Kat planı tasarım sistemi

0.0 0.5 1.0 1.5 Controle (n=14) Restrito (n=10)

*

Figura 15. Concentração plasmática de T3 (ng/ml) das proles dos grupos controle e restrito. As barras representam as médias ± erro-padrão (* p<0,05).

0 10 20 30 Controle (n=12) Restrito (n=10) C o n cen tr ação pl as m át ic a de T4 ( n g /ml )

Figura 16. Concentração plasmática de T4 (ng/ml) das proles dos grupos controle e restrito. As barras representam as médias ± erro-padrão.

Tabela 3. Perfil plasmático de insulina, leptina, T3 e T4 dos filhotes dos grupos controle e restrito. Os valores representam as médias ± erro-padrão. O tamanho da amostra (n) de cada grupo é mostrado entre parêntesis.

Insulina (ng/ml) Leptina (pg/ml) T3 (ng/ml) T4 (ng/ml)

CON RES CON RES CON RES CON RES

1,17 ± 0,18 (13) 3,34 ± 0,78 * (8) 1255,54 ± 392,37 (11) 987,79 ± 261,08 (8) 1,09 ± 0,08 (14) 0,82 ± 0,06 * (10) 16,00 ± 1,68 (12) 20,99 ± 3,74 (10) * vs CON (p<0,05)

5. DISCUSSÃO

A gestação representa um estado fisiológico caracterizado pelo ganho de peso materno que reflete o crescimento fetal e o desenvolvimento do útero, da placenta, do líquido amniótico, do tecido mamário e das reservas energéticas maternas. A mãe é responsável por suprir as necessidades de macro e micronutrientes e o aporte calórico necessário não apenas ao desenvolvimento fetal, mas também às suas próprias necessidades nutricionais (Eidelman et al., 2001). Assim, a manutenção de uma alimentação balanceada e o fornecimento adequado de nutrientes neste período são fundamentais para atender às demandas fisiológicas maternas próprias da gestação, ao desenvolvimento do concepto (Padilha et al., 2007) e às reservas energéticas necessárias para a amamentação (Andrews et al., 1986).

Durante a primeira metade da gestação, o crescimento fetal ocorre principalmente por hiperplasia, com formação de novas células e, na segunda metade da gestação, o crescimento fetal se dá pela hipertrofia destas células (Winick, 1968). Portanto, o ganho de peso gestacional ocorre gradualmente, entretanto é mais pronunciado no final da gestação, pois neste período há um importante aumento de peso do feto. Além disso, ao final da gestação o armazenamento de gordura materna deve aumentar para preparar a mãe para a lactação, que representa um período de alta demanda energética (Trayhurn, 1989).

No presente estudo, as ratas do grupo controle apresentaram aumento de peso gradual durante a gestação, porém com ganho de peso mais acentuado ao final da gestação. Este padrão de ganho de peso gestacional era

esperado nas gestantes do grupo controle, uma vez que obtiveram livre acesso à ração, permitindo assim a nutrição adequada para a prole e para seu próprio organismo.

As gestantes do grupo restrito, por sua vez, apresentaram uma redução significante do ganho de peso gestacional em relação às gestantes do grupo controle, como reflexo natural à restrição alimentar imposta. Contudo, mesmo não atingindo o mesmo ganho de peso ao final da gestação, as gestantes do grupo restrito apresentaram o mesmo padrão de crescimento na curva de ganho de peso que as gestantes do grupo controle.

Reconhecendo que a nutrição adequada durante a gestação é essencial para o desenvolvimento e o estado nutricional do bebê, melhorias no estado nutricional materno são indiscutivelmente imprescindíveis para garantir um resultado adequado (Maloney e Rees, 2005; Rodriguez et al., 1991). Por outro lado, reduções no aporte nutricional durante o período gestacional podem levar a alterações no desenvolvimento fetal e determinar a susceptibilidade ao desenvolvimento tardio de doenças (Chadio et al., 2007).

