Sığır Karkaslarda Dekontaminasyon İşlemleri

Değişik nedenlere bağlı olarak kesim sırasında karkaslara bulaşma olasılığı bulunan patojen nitelikte veya bozulmaya neden olan mikroorganizmaların bulaşma olasılığını azaltan veya minimal düzeye indirgenmesini amaçlayan işlemleri kapsar. Fakat kesim sırası veya kesim sonrasında karkaslara uygulanacak bu işlemler, asla kesim hijyenine yönelik önlemlerin alınmasını ikinci plana atmamalıdır. Çünkü bu işlemlerden beklenen yararlar, yine kesim hijyeni ile ilgili önlemlerin alınması ve iyi bir kesim hijyeni ile ilgili önlemlerin alınmasıyla başarıya ulaşabilmektedir (Bolder 1997, Sofos ve Smith 1998).

Güvenli gıda talebi, tüketicilerin en önemli haklarından birisidir. Tüketiciler genelde mutfakta gıda ürünlerini hazırlarken, sağlık risklerini azaltmaya yönelik ek işlemleri yapmaya çok meyilli değillerdir. Ancak et ve et ürünleri kimyasal yapıları gereği, mikroorganizmaların çok iyi üreyebildikleri bir yapıya sahiptirler. Bu nedenle başta sığır eti olmak üzere, tüm et ve et ürünleri değişik sayıda patojen veya bozulmaya neden olan mikroorganizmalar ile kolay kontamine olabilme özelliğine sahiptirler. Özellikle başta E. coli O157:H7 olmak üzere, Campylobacter jejuni gibi infektif dozu düşük olan gıda patojenlerini içeren et ve et ürünlerinin çiğ veya yetersiz pişirilmesi sonucunda tüketilmesi sonucu insanlarda gıda infeksiyonları ortaya çıkmakta ve bunlardan bazıları ölümle sonuçlanabilmektedir. Kasaplık hayvanlar zaman zaman mezbahalara E. coli O157:H7, Salmonella spp., Campylobacter spp., L. monocytogenes ve S. aureus gibi patojen mikroorganizmalarla kontamine olarak gelebilmekte ve kesim hijyenine yönelik önlemlerin alınmaması nedeniyle karkaslar bu patojen bakterilerle kontamine olmaktadırlar (Bolder 1997, Sofos ve Smith 1998). Özellikle Amerika Birleşik Devletleri’nde 1990’lı yılların başında E. coli O:157:H7 kökenli fazla sayıda ölümlü gıda infeksiyonlarının görülmesi sonrası, ABD’nde Tarım Bakanlığı Gıda Güvenliği ve Kontrol Ofisi (USDA/FSIS) sığır ve kanatlı karkaslarının kesim sonrası değişik kimyasal ve fiziksel (sıcak su vb.) ajanlarla dekontaminasyon işlemlerine 1996 yılında izin vermiştir (Anonymous 2000).

14

Avrupa Birliği ise mezbahalarda gıda güvenliğinin sağlanmasında HACPP sisteminin etkin olarak uygulanmasıyla sağlamaya çalışmaktadırlar. Fakat mezbahalarda kesim hijyenine uyulmasının, tek başına karkasların patojen mikroorganizmalarla kontaminasyonunu önlemede yetersiz kaldığı belirtilmiştir. Avrupa Birliği ülkelerinde başta sığır karkasları ile kanatlı karkaslarında dekontaminasyon işlemlerine uzun yıllar izin vermemiş olup, sadece sığır karkaslarında laktik asit uygulamalarına 2013 yılında müsaade etmiştir (Anonymous 2013). Türkiye’de gıda kanunlarının Avrupa Birliği’nin gıda kanunları ile uyumlu olması nedeniyle, sığır karkaslarında laktik asit kullanılmasına ait taslak tebliğ 2016 yılında yayınlanmıştır (Anonim 2016).

Ancak dekontaminasyon işlemleri, mikroorganizmaların ortadan kaldırılması için başvurulacak birinci yol olmamalıdır. Kesim hijyeni birinci sırada olmalı, dekontaminasyon uygulamaları ise sadece olası patojen mikroorganizmalardan ileri gelen bulaşma risklerini ortadan kaldırmaya yönelik olmalıdır. Dekontaminasyon işlemlerinde uygulanabilecek işlemler genelde üç farklı grup altında toplanmaktadır. Bu gruplar

Çizelge 2.4 Dekontaminasyon Uygulamaları (Bolder 1997, Sofos ve Smith 1998, Loretz vd. 2010)

Kimyasal Uygulamalar Fiziksel Uygulamalar

-Organik asitler -Su (sıcak su, buhar)

-İnorganik fosfatlar - Ultra yüksek basınç

- Klor - İrradyasyon

- Bakteriyosinler - Dalgalı alan elektriği

- Oksidizörler (ozon, hidrojen peroksit). - Ultrasonik enerji -Organik koruyucular (benzoatlar, propionatlar). - UV ışınları

kimyasal işlemler, fiziksel işlemler ve her ikisinin birlikte yapıldığı işlemler olarak isimlendirilir. Dekontaminasyon işlemleri genelde kimyasal ve fiziksel uygulamalar altında farklı şekillerde yapılmakta olup, bu uygulamalar çizelge 2.4’de gösterilmiştir (Bolder 1997, Sofos ve Smith 1998, Loretz vd. 2010).

15

Bu uygulamalar dışında son yıllarda yeni alternatif uygulamalarda bulunmakta olup, buna örnek olarak spesifik patojenlerin biyokontrolü için bakteriyofajların da ilave engel (hurdle) olarak çalışıldığı görülmektedir (Yeh vd. 2017).

Dekontaminasyon işlemlerinde yaygın olarak kullanılan organik asitler yapılarında karboksil grubu (COOH) bulunduran, genelde iyonlaşmayan zayıf asitlerdir. Organik asitler fazla sayıda olup laktik asit, malik asit, formik asit, sitrik asit, sorbik asit, propiyonik asit ve tuzları bunlardan bazılarıdır. Organik asitlerin uygulaması diğer dekontaminantlarla birlikte hijyen programının parçası olmalıdır (Bolder 1997).

Amerika Birleşik Devletleri’nde organik asitler yüzey dekontaminantı olarak Tarım Bakanlığı tarafından kullanımına izin verilen ajanlardır. Etin doğal laktik asit miktarı yaklaşık 10g/kg olup etin aromasına katkıda bulunur. Ayrıca etteki laktik asit etin pH-değerini düşürerek, mikrobiyel güvenirliliği sağlar. Değişik organik asitler karkaslara sprey ya da daldırma şeklinde uygulanmakta olup, organik asitler karkasların yüzeyinde bakterisit ya da bakteriostatik etki oluşturur. Aynı zamanda karkaslarda bozulmaya neden olan, Gram negatif bakterilerinde yüzeye tutunmalarını engellemektedirler (Sofos ve Smith 1998).

Laktik asit çözeltilerinