NP-HPLC, FIA ve Ag + HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı II ve III.

-D & 3rd-D) analizleri

NP-HPLC, FIA ve Ag+-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı analizlerde; öncelikle 2nd

-D HPLC kolonda ayrılan nötral lipit türlerinin (trigliserit, tokol, FFA,

sterol, digliserit ve monogliserit) alıkonma süreleri dikkate alınarak, valf-III

(10PT/2PS) üzerine adapte edilen FIA loop sistemlerine sırayla yönlendirilmesi ve fraksiyonlar halinde toplanması sağlanır. Loop sistemlerine fraksiyonların toplanmaya baĢlaması ile birlikte; valf-III (10PT/2PS) pozisyonu değiĢtirilir, I. pompa durdurulur ve II. pompanın iĢler hale gelmesi sağlanır. Bu aĢama ile birlikte; III. boyut ayrım aĢaması baĢlatılmıĢ olur. Loop sistemlerinde toplanan nötral lipit fraksiyonlarının kendi türlerine ayrımını sağlayacak uygun hareketli faz sistemleri, II. gradient pompa ile sisteme gönderilir. Toplanan fraksiyonların, akıĢ içerisine direk enjeksiyonu, FIA Ģeklinde gerçekleĢtirilen III. boyut analizlerinde; analiz edilecek türlere uygun seçilen 3rd

-D HPLC kolonu, ELSD, DAD, FLD yada RID sistemi devreye konulmaktadır (ġekil 3.11).

NP-HPLC, FIA ve RP-HPLC yada NP-HPLC, FIA ve Ag+-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı II. ve III. boyut ayrım (2nd

-D & 3rd-D) analizlerde; uygulanan metot parametreleri & programlama Çizelge 3.13 ve 3.14’de detaylı olarak yer almaktadır. Analizler için, optimize edilen baĢlıca deneysel parametreler;

− Sabit faz türü − Harekeli faz türü − AkıĢ hızı

− Sıcaklık

ġekil 3. 11. NP-HPLC, FIA ve Ag+_{-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı II. ve III. boyut ayrım analizleri için On-line SPE-FIA-HPLC yağ analiz sisteminin}

Çizelge 3. 13. NP-HPLC, FIA ve RP-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı II. ve III. boyut ayrım (çok boyutlu ayrım) analizleri için kullanılan parametreler NP-HPLC, FIA ve RP-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı II. ve III. boyut ayrım (çok boyutlu ayrım) analizleri için kullanılan parametreler

NU

MUNE

Türü Bitkisel yağ numuneleri ve lipit standart maddeleri

Miktarı 0.1 mg yağ/ µL çözücü, farklı konsantrasyonlardaki standart maddeler

Enjeksiyon Otomatik enjeksiyon, 5 µL

Çözücü türü Hekzan

S

ABĠ

T

FAZ Türü ve Özelliği

SPE kolon; Inertsil Sil 100A kolon (5µm 50x4.6mm)

2nd-D HPLC kolon; LiChrospher 100A Diol kolon (5µm 75x4.0mm)+ LiChrospher 100A Diol kolon (5µm 250x4.0mm) 3rd-D HPLC kolon; ACE C18 kolon (5µm 250x4.6mm)

H AR EK ETLĠ FAZ Çözücü sistemi (HPLC saflıkta)

Nötral lipid hareketli faz A: Hekzan: asetik asit (99:1.0, v/v/v)

Nötral lipid hareketli faz B: Hekzan: izopropanol: asetik asit (84:15:1.0, v/v/v)

3rd-D ayrım aĢaması için: Trigliserit analizi için seçilen çözücü sistemi; Aseton: Asetonitril (50:50, v/v)

1. ve 2. HPLC pompanın birlikte kullanılmasıyla uygulanan gradient program

*** Valf pozisyonlarının değiştirilme süresi 7. dakika esas alınarak oluşturulan programlama

Nötral A Nötral B Aseton:ACN, (50:50, v/v)