Luz e Griggio (1996) avaliaram diferentes níveis de restrição alimentar materna (20, 40 e 60%) durante a gestação de ratos Wistar e verificaram ao nascimento gradativos graus de prejuízo no desenvolvimento da prole, havendo sempre comprometimento do organismo materno. Na restrição mais leve (20%), não foram observadas alterações significantes no desenvolvimento dos fetos. Já na restrição alimentar de 40%, parte do prejuízo nutricional foi repassada para a prole, que apresentou peso e energia corporal reduzidos. Na restrição mais intensa (60%) houve uma redução significante no tamanho da prole, por ocorrência de abortos, com diminuição do peso e da

energia dos filhotes.

Em nosso estudo foi imposta sobre as gestantes do grupo restrito uma restrição alimentar de 50%. Outros estudos realizados em nosso laboratório já haviam utilizado esta intensidade de restrição alimentar e observado na prole redução de ganho de peso e de energia, sem encontrar diminuição no número de filhotes (Luz et al., 2003; Coelho, 2005).

É descrito que restrições alimentares impostas na segunda metade da gestação causam nascimento por parto prematuro e aborto (Matsuoka et al., 2006). Entretanto, Griggio et al. (1997) não observaram redução no tamanho da prole quando a restrição é imposta apenas durante a primeira ou a segunda metade da gestação, encontrando redução no número de filhotes somente quando esta foi imposta durante todo o período gestacional.

Considerando a gravidade das repercussões da desnutrição intra- uterina sobre o estado nutricional materno e fetal, diversos estudos clínicos e epidemiológicos têm sido realizados a fim de avaliar condições clínicas como a hiperemese gravídica (Dodds et al., 2006; Van Stuijvenberg et al., 1995), intervalos curtos entre gestações, baixo peso pré-gestacional, peso materno insuficiente durante a gestação, gestações múltiplas e gestações precoces (Luther et al., 2005). Segundo dados do IBGE, 12,2% da população feminina brasileira em idade fértil apresenta déficit de peso (POF, 2003).

Experimentalmente, diversos estudos são realizados a fim de reproduzir os efeitos da RAIU, que pode ser obtida por meio de restrição protéica (Zambrano et al., 2006;Toscano et al., 2008), insuficiência placentária (Nüsken et al., 2008) ou redução global da ingestão materna (Woodall et al.,

1996; Griggio et al., 1997; Budge et al., 2004; Kind et al., 2005), sendo este último modelo o adotado no presente trabalho.

Em nosso estudo, como era esperado, observamos uma diminuição no peso ao nascimento dos filhotes que sofreram RAIU. Tal fenômeno se deve às deficiências no aporte nutricional para o feto, levando a alterações no crescimento e desenvolvimento fetal (Luz et al., 1996; Griggio et al., 1997; Coelho, 2005; Kind et al., 2005). Apesar da redução do peso, o número de filhotes por ninhada não foi alterado pela RAIU. Conforme já relatado, a restrição alimentar materna de 50% pode causar diminuição de peso corporal e de energia corporal da prole, entretanto não alterar o número de filhotes por ninhada (Luz et al., 2003; Coelho, 2005).

Não houve diferenças para o tempo de gestação entre os grupos estudados, bem como não observamos abortos ou partos prematuros em nossos experimentos. Os filhotes de ambos os grupos nasceram por parto espontâneo entre o 21o e o 22o dia de gestação (dados não apresentados), similarmente ao que foi observado por Zambrano et al. (2006) em seu estudo.

