Kromatografi tekniği

Kromatografi; bir karıĢımı oluĢturan bileĢenlerin hareketli bir faz yardımıyla sabit bir faz üzerinden, fiziksel ve kimyasal özelliklerindeki farklılıklarından faydalanılarak değiĢik hızlarla hareket etmeleri esasına dayanan; etkin bir ayırma ve saflaĢtırma metodudur (Skoog ve ark., 1996). Kromatografi; günümüzde birçok alanda yaygın bir Ģekilde kullanılan etkili ve seçiciliği yüksek bir yöntem olup, farklı amaçlar için geliĢtirilen çok sayıda uygulaması bulunmaktadır (Gezici, 2010).

Kromatografik ayırmalarda numune; gaz, sıvı yada süper kritik akıĢkan olan bir hareketli faz ile sisteminde taĢınır. Hareketli faz, bir kolonda veya bir katı yüzeyde sabitleĢtirilmiĢ, kendisi ile karıĢmayan sabit faz içerisinden geçmeye zorlanır. Bu iki faz, numunedeki bileĢenlerin hareketli ve sabit fazlarda farklı oranlarda dağılacağı Ģekilde seçilmektedir. Numunedeki bileĢenler ile sabit faz arasında, kimyasal ve fiziksel etkileĢimler söz konusudur. Numunenin sabit faz üzerindeki/içerisindeki göçü; hareketli ve sabit faz arasındaki fiziksel ve kimyasal dengelerin dağılımına bağlı olarak değiĢmektedir (Skoog ve ark., 1999).

Kromatografik teknikler genel olarak;

− hareketli ve sabit fazlarının yapısına göre

− hareketli ve sabit fazın fiziksel olarak temasa getirilme Ģekline göre − kullanım amacına göre ve

− bileĢenlerin ayrılmasında rol alan fiziksel / kimyasal mekanizmaların türüne göre

4 temel baĢlık altında sınıflandırmak mümkündür.

Hareketli ve sabit fazların yapısına göre yapılan sınıflandırmada; sırasıyla hareketli ve sabit fazın fiziksel durumu belirtilerek sınıflandırma yapılmaktadır. Yapılan bu sınıflandırmada kromatografi; sıvı-sıvı kromatografisi, sıvı-bağlı faz kromatografisi, sıvı-katı kromatografisi, gaz-sıvı kromatografisi ve süperkritik akıĢkan kromatografisi olmak üzere beĢ farklı kategoride gruplandırılmaktadır.

Hareketli ve sabit fazın fiziksel olarak temas ettirilme Ģekline göre yapılan sınıflandırmada; kolon ve düzlemsel kromatografi tekniği olmak üzere iki grupta sınıflandırılmaktadır.

Analiz edilen numunedeki bileĢenlerin ayrılmasında rol alan fiziksel/kimyasal mekanizmaların türüne göre yapılan sınıflandırmada; adsorpsiyon, dağılma, iyon- değiĢtirme, gümüĢ iyon, boyut eleme, zone elektroforez, afinite ve kiral kromatografi tekniği olmak üzere sekiz farklı yöntem Ģeklinde gruplandırılabilmektedir.

Kullanım amacına göre yapılan sınıflandırmada ise; analitik kromatografi (kalitatif ve kantitatif kromatografi) ve preparatif kromatografi (karıĢımlardan saf madde eldesi) tekniği olmak üzere iki grupta sınıflandırılmaktadır.

Kromatografik tekniklere olan bakıĢ açıları doğru ve güvenilir Ģekilde yayınlandığı takdirde; ayırma, belirleme ve miktar tayini için oldukça güvenilir tekniklerdir.

Kromatografik yöntemler, yüzlerce maddeden oluĢan karıĢımların analizine dahi imkân sağlayabilmektedir. Bu analizler; güçlü ayırma kabiliyetine sahip yüksek performanslı sıvı kromatografi cihazı (HPLC), gaz kromatografi cihazı (GC) gibi modern ve pahalı analitik enstrümanların kullanımını gerektirmektedir. Ön ayırma/deriĢtirme iĢlemleri için ise; ince tabaka (ĠTK) ya da kolon kromatografi (CC) sistemlerinin kullanıldığı kromatografik tekniklerin uygulamaları tercih edilmektedir (Skoog ve ark., 1999).

Bu uygulamalardan ve teorik bilgilerden, tez konusu kapsamında yer alması bakımından kısaca bilgi verilmeye çalıĢılmıĢtır.