1.pompa 0. dk % 100 % 0 %0

1.pompa 7. dk % 72 % 28 %0

I. HPLC pompa durdurulur, II. HPLC pompa ve Refraktif indeks dedektör (RID) devreye konulur.

2.pompa 7.1 dk %0 %0 %100

2.pompa 37.1 dk %0 %0 %100

II. HPLC pompa durdurulur, I. HPLC pompa ve ELSD dedektör devreye konulur.

1.pompa 38.dk %100 %0 %0 1.pompa 63.dk %0 %100 %0 1.pompa 64. dk %0 %100 %0 1.pompa 67 dk %100 %0 %0 1.pompa 69. dk %100 %0 %0 AKIġ HIZI: 1 mL/dk Kolon Fırını Sıcaklık 40°C

Valf Sistemi Pozisyonu

Süre Valf -1 (6 PT/2 PS Valf) Valf -2 (6 PT/2 PS Valf) Valf -3 (10 PT/2 PS Valf)

0 - 7 dk arası P1 P1 P2 7.1 - 38 dk arası P1 P1 P1 39 -69 dk arası P1 P1 P2 E L SD v e RID BuharlaĢtırma sıcaklığı 40°C Nebülizasyon sıcaklığı 80°C

Çizelge 3. 14. NP-HPLC, FIA ve Ag-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı II. ve III. boyut ayrım (çok boyutlu ayrım) analizleri için kullanılan parametreler NP-HPLC, FIA ve Ag+-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı II. ve III. boyut ayrım (çok boyutlu ayrım) analizleri için kullanılan parametreler

NU

MUNE

Türü Bitkisel yağ numuneleri ve lipit standart maddeleri

Miktarı 0.1 mg yağ/ µL çözücü, farklı konsantrasyonlardaki standart maddeler

Enjeksiyon Otomatik enjeksiyon, 5 µL

Çözücü türü Hekzan

S

ABĠ

T

FAZ Türü ve Özelliği

SPE kolon; Inertsil Sil 100A kolon (5µm 50x4.6mm)

2nd-D HPLC kolon; LiChrospher 100A Diol kolon (5µm 75x4.0mm) + LiChrospher 100A Diol kolon (5µm 250x4.0mm) 3rd-D HPLC kolon; ChromSpher 5 Lipids kolon (5µm 250x4.6mm kolon)

H AR EK ETLĠ FAZ Çözücü sistemi (HPLC saflıkta)

Nötral lipid hareketli faz A: Hekzan: asetik asit (99:1.0, v/v/v)

Nötral lipid hareketli faz B: Hekzan: izopropanol: asetik asit (84:15:1.0, v/v/v)

3rd-D ayrım aĢaması için: TG analizi için seçilen çözücü sistemi; Hekzan (A), Hekzan:Ġzop:ACN, (75: 22.5: 2.5, v/v/v)

1. ve 2. HPLC pompanın birlikte kullanılmasıyla uygulanan gradient program

*** Valf pozisyonlarının

değiştirilme süresi 5,5 dakika esas alınarak oluşturulan programlama

AkıĢ Hızı: 1 mL/dk

Nötral A Nötral B Hekzan (A) Hekzan:Ġzop:ACN (B)

1.pompa 0. dk % 100 % 0 %0 %0

1.pompa 5.5. dk % 78 % 22 %0 %0

I. HPLC pompa durdurulur, II. HPLC pompa devreye konulur.

2.pompa 5.6 dk %0 %0 %100 %0 2.pompa 15.6 dk %0 %0 %100 %0 2.pompa 37.6 dk %0 %0 %82 %18 2.pompa 42.6 dk %0 %0 %65 %35 2.pompa 45.6 dk %0 %0 %0 %100 2.pompa 46.6 dk %0 %0 %0 %100 2.pompa 47.5 dk %0 %0 %100 %0

II. HPLC pompa durdurulur, I. HPLC pompa devreye konulur.

1.pompa 47.5.dk %78 %22 %0 %0 1.pompa 67.5.dk %0 %100 %0 %0 1.pompa 68.5. dk %0 %100 %0 %0 1.pompa 71.5 dk %100 %0 %0 %0 1.pompa 73.5. dk %100 %0 %0 %0 Kolon Fırını Sıcaklık 40°C