Antes mesmo do nascimento o feto é capaz de produzir calor no útero, uma vez que seu metabolismo basal é bastante intenso, com consumo de oxigênio superior ao de um indivíduo adulto. Durante a gestação, a mãe contribui consideravelmente para o controle de temperatura fetal, sendo o calor produzido pelo seu organismo transferido para o feto pela placenta e pelo útero. O momento do nascimento representa para o recém-nascido uma situação de estresse térmico, uma vez que este encontra no meio externo uma temperatura muito mais baixa em relação àquela vivenciada no meio intra- uterino, aumentando sua perda de calor para o ambiente e reduzindo sua

temperatura corporal. Neste momento, o recém-nascido deve então ativar mecanismos de produção de calor, na tentativa de manter a homeotermia (Asakura, 2004).

Com o objetivo de preparar o feto para esta transição, ocorre uma considerável mudança endócrina no recém-nascido que contribuirá para o início da auto-regulação dos mecanismos respiratórios, circulatórios, termorregulatórios e de homeostase glicêmica, bem como da alimentação (Gluckman et al., 1999).

O desenvolvimento do sistema termorregulatório de neonatos é variável entre diferentes espécies e parece estar relacionado à duração do período gestacional. Alguns animais, como o homem e ovelhas, apresentam capacidade termorregulatória já desenvolvida ao nascimento. Animais de espécies com períodos gestacionais menores, como pequenos roedores, são virtualmente poiquilotermos ao nascimento e tornam-se totalmente homeotermos após um período de aproximadamente 20-30 dias (Gordon, 1993; Nazarova e Petrova, 1999; Symonds et al., 2003). Corroborando estes dados, Frankel & Lange (1980) descreveram que a maturação do eixo hipotálamo – tireóide não ocorre até aproximadamente a sétima semana de vida nestes animais.

Luz et al. (2003), avaliando a capacidade termorregulatória de ratos submetidos à RAIU (50%), observaram nestes filhotes um atraso de 30 dias para manter sua temperatura corporal após o nascimento, em relação ao grupo controle, sugerindo que o TAM dos filhotes restritos tinha uma capacidade termorregulatória reduzida. Os autores acreditavam que a RAIU poderia

provocar um retardo no desenvolvimento do TAM, levando assim à ineficiência termorregulatória dos neonatos.

Ao nascimento uma quantidade significativa de TAM está presente em humanos (Yahata e Kuroshima, 1993) e outros mamíferos (Gordon, 1993) para protegê-los da hipotermia. O TAM é responsável pela termogênese sem tiritação e pela grande capacidade de gerar calor. O alto poder termogênico do TAM se deve principalmente à presença de UCPs na membrana interna de suas mitocôndrias, especialmente a UCP1 (Himms-Hagen, 1985).

Experimentos realizados por Coelho (2005) avaliaram a expressão do RNAm das UCPs no TAM de proles submetidas à RAIU (50%). Os resultados indicaram níveis significantemente aumentados de RNAm de UCP1 e UCP2 nas proles restritas, em relação aos controles, em 9 vezes e 2,5 vezes, respectivamente. Tais resultados sugerem um possível aumento na atividade do TAM, contrariamente à hipótese levantada anteriormente pelo grupo (Luz et

al., 2003). O autor observou também uma tendência de aumento na expressão

de RNAm para UCP3 no TAM, mas esta diferença não foi significante.

Para avaliar a expressão destas proteínas utilizamos em nosso estudo a metodologia imuno-histoquímica associada à técnica do Tissue Microarray (TMA), que garante a uniformização das reações, além de possibilitar grande economia de reagentes pelo estudo simultâneo das amostras (Andrade et al. 1997).

Os resultados obtidos em nosso trabalho para a expressão protéica das UCPs corroboram os resultados obtidos por Coelho (2005), uma vez que os filhotes do grupo restrito apresentaram expressão das proteínas UCP1 e UCP2 significantemente maior do que as proles do grupo controle (42% e 53%,

respectivamente). Não foram observadas diferenças significantes para a expressão de UCP3 no TAM em nosso estudo, o que também foi demonstrado para RNAm por Coelho (2005).

