Sonuçlar

A resazurina (azul e não fluorescente) é um corante usado como indicador de reação de oxido-redução, que é reduzido a resorufina (rosa e com alta fluorescência). Não está claro como ocorre esta redução, se por atividade enzimática intracelularmente ou por reações químicas que ocorrem no meio extracelular; contudo, a forma reduzida e fluorescente da resazurina, a resorufina, já foi encontrada no citoplasma de células mortas (O'Brien, 2000). De acordo com O’Brien (2000), há uma correlação direta entre a redução da resazurina em meio de cultura e a proliferação de organismos vivos.

Meio 7H9 com OADC Lamínula de vidro com água de torneira autoclavada Suporte de plástico com água de torneira autoclavada

Suporte de plástico com glutaraldeído 2%

Por essa razão, o corante resazurina (Acros Organics) foi escolhido para a utilização nos experimentos da cinética de crescimento em biofilmes. A redução da resazurina foi medida em espectrofotômetro (Labsystems Multiskan MS) com um filtro de 620nm (DO620nm). A resazurina é azul e a DO620nm diminui de acordo com a

mudança de cor para rosa devida ao metabolismo bacteriano. Para elaborar curvas de crescimento, foram usados os valores obtidos pela subtração de cada valor obtido nos poços com bactérias em cada tempo de incubação do valor médio das DOs dos poços controle (sem bactérias).

3.3.1 Padronização da utilização da resazurina

3.3.1.1 Comparação entre a leitura de DO620nm e UFC recuperadas em

diferentes tempos

Este ensaio foi realizado para observar se o aumento relativo calculado da absorbância da resazurina, medida pela DO620nm, seria acompanhado por um

aumento no número de UFC recuperadas.

O procedimento utilizado para obtenção do inóculo foi descrito no item 3.2. Um inóculo com 1,5x107 bactérias por ml (1:20), diluído em meio 7H9-OADC, foi semeado em placas de 96 poços (TPP) (200μl por poço), e a placa foi selada e incubada a 37oC sob agitação de 105rpm.

Diariamente o meio de três poços foi aspirado e os poços foram lavados com salina 0,9% e preenchidos com 150 µL da mesma solução. As bactérias foram removidas mecanicamente, como descrito por Hall-Stoodley (1998), e a suspensão de bactérias obtidas dos três poços foi diluída de modo seriado para contagem de UFC. Na mesma placa foram reservados quatro poços para a inoculação de resazurina. Para isso, após 24 horas de incubação o meio foi aspirado, os poços lavados com salina 0,9% e o meio foi substituído. O corante resazurina foi então aplicado aos poços na concentração de 0,02%. A placa foi incubada a 37oC sob agitação e leituras diárias de absorbância (DO620nm) foram realizadas por 8 dias.

3.3.1.2 Comparação da leitura de DO620nm com diferentes concentrações de

resazurina

O corante resazurina foi aplicado a placas 96 poços contendo meio 7H9- OADC, nas concentrações de 0,005%, 0,01%, 0,015%, 0,02%, 0,025% e 0,03%, (10

poços com cada concentração) e então foi realizada a leitura da absorbância no aparelho de espectrofotometria (DO620nm).

A leitura de absorbância foi realizada imediatamente após a colocação da resazurina. Neste procedimento os valores de DO620nm, obtidos com da leitura, foram

diretamente analisados para a escolha de uma concentração que estivesse dentro do limite de detecção (entre 0 - 1,0) do aparelho de espectrofotometria para placas de 96 poços (Labsystems Multiskan MS) (Operation manual, 1994).

3.3.1.3 Comparação de diferentes concentrações de bactérias no experimento com resazurina

O experimento foi realizado com bactérias de segunda passagem em cultivo líquido (7H9-OADC). Para a obtenção de um inóculo mais homogêneo, os grumos formados em cultivo foram desfeitos com o auxílio de uma seringa de 1ml (BD) (80 jatos) e sonicação (Transsonic 310, Elma®). Após o rompimento dos grumos, os tubos contendo bactérias foram centrifugados para precipitar os aglomerados restantes.

Para verificar a ausência de aglomerados, 50µl retirados do sobrenadante da centrifugação foram colocados sobre uma lâmina para observação em microscópio óptico comum (Nikon Eclipse E200, resolução 40x). O cultivo foi quantificado por espectrofotometria para a obtenção de um inóculo com DO560nm de 0,1

(correspondendo a aproximadamente 109 bactérias por ml, conforme observado em vários experimentos realizados). Este inóculo foi diluído em meio 7H9-OADC nas concentrações de 104 até 108 bactérias por ml. Os inóculos foram semeados em placas de poliestireno de 96 poços (TPP), 10 poços por amostra, e 10 poços foram inoculados apenas com meio 7H9-OADC para servirem de controle negativo do experimento e para cálculo da absorbância relativa. Após 24 horas o meio foi retirado junto com as bactérias não aderidas, os poços foram lavados com salina 0,9%, o meio foi substituído e o corante resazurina foi adicionado, na concentração de 0,015%. Este procedimento também foi realizado com os poços do controle negativo. As placas foram seladas e incubadas a 37oC sob agitação de 105 rpm.

Os valores de absorbância foram registrados a cada 12 horas, totalizando um período de 72 horas de avaliação.

3.3.2 Curvas de crescimento em biofilmes das diferentes cepas

O protocolo utilizado foi descrito no item 3.3.1.3, com 108 bactérias por ml. Após a inoculação da resazurina (0,015%) e a incubação das placas, as leituras foram realizadas por 96 horas. Para a construção das curvas de absorbância os valores de DO620nm obtidos foram usados para calcular a absorbância relativa, como

descrito no item 3.3.

O cálculo da curva de crescimento foi realizado a partir dos dados obtidos nas leituras de absorbância. Os dados utilizados para o calculo dos valores das curvas de crescimento são referentes ao inicio da fase de crescimento, sendo que esses dados foram ajustados para a obtenção de uma parábola com função y=a(x-xo)2.

Com os valores ajustados foi possível calcular os valores de a e xo, o que por sua

vez permitiu o calculo dos valores de velocidade de crescimento, que é a inclinação máxima observada na curva de crescimento. Os valores de velocidade de crescimento foram obtidos a partir da função y’’=2a, que é derivada da equação da

curva de crescimento. Portanto o valor obtido da fórmula y’’=2a é uma medida indireta da velocidade de crescimento da cultura. Esse parâmetro tem sido relacionado ao fitness bacteriano (von Groll et al., 2010)

Os dados encontrados para a velocidade de crescimento foram, então, normalizados com o valor encontrado para a cepa CCUG 48898. Para cada valor obtido, o desvio padrão foi calculado, sendo este determinado pelo ajuste feito para os valores absolutos obtidos na leitura de absorbância.

3.4 Microscopia Eletrônica de Varredura do tipo Field Emission (FESEM)