Çok boyutlu ayırma yöntemleri

Çok boyutlu ayırma yöntemleri; kompleks bir karıĢım içerisindeki bileĢenlerin tayini için uygulanan farklı ayırma mekanizmalarının/tekniklerinin (ekstraksiyon, kromatografi, spektroskopi,…gibi) birleĢtirilmesiyle oluĢturulan hibrit yöntemleri ifade etmektedir. Çok boyutlu ayırma yöntemleri ile, kompleks yapılı bileĢenlerden oluĢan numuneler için farklı ayırma mekanizmaları uygulanarak kısa sürede, yüksek oranda iyileĢtirilmiĢ ayrımların elde edilebildiği analizler gerçekleĢtirilebilmektedir (UKEssays, 2015).

Çok boyutlu ayrım analizleri; en az iki farklı tekniğinin tek bir sistem üzerinde eĢ zamanlı uygulandığı modern analiz sistemleri ile gerçekleĢtirilmektedir. Çok boyutlu (MD) sıvı kromatografi-kütle spektroskopisi (LC-MS), kapiler elektroforez-kütle spektroskopisi (CE-MS), sıvı kromatografi-nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (LC-NMR) gibi tekniklerin birleĢtirilmesi sonucu oluĢturulan modern analiz sistemleri, özgün analitik yöntemlerin geliĢtirilmesi bakımından önem arz etmektedir. Örneğin, yaygın uygulaması bulunan HPLC-MS birleĢtirilmiĢ sisteminde kromatografi tekniği ile bileĢenlerin farklı fizikokimyasal özellikleri esas alınarak güçlü bir ayırma gerçekleĢtirilirken, kütle spektroskopisi ile kompleks yapılı bileĢenlerin belirlenmesi ve tayini için üstün bir dedeksiyon sağlanmaktadır. Çok boyutlu ayrım yöntemlerinin uygulandığı HPLC-MS sistemleri; kolon geçişli HPLC-MS, birleştirilmiş HPLC-MS yada off-line çok boyutlu HPLC-MS gibi farklı dizaynlara sahiptir.

Kolon geçişli MD-HPLC tekniği; en az iki farklı kolon sistemi ve yönlendirme

valfi kullanılarak oluĢturulan tek bir sistem üzerinde; ters-faz, iyon değiĢtirme, boyut eleme gibi farklı sıvı kromatografi Ģartlarında eĢ zamanlı tayin yapabilme imkânı sunmaktadır. Birleştirilmiş MD-HPLC tekniğinde; farklı türdeki kolon sistemleri ardıĢık bağlanarak yada farklı tür sabit faz yapıları aynı kolon içerisine yüklenerek ayrımlar gerçekleĢtirilmektedir. Off-line MD-HPLC tekniğinde ise, bileĢenler seçici türler Ģeklinde manuel olarak fraksiyonlanmakta, daha sonra bu fraksiyonlar uygun analiz sistemleri kullanılarak analiz edilmektedir (Shalliker, 2012; UKEssays, 2015). BirleĢtirilmiĢ analiz sistemlerinde geliĢtirilen çok boyutlu ayırma yöntemleri ile ilgili

olarak; HPLC sistemi üzerindeki uygulamalarından ve teorik bilgilerinden tez konusu kapsamında yer alması bakımından detaylı Ģekilde bilgi verilmeye çalıĢılmıĢtır.

HPLC uygulamalarının neredeyse tümünde, tek bir boyutta/kolonda uygulanan kromatografik ayrımlara dayalı tayinler gerçekleĢtirilmektedir. Numunenin kompleks yapıda olması durumunda yada seçilen kolonun bileĢenlerin tümünü tek seferde ayırma kabiliyetinin düĢük olması halinde; ya off-line numune hazırlama tekniğinin (ön zenginleĢtirme, sıvı-sıvı ya da katı faz ekstraksiyon, …gibi) optimizasyonu yada ayrı bir off-line kromatografik ayırmanın uygulamaya konulması söz konusudur. Off-line numune hazırlama iĢlemlerinde numune toplanmakta, daha sonra filtrasyon, türevlendirme, kurutma, …gibi teknik bazı iĢlemlere tabi tutulmaktadır. Bu iĢlemlerin tamamlanması oldukça zaman almakta ve kromatografik analizlerden daha zahmetli olmaktadır. Manuel yada yarı otomatik numune hazırlama prodesürlerine alternatif olarak; seçilen fraksiyon/fraksiyonların ikinci ayırma kolonuna direk gönderilebileceği on-line yöntemler geliĢtirilmeye baĢlanmıĢtır. Son yıllarda gerçekleĢtirilen bu uygulamalarda; tek bir analiz sistemi üzerinde kolon değiĢtirme/geçiĢ esaslı analizlere imkân veren on-line uygulamalar oldukça baĢarılı ve etkili çözümler sunmaktadır. Bununla birlikte, birden fazla sistem elemanının ve yönlendirme valfinin tek sistem üzerinde kullanımına imkân veren sistemlerin oluĢturulmasına/geliĢtirilmesine yönelik çalıĢmalar, modern HPLC üreticileri tarafından da yoğun bir Ģekilde yürütülmektedir (Shalliker, 2012).