Diferentemente dos humanos, pouca quantidade de gordura é encontrada em roedores neonatos, uma vez que esses animais têm o desenvolvimento de gordura fetal incompleto. Logo, grande parte dos depósitos de gordura encontrados em pequenos roedores provêm do TAM e esse depósito pode ser alterado pelo estado nutricional materno. Redução no teor de gordura corporal de filhos de mães submetidas à restrição alimentar já foi anteriormente descrita por diferentes autores (Symonds et al., 1998; Engelbregt

et al., 2004; Coelho, 2005). Já foi demonstrado em cobaias que a RAIU leva a

uma diminuição da gordura marrom dos fetos (Kind et al., 2005).

A ausência de pelagem e a reduzida quantidade de gordura em pequenos roedores dificultam seu isolamento térmico ao nascimento, tornando- os muito susceptíveis ao estresse térmico (Gordon, 1993). Estes animais apresentam grande relação superfície/ volume e o baixo peso ao nascimento decorrente da RAIU acentua esta relação. Assim, poderíamos sugerir que estes filhotes apresentam elevada taxa de termólise, com maior perda de calor por condução e convecção, o que estimularia o aumento da termogênese sem tiritação e a maior produção de proteínas desacopladoras para aumentar a produção térmica e compensar a grande perda de calor. Este aumento é mais significativo para a UCP1, considerando que esta é a principal proteína termogênica do TAM (Himms-Hagen, 1985).

Boss et al. (1997) observaram aumento significante do RNAm da UCP2 no TAM após 48 horas de exposição ao frio. Baseando-se nestes

achados que descrevem a participação da UCP2 na termorregulação, o aumento da expressão de UCP2 no TAM encontrado nos animais submetidos à RAIU em nosso estudo nos leva a supor que esta proteína poderia estar exercendo papel na termogênese destes filhotes, assim como a UCP1, como mecanismo compensatório da alta taxa de termólise observada nas proles do grupo restrito.

Por outro lado, podemos considerar também que o aumento de UCP2 encontrado nas proles restritas possa talvez estar envolvido na proteção contra danos celulares, o que já foi demonstrado por outros autores (Busquets

et al., 1998; Arsenijevic et al., 2000; Mattiasson et al., 2003; Degasperi et al.,

2008). Echtay et al. (2002) observaram que a administração de superóxido nos rins, baço, coração, fígado e células β pancreáticas de ratos provocou aumento nos níveis de UCP2 mitocondrial, sugerindo que o aumento de espécies reativas de oxigênio ativa a produção de UCP2.

Kumar et al. (2008) observaram em seu estudo que recém-nascidos de baixo peso são deficientes em vários importantes antioxidantes, estando predispostos a um maior estresse oxidativo. Outros autores também demonstraram que a desnutrição intra-uterina está associada a significantes níveis de estresse oxidativo em neonatos (Gupta et al., 2004).

De Meis (2003) descreveu a presença da bomba de Ca++ _{do retículo}

sarcoplasmático (SERCA1) em adipócitos de tecido marrom de ratos, sugerindo que esta poderia estar contribuindo para a função termogênica do TAM. Entretanto, confirmando os achados de Coelho (2005), não encontramos diferenças significantes entre os grupos estudados, o que sugere que o aumento da produção de calor dos filhotes de mães restritas deve-se ao

aumento das UCPs, particularmente da UCP1, uma vez que também não foram detectadas diferenças na expressão da UCP3 no TAM.

Sabemos que neonatos produzem calor basicamente por termogênese sem tiritação, mediada pelo TAM e que animais adultos, entretanto, aumentam sua produção de calor primeiramente através da termogênese com tiritação, ou seja, pela contração involuntária da musculatura esquelética (Griggio, 1988).