1.4.2.2.1. Ġnce tabaka kromatografi (ĠTK) tekniği

Ġnce tabaka kromatografi (ĠTK) tekniği; genellikle analitik yöntemlerin ön iĢlem basamağında hedef türlerin izole edilmesi yada numunedeki türlerin direkt olarak ayrımı ve tayini için uygulaması bulunan bir yöntemdir. Ġnce tabaka metotları ile yüksek verimlilikte ayırma etkinliği sağlanabilmekte ve benzer lipit sınıfları içerisinde türlerinin ayrımı için sıklıkla kullanılmaktadır. Örneğin; polar lipit fraksiyonu içerisinde fosfolipit türlerinin ayrımı ve tayini, yağ asitlerinin farklı zincir uzunlukları ve doymamıĢlık derecelerine göre ayrımları sağlanabilmektedir.

ĠTK tekniğinde; sabit faz olarak genellikle cam ya da alüminyum plaka yüzeyine tek bir formda bağlanmasını sağlayan, farklı türler ile yüzeye bağlanmıĢ silika kullanılmaktadır. Numunenin plakanın baĢlangıç noktasına uygulanmasının ardından, hareketli fazın içerisinde bulunduğu tank içerisine yerleĢtirilir. Bu durum, iĢlem tamamlanana kadar devam eder ve kapiler etki ile sabit faz yüzeyinde türlerin ayrımı gerçekleĢir. Numune bileĢenleri, hareketli fazın ilerleme doğrultusunda polarite değerlerine bağlı olarak ayrılmaktadır. ĠTK tekniğinde numunede ayrımı hedeflenen bileĢenlerin fraksiyonlar halinde değil, sabit faz üzerinde yerleĢmiĢ bir Ģekilde ayrımı sağlanmaktadır. Bu durum, kolon kromatografisi ile kıyaslandığında iki önemli avantaj ve bir dezavantaj sunmaktadır. Ġlk avantajı; aynı yada farklı hareketli faz içerisinde ĠTK plakasını tekrar Ģartlandırma durumu söz konusudur. Böylece bileĢenlerin ayrımının iyileĢtirilmesi sağlanabilmektedir. Bu iĢlem, aynı boyutta yada ikinci boyutta gerçekleĢebilmektedir (ġekil 1.11.) (Christie ve ark., 2010). Ġki boyutlu ĠTK tekniği; oldukça kompleks lipit türlerinin ayrımı veya benzer polarite değerlerindeki lipit türlerinin ayrımı için oldukça yararlı bir teknik olarak bilinmektedir.

ġekil 1. 11. Lipit türlerinin tek ve iki boyutlu ĠTK ayrımına ait Ģematik gösterim

Ġkinci avantajı; plaka üzerinde dikkatlice tespit edilen bölgelere göre bileĢenlerin tanınmasına imkan sağlamasıdır. Bu durum, her bir bileĢenin baĢlangıç noktasından bileĢenin ilerlediği noktaya kadarki mesafenin tespiti anlamına gelmekte ve Rf değeri

olarak ifade edilmektedir. Ayrılan bileĢenlerin tanınması için, lipit türlerinin boya kullanılarak görünür hale getirilmesi gerekmektedir. Lipit bileĢenleri, ĠTK plaka üzerinde rhodamine-6G, iodine buharı veya 2',7'-dichlorofluorescene gibi reaktifler kullanılarak zarar vermeden görünür forma getirilmektedir.

ĠTK tekniğinin dezavantajı ise; sabit faz üzerinde lipit bileĢenlerinin kurutulmasına imkân verildiğinde bazı bileĢenlerin oksidasyona uğrama meylinin arttırılmasıdır. Kullanılan boyar maddelerden pek çoğu, bileĢenlerin belirlenmesi için faydalı olmakla birlikte, boyamayla birlikte numunenin bozulmasına da sebep olmaktadır. Bozunmaya sebep olamayan boyalar kullanıldığında, lipit türlerinin oluĢturduğu spotlar plaka yüzeyinden kazınarak alınmakta ve lipitler sabit fazdan ekstrakte edilerek kantitatif olarak tayin edilebilmektedir.

1.4.2.2.2. Kolon kromatografi (CC) tekniği

Kolon kromatografi (CC) tekniği; lipit fraksiyonlarının direk belirlenmesi, izole edilen türlerin kantitatif tayini veya lipit bileĢenlerinin türevlendirilmesi gibi pek çok ön prosedür için oldukça elveriĢli bir yöntemdir. Kolon kromatografisi; hedef analitin herhangi bir sabit faz üzerinde adsorpsiyonu yada dağılımının sağlanması, sonrasında artan polariteleri ve hareketli fazın gücüne bağlı olarak sabit fazdan elue edilmeleri olarak da ifade edilmektedir.