Valf Sistemi Pozisyonu

Süre Valf -I (6 PT/2 PS Valf) Valf -II (6 PT/2 PS Valf) Valf -III (10 PT/2 PS Valf)

0 - 5.5 dk arası P1 P2 P1

5.6 - 47.5 dk arası P1 P1 P2

47.5 – 73.5 dk arası P1 P2 P1

ELS

D BuharlaĢtırma sıcaklığı 40°C Nebülizasyon sıcaklığı 80°C

NP-HPLC, FIA ve Ag+-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı II. ve III. boyut ayrım analizleri için tespit edilen optimum metot programlaması

I. gradient pompaya ait programlama

 0. dk- 5,5. dk  NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II. boyut ayrım aĢaması

 5,6 dk- 47,5. dk  Aktif değil

 47,5. dk- 73,5. dk  NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II. boyut ayrım aĢamasında kalan türlerin tayin basamağı

II. gradient pompaya ait programlama

 0. dk- 5,5. dk  Aktif değil

 5,6. dk- 47,5. dk  Ag+_{-HPLC tekniğinin}

uygulandığı III. boyut ayrım basamağı  47,5. dk- 73,5. dk  Aktif değil

Valf sistemi- II (6PT/2PS) e ait programlama

 5,6. dk  NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II.

boyut ayrım aĢamasından Ag+

-HPLC tekniğinin uygulandığı III. boyut ayrım aĢamasına geçiĢ  47,5. dk  NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II.

boyut ayrım aĢamasında kalan türlerin tayin basamağına geçiĢ

Valf sistemi- III (10PT/2PS) e ait programlama

 5,6. dk  NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II.

boyut ayrım aĢamasından Ag+_{-HPLC tekniğinin}

uygulandığı III. boyut ayrım aĢamasına geçiĢ  47,5. dk  NP-HPLC tekniğinin uygulandığı II.

boyut ayrım aĢamasında kalan türlerin tayin basamağına geçiĢ

3.4.5.1. Sabit ve hareketli faz türü etkisi

Sabit faz yapısının etkisinin incelendiği birleĢtirilmiĢ II. ve III. boyut ayrım analizi uygulamalarında; 3rd-D HPLC kolonu olarak ACE C18 kolon (5µm 250x4.6mm) ve ChromSpher 5 Lipids kolon (5µm 250x4.6mm) kullanılarak etkileri incelenmiĢtir. Hareketli faz yapısının etkisinin incelendiği II. ve III. boyut birleĢtirilmiĢ ayrım analizi uygulamalarında ise; ACE C18 kolon (5µm, 250x4.6mm) kullanıldığında Aseton:ACN

(50:50, v/v) hareketli faz sistemi; ChromSpher 5 Lipids kolon (5µm, 250x4.6mm)

kullanıldığında Hekzan (A), Hekzan:İzopropanol:ACN, (75: 22.5: 2.5, v/v/v) (B)

gradient programı ile analizler yürütülmüĢtür. Kullanılan sabit ve hareketli fazların,

ayrımlar üzerine olan etkileri incelenmiĢtir (Çizelge 3.13 ve 3.14).

3.4.5.2. Valf pozisyonlarının değiĢtirilme sürelerinin etkisi

ġekil. 3.11'de yer alan analiz sisteminde, yönlendirme valf sistemi-II ve III' e ait pozisyonların değiĢtirilme sürelerine iliĢkin optimizasyon çalıĢmaları gerçekleĢtirilmiĢtir. Hekzan çözücü sisteminde hazırlanan farklı bitkisel yağ numuneleri kullanılarak, farklı sürelerde valf pozisyonları değiĢtirilerek analizler yürütülmüĢtür (Çizelge 3.13 ve 3.14).

3.4.6. SPE, NP-HPLC, FIA ve Ag+-HPLC tekniğinin birleĢtirilerek uygulandığı I.,