Considerando-se o papel termogênico descrito para a UCP3 (Lin et

al., 1998) e SERCA1 na musculatura esquelética (De Meis, 2001), avaliamos a

expressão destas proteínas dos filhotes submetidos à RAIU a fim de verificar alguma eventual contribuição da termogênese com tiritação na produção de calor apresentada por estes animais. Da mesma maneira que Coelho (2005) não encontrou diferenças significantes na expressão do RNAm destas proteínas na musculatura esquelética dos filhotes restritos, não observamos expressão diferenciada destas em nosso grupo restrito, sugerindo que, apesar da grande necessidade de aumentar sua produção de calor a fim de compensar o aumento da termólise, estes animais, assim como os animais controle, aumentam sua termogênese logo após o nascimento somente através do TAM.

De acordo com Nazarova (1993), ratos no 1º dia de vida regulam a temperatura corporal exclusivamente através do TAM e somente a partir do 4º dia a termogênese com tiritação também começa a contribuir com a produção total de calor do animal. Isto pode ser explicado pelo fato de que a termogênese sem tiritação é mais eficiente termicamente que a termogênese com tiritação, uma vez que esta leva última a significativas perdas de calor por

convecção, particularmente nos animais submetidos à RAIU, em função da alta relação superfície/ volume, já discutida anteriormente.

Considerando-se que a transição do meio intra para o extra-uterino representa um grande estresse ao recém-nascido (Symonds et al., 2003), diversos hormônios estão envolvidos nesta transição, dentre os quais podemos destacar a insulina, a leptina e os hormônios da tireóide (Cannon e Nedergaard, 2004), que têm sido relacionados à termorregulação e à expressão das UCPs (Mostyn et al., 2005).

Os experimentos realizados em nosso trabalho puderam mostrar o perfil plasmático destes hormônios nas proles, ao nascimento. Primeiramente, os resultados obtidos em nosso estudo demonstraram nas proles do grupo restrito uma concentração plasmática de insulina significantemente maior que as proles do grupo controle.

É descrito que o pâncreas endócrino é particularmente susceptível aos efeitos da restrição alimentar materna, uma vez que os períodos fetal e neonatal são críticos para o desenvolvimento das células β e para a maturação da função pancreática (Alvarez et al., 1997). Entretanto, os estudos sobre os efeitos da RAIU sobre os níveis sangüíneos de insulina maternos e da prole apresentam resultados controversos.

Mericq et al. (2005) verificaram que bebês nascidos com baixo peso para a idade gestacional apresentaram, 48 horas após o nascimento, níveis de insulina de jejum e HOMA-IR (Homeostatic Model Assessment - Insulin Resistance) inferiores aos de bebês nascidos com peso adequado para a idade gestacional. Entretanto, quando os mesmos parâmetros foram verificados após um ano de vida, os resultados inverteram-se, demonstrando uma associação

entre o baixo peso ao nascimento e o desenvolvimento posterior de resistência à insulina.

Mahajan et al. (2004) demonstraram que os níveis de insulina de fetos que haviam sofrido desnutrição ou anemia durante o período gestacional foram menores quando comparados aos de recém-nascidos saudáveis.

Em estudo experimental, Woodall et al. (1996) avaliaram os efeitos da restrição alimentar de 70% durante a gestação de ratos Wistar e encontraram para a prole restrita uma redução significativa dos níveis plasmáticos de insulina ao nascimento, bem como reduzidos níveis plasmáticos de IGF-I. Estudo semelhante demonstrou que a subnutrição materna durante o período gestacional provoca diminuição significativa da concentração plasmática de insulina dos ratos recém-nascidos, bem como das mães que sofreram a restrição alimentar (Wang et al., 2007).

Em contrapartida, no estudo de Alvarez et al. (1997), os filhotes de ratas gestantes que sofreram restrição alimentar de 65% durante a segunda semana ou na última semana de gestação apresentaram níveis insulinêmicos significativamente superiores àqueles apresentados pelas proles controle.