HPLC analiz sistemi üzerinde geliĢtirilen çok boyutlu kromatografi uygulamaları genellikle; kapsamlı (comprehensive), pik seçimli (heart-cutting), on-line tuzaklama/geri yıkama ve ardıĢık kolon rejenerasyonu Ģeklindedir. Bu uygulamaların tümü; çok boyutlu kromatografi yani “birinci kolondan elde edilen hedef analitin,

yönlendirme valfleri aracılığıyla ikinci bir kolona seçimli transferi” Ģeklinde

tanımlanmaktadır. Tekniğin, tek-boyutlu kromatografik ayrımlara kıyasla; yüksek çözünürlük, seçicilik ve pik kapasitesi gibi pekçok üstün özelliği bulunmaktadır (Stoll ve ark., 2007). MD-HPLC sistemlerinde loop sistemleri ve yönlendirme valfleri kullanılarak; birinci boyut ayrımın gerçekleĢtirildiği kolondan belirli hacimde alınan fraksiyonlar ardıĢık olarak uygun kolon/kolonlara gönderilmekte ve fraksiyon içerisindeki bileĢenlerin ikinci boyut ayrımları gerçekleĢtirilmektedir. Teknik; birinci kolonda ayrımı gerçekleĢtirilen bileĢenlerden ilgilenilen hedef türe ait fraksiyonun, uygun bir kolona yönlendirilerek tayin edildiği “pik seçimli (heart-cutting) MD-HPLC” yada türlerin her birinin sırayla uygun kolonlara yönlendirilerek ayrımının/tayininin

sağlandığı “kapsamlı (comprehensive) MD-HPLC” Ģeklinde uygulanmaktadır (ġekil 1.12) (Stroll, 2007; Cohen ve ark., 2008).

ġekil 1. 12. Modern analiz sistemlerinde, pik seçimli (heart-cutting) MD-HPLC tekniğinin uygulandığı sisteme ait Ģematik gösterim

Pik seçimli MD-HPLC tekniği; sıvı kromatografi cihazlarında, fraksiyon toplayıcı sistemlerle birlikte kolaylıkla uygulanabilmektedir. Toplanan hedef bileĢenin diğer boyut ayrımı için uygun kolon seçilmekte ve seçilen hareketli faz sistemleri yardımıyla analizler gerçekleĢtirilmektedir. Bu yöntemin ilk uygulamaları, 1943’de Manning ve Strain tarafından adsorpsiyon kolonlarında bitki kolorofil ekstraklarının izolasyonu için gerçekleĢtirdikleri çalıĢma ile gerçekleĢtirilmiĢtir. Modern analiz sistemlerinin geliĢtirilmesiyle birlikte, 1973 yılında Huber ve arkadaĢları tarafından altı- port/iki-pozisyon (6PT/2PS) valf sistemi kullanılarak ilk modern pik seçimli MD-HPLC uygulaması gerçekleĢtirilmiĢtir. Kapsamlı MD-HPLC tekniği ile gerçekleĢtirilen analizlerde ise, birinci boyut kolondan elde edilen fraksiyonların tümü sırayla ikinci boyut ayırma kolonlarına yönlendirilerek tayinler gerçekleĢtirilmektedir. OtomatikleĢtirilmiĢ sistemlerde uygulanan analizler için; uygun sekiz-port yada on-port valf sistemleri ve loop sistemleri kullanılmaktadır (Cohen ve ark., 2008).