Sabit faz, silindirik bir kolona sıkı bir Ģekilde doldurulmakta ve baĢlangıç hareketli fazı ile Ģartlandırılmaktadır. Lipit türlerini içeren numune kolon giriĢine katı faz yüzeyine ilave edilmekte, hareketli fazın sürekli olarak kolona gönderilmesi ile; analitin her iki faz arasındaki dağılımı neticesinde farklı oranlarda ayrımları gerçekleĢtirilmektedir. Bu teknik için yaygın olarak kullanılan sabit faz sistemleri; silika, alümina ve iyon değiĢtirici reçineler olarak ifade edilmekte, türlerin ayrımı için uygun pek çok hareketli faz/çözücü sistemi bulunmaktadır (Sikorski, 2003; Christie ve ark., 2010).

1.4.2.2.3. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)

Yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) tekniği; sıvı haldeki hareketli faz/çözücü sistemlerinin kolonda yer alan sabit faz üzerinden yüksek akıĢ hızlarında geçirilebilmesine imkân sağlayan, özel analiz sistemlerinde uygulanan modern bir teknik olup, hem analitik hem de preparatif amaçla yaygın olarak kullanılmaktadır (Gezici, 2010).

Lipit türlerinin tayini için; HPLC tekniği kullanılarak uygulanan pek çok yöntem olmakla birlikte, yaygın kullanılan bazı yöntemler kısaca açıklanmaya çalıĢılmıĢtır.

 Adsorpsiyon kromatografisi. Adsorpsiyon kromatografisi, sıvı-katı yada gaz- katı kromatografi tekniği olarak tanımlanmaktadır. Sabit faz olarak; alümina, silikajel, kalsiyum karbonat, magnezyum sülfat, magnezyum karbonat, potasyum karbonat, sodyum karbonat, niĢasta, selüloz yada aktif karbondan oluĢan yapılar kullanılmaktadır. Hareketli faz sistemi olarak ise; izokrotik yada gradient programlamanın uygulandığı farklı polarite değerlerine sahip çözücü sistemleri kullanılmaktadır. Adsorpsiyon tekniği; ince tabaka ve kolon kromatografi uygulamalarında yaygın olarak

kullanılmakla birlikte, HPLC uygulamalarında da sayısız uygulaması mevcuttur. Lipit türlerinin tayinde, hedef türdeki polar (ester bağları, fosfat, hidroksil ve amin... gibi) yada fonksiyonel grupların varlığı/ sayısı/ farklılığı, ayırmalarda etkili rol oynamaktadır. Polar maddelerin ayrılmasında polar sabit fazlar, apolar maddelerin ayrılmasında ise apolar sabit fazlar kullanılmaktadır. Ayrıca sabit fazların polaritelerinin asidik ve bazik yapıda olması, asidik ve bazik maddelerin ayırımında önemlidir. Sabit fazın tanecik çapı, tanecik yüzey alanı ve tanecik özellikleri ayırım gücüne etki eden önemli faktörlerdir (Christie ve ark., 2010).

 Dağılma kromatografisi. Sıvı-sıvı yada gaz-sıvı kromatografi tekniği olarak da bilinen dağılma kromatografisi, birbiri ile karıĢmayan iki faz arasında maddelerin dağılması temeline dayanmaktadır. Sıvı-sıvı dağılma kromatografisi uygulamaları, sabit ve hareketli fazların polarite değerlerine bağlı olarak "normal-faz dağılma" ve "ters-faz

dağılma kromatografi" tekniği olarak iki temel grupta değerlendirilmektedir. Normal-

faz sıvı dağılma kromatografide; sabit faz polaritesi, hareketli faz polaritesinden daha yüksektir. Sabit faz olarak polar yapılı türler, hareketli faz bileĢiminde ise genel olarak hegzan, metilen klorür, kloroform, dietil eter ve çeĢitli çözücü karıĢımları kullanılmaktadır. En çok uygulaması bulunan sabit fazlar, silika ve alümina yapılardır. Ters-faz sıvı kromatografi; sabit faz polaritesinin hareketli faz polaritesinden daha düĢük olduğu uygulamalardır. Sabit faz olarak kimyasal bağlı fonksiyonel grup taĢıyan sabit fazlardan ODS en fazla tercih edilen yapı iken, kısa alkil zincirli (C8, C2 gibi), fenil ve siyano (CN) bağlanmıĢ sabit fazlar da sıklıkla kullanılmaktadır. Ters-faz sıvı kromatografisinde genel olarak apolar türlerin ayrımı ve tayini sağlanmaktadır. Kısa alkil zincirleri içeren sabit fazlar (C2, C8) daha polar bileĢenlerin tayini için kullanılırken, uzun alkil zincirli sabit fazlar (C18) daha apolar türlerin tayininde kullanılmaktadır. Buna bağlı olarak apolar maddeler kısa alkil zinciri içeren sabit fazlardan daha çabuk uzaklaĢtırılırken, polar maddelerde uzun alkil zincirli sabit fazlardan daha kolay ayrılmaktadır. Ters-faz dağılma tekniğinde kullanılan hareketli faz sistemlerinin türünün, gerçekleĢtirilen ayırmaların verimliliğini önemli derecede etkilediği bilinmektedir. Çünkü kullanılan çözücü molekülleri bağlı yapılara difüzlenerek, konformasyonu ve yapıyı etkilemektedir (Christie ve ark., 2010).