Da mesma maneira, Martin et al. (2004, 2005) impuseram sobre os ratos uma restrição alimentar de 35% durante a 3ª semana gestacional, período crucial para o desenvolvimento do pâncreas, e verificaram nos filhotes desnutridos níveis de insulina plasmática superiores aos dos filhotes controle. Neste mesmo estudo, os autores observaram que o conteúdo de insulina nas ilhotas pancreáticas foi significativamente maior nos fetos desnutridos, apesar do menor peso do pâncreas observado nestes animais.

alimentar de 30% durante todo o período gestacional e receberam dieta hipercalórica e hiperlipídica na vida adulta, apresentaram níveis superiores de insulina e leptina plasmáticas, quando comparados aos níveis dos ratos controle, cujas mães haviam recebido alimentação ad libitum.

Poderíamos supor que o aumento dos níveis de insulina plasmática observado nos fetos que sofreram RAIU em nosso estudo poderia ser justificado como um mecanismo fisiológico de proteção contra a desnutrição, numa tentativa do organismo de preservar a massa magra e estimular o crescimento compensatório. Conforme Coelho (2005) demonstrou em seu estudo, os filhotes submetidos à RAIU de 50% apresentaram diminuição significante no conteúdo lipídico, entretanto o conteúdo protéico da carcaça destes animais não foi alterado, indicando que nestes animais a massa magra foi preservada.

Podemos assim sugerir que a insulina, neste momento de estresse catabólico promovido pela RAIU, torna-se essencial, sendo preservada nestes filhotes, uma vez que a insulinemia aumentada poderia contribuir para aumentar a captação de glicose. Entretanto, este aumento peri-natal nos níveis de insulina poderia provocar conseqüências tardias, programando uma futura obesidade e resistência à insulina nestes filhotes (Mericq et al., 2005).

Apesar do aumento da insulinemia apresentado pelos animais restritos, a glicemia neonatal é mantida, pois, conforme demonstrado em trabalho anteriormente realizado em nosso Laboratório, não foram observadas alterações significantes na glicemia dos filhotes de mães restritas quando comparados aos filhotes do grupo controle (Coelho, 2005), o que já havia sido também demonstrado por Lesage et al. (2002).

Valverde et al. (2003) demonstraram em adipócitos de TAM interescapular de fetos de camundongos que a insulina tem papel fundamental na estimulação da expressão da UCP1, sendo esta regulação mediada pelo receptor IRS-1 por meio da cascata de sinalização da insulina via PI-3- kinase/AKT, indicando que a expressão da UCP1 pode ser induzida pela insulina, por meio deste receptor. Entretanto, os autores observaram que esta via de regulação de insulina não induziu a expressão da UCP2 ou da UCP3.

Rehnmark et al. (1990) demonstraram um cross-talk entre insulina e noradrenalina em meio de cultura células do TAM, sugerindo que a ação deste hormônio sobre a expressão da UCP1 no TAM é regulada por ação simpática.

A leptina é uma proteína da família das citocinas, sintetizada principalmente pelo tecido adiposo branco. A possível presença da leptina também no TAM foi investigada, mas os autores vieram a demonstrar por imuno-histoquímica que a leptina deriva de adipócitos de tecido adiposo branco presentes no TAM (Cinti et al., 1997).

A leptina age através de seus receptores regulando várias funções fisiológicas no organismo, entre as quais destacamos a regulação do balanço energético e a sinalização da massa gordurosa presente no organismo (Scarpace et al., 1997). Evidências apontam que a leptina esteja também relacionada ao controle de temperatura, participando da termogênese em situações de estresse térmico, juntamente com a participação de outros hormônios. Animais ob/ob, por exemplo, são caracterizados por hiperfagia e intolerância ao frio, evidenciando o papel da leptina na termogênese (Ukropec

Em pequenos roedores, grande parte dos depósitos de gordura provêm do TAM e esse depósito pode ser alterado pelo estado nutricional