢamasına aktarılma prosedürlerinin iyileĢtirilmesi amacıyla, valf sistemi pozisyonlarının değiĢtirilme sürelerine iliĢkin optimizasyon çalıĢmaları gerçekleĢtirilmiĢtir (Çizelge 3.15).

Çizelge 3. 15. SPE,NP-HPLC, FIA ve Ag+-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı I.,II. ve III. boyut ayrım analizleri için kullanılan parametreler SPE, NP-HPLC, FIA ve Ag+-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı I., II. ve III. boyut ayrım analizleri için kullanılan parametreler

Türü Miktarı Bitkisel yağ numuneleri ve lipit standart maddeler 0.1 mg yağ/ µL çözücü, farklı konsantrasyonlardaki standart maddeler

Enjeksiyon Otomatik enjeksiyon, 5 µL

Çözücü türü Hekzan S A B ĠT F A Z Türü ve Özelliği 1 st

-D SPE kolon; LiChrospher 100A Diol kolon (5µm 75x4.0mm)

2nd-D HPLC kolon; LiChrospher 100A Diol kolon (5µm 75x4.0mm)+LiChrospher 100A Diol kolon (5µm 250x4.0mm) 3rd-D HPLC kolon; ChromSpher 5 Lipids kolon (5µm 250x4.6mm)

H A R E K E T L Ġ F A Z Çözücü sistemi (HPLC saflıkta)

Nötral lipid hareketli faz A: Hekzan: asetik asit (99:1.0, v/v/v)

Nötral lipid hareketli faz B: Hekzan: izopropanol: asetik asit (84:15:1.0, v/v/v)

3rd-D boyut ayrım aĢaması için: Hekzan (A), Hekzan:Ġzop:ACN, (75: 22.5: 2.5, v/v/v) (B)

1. ve 2. HPLC pompanın birlikte kullanılmasıyla uygulanan gradient program

Nötral A Nötral B Hekzan (A) Hekzan:Ġzop:ACN (B)

1.pompa 0. dk % 100 % 0 %0 %0

1.pompa 1.5. dk % 100 % 0 %0 %0

1.pompa 1.6. dk %100 %0 %0 %0

1.pompa 6.1. dk %82.4 %17.6 %0 %0

I. HPLC pompa durdurulur, II. HPLC pompa devreye konulur.

2.pompa 6.1 dk %0 %0 %100 %0 2.pompa 16.1 dk %0 %0 %100 %0 2.pompa 38.1 dk %0 %0 %82 %18 2.pompa 43.1 dk %0 %0 %65 %35 2.pompa 46.1 dk %0 %0 %0 %100 2.pompa 49.1 dk %0 %0 %0 %100 2.pompa 56 dk %0 %0 %100 %0

II. HPLC pompa durdurulur, I. HPLC pompa devreye konulur.

1.pompa 56.1 dk %82.4 %17.6 %0 %0 1.pompa 77.6.dk %0 %100 %0 %0 1.pompa 78.6. dk %0 %100 %0 %0 1.pompa 81.6 dk %100 %0 %0 %0 1.pompa 83.6. dk %100 %0 %0 %0 1.pompa 83.7.dk %100 %0 %0 %0 1.pompa 107.7 dk %0 %100 %0 %0 1.pompa 108.7 dk %0 %100 %0 %0 1.pompa 111.7 dk %100 %0 %0 %0 1.pompa 113.7 dk %100 %0 %0 %0

Kolon Fırını Sıcaklık 30 - 35°C AkıĢ Hızı: 1 mL/dk

Valf Sistemi Pozisyonu

Süre Valf -1 (6 PT/2 PS Valf) Valf -2 (6 PT/2 PS Valf) Valf -3 (10 PT/2 PS Valf)

0 - 1.5 dk arası P2 P1 P2

1.5 -6.1 dk arası P1 P1 P2

6.1 - 56.1 dk arası P1 P2 P1

56.1 -83.7 dk arası P1 P2 P1

83.7 – 113.7 dk arası P2 P1 P2

SPE, NP-HPLC, FIA ve Ag+-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı I., II. ve III. boyut ayrım analizleri için tespit edilen optimum metot programlaması

I. gradient pompaya ait programlama

 0. dk- 1,5. dk  SPE tekniğinin uygulandığı I. boyut ayrım aĢaması

 1,5. dk- 6,1. dk  NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II. boyut ayrım aĢaması

 6,1. dk- 56,1. dk  Aktif değil

 56,1. dk- 83,7. dk  NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II. boyut ayrım aĢamasında kalan türlerin tayin basamağı

 83,7. dk- 113,7. dk  SPE tekniğinin uygulandığı

I. boyut ayrım aĢamasında kalan türlerin tayin basamağı

II. gradient pompaya ait programlama

 0. dk- 6,1. dk  Aktif değil

 6,1. dk- 56,1. dk  Ag+_{-HPLC tekniğinin}

uygulandığı III. boyut ayrım basamağı  56,1. dk- 113,7. dk  Aktif değil

Valf sistemi- I (6PT/2PS) e ait programlama

 1,5. dk  SPE tekniğinin uygulandığı I. boyut ayrım aĢamasından NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II. boyut ayrım aĢamasına geçiĢ

 83,7. dk  SPE tekniğinin uygulandığı I. boyut ayrım aĢamasında kalan türlerin tayin basamağına geçiĢ

Valf sistemi- II (6PT/2PS) e ait programlama

 6. dk  NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II.

boyut ayrım aĢamasından Ag+

-HPLC tekniğinin uygulandığı III. boyut ayrım basamağına geçiĢ  56,1. dk  NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II.

boyut ayrım aĢamasında kalan türlerin tayin basamağına geçiĢ

Valf sistemi- III (10PT/2PS) e ait programlama

 6. dk  NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II.

boyut ayrım aĢamasından Ag+

-HPLC tekniğinin uygulandığı III. boyut ayrım basamağına geçiĢ

 56,1. dk  NP-HPLC tekniğinin uygulandığı

II. boyut ayrım aĢamasında kalan türlerin tayin basamağına geçiĢ