 Ġyon değiĢtirme kromatografisi. Ġyonik yada iyonize olabilen türlerin tayini için geliĢtirilen/uygulanan bir teknikdir. Teknik ile; iyonik yapılar yada belirli pH

değerlerinde iyon veya iyonik yapı verebilen moleküllerin (organik asit veya organik bazlar) tayinleri gerçekleĢtirilmektedir. Sulu tuz çözeltileri ve alkol türü bileĢenler içeren polar hareketli faz çözeltileri ile asidik veya bazik gruplar bağlanmıĢ yapılar sabit faz olarak kullanılmaktadır. Ġyon kromatografi tekniğinde gerçekleĢtirilen ayırımlarda, analiz edilecek maddenin iyonik yapısı yani pKa değeri oldukça önemli bir faktördür (Christie ve ark., 2010).

 Jel-geçirgenlik veya boyut eleme kromatografisi. Boyut eleme kromatografi tekniğinde gerçekleĢtirilen ayırmalar, çözünen moleküllerin boyut ve Ģekilleri esas alınarak gerçekleĢtirilmektedir. Diğer yöntemlerin tersine analitle sabit faz arasında kimyasal bir etkileĢim yoktur ve tamamen fiziksel bir eleme iĢlemi gerçekleĢmektedir. Analitlerin alıkonma süreleri sadece molekül büyüklüğü ve gözenek yapısı ile ilgilidir. Bu teknikte; seçilen hareketli fazın bileĢimi ile numune etkileĢimi ve çözücü viskozitesinin çalıĢma sıcaklığında düĢük olacak Ģekilde seçimi ayırmalara önemli derecede etki etmektedir. Dolgu materyali olarak; çözücü ve çözünenin içerisine difüzlenebileceği modispers, farklı boyuttaki gözeneklere sahip silika veya polimerik partiküller kullanılmaktadır. Gözeneklerdeki alıkonma süresi, analiz edilen molekülün büyüklüğüne bağlıdır. Gözeneklere göre daha küçük çapta olan moleküller gözenekler içerisine doğru difüzlendikleri için, kolon içinde daha düĢük bir ortalama hıza sahiptirler. Ortalama gözenek büyüklüğünden daha büyük olan moleküller ise gözenek içerisine girmemektedirler. Dolayısıyla bu moleküllerin kolondaki alıkonma süresi daha az olmakta ve daha önce detektörde tespit edilmektedir (Ünsal, 2006).

 GümüĢ iyon kromatografisi (Ag+

-TLC, Ag+-HPLC, … ). Lipit türlerinin

tayini için özel olarak geliĢtirilen ve kompleks oluĢum mekanizması esas alınarak ayrımların gerçekleĢtirildiği kromatografi tekniğidir. Kompleksler; çift bağ içeren doymamıĢ türlerin elektron verici olarak, gümüĢ iyonların ise elektron alıcı olarak davrandığı yük transferi ile meydana gelmektedir. Sabit faza bağlı olan gümüĢ iyonları, çözünen türlerin çift bağlarının pi elektronları ile tersinir olarak reaksiyon vermektedir. Basit lipit molekülleri için oldukça kullanıĢlı bir teknik olmakla birlikte, ters faz kromatografi ile lipit ayrımlarının tamamlayıcısı olarak kullanılmaktadır. GümüĢ iyon kromatografi tekniği ile lipit bileĢenlerinin ayrımında; doymamıĢlık derecesi, çift bağ sayısı ve pozisyonu esas alınarak etkin ayırmalar sağlamaktadır. Yağ numunelerinde yağ asit metil ester, triaçilgliserol, kolestrol ester tayini gibi uygulamalar sıklıkla

gerçekleĢtirilmektedir. Teknik; kolon kromatografi, TLC ve HPLC ayırmalarına kolaylıkla uygulanabilmektedir (Christie ve ark., 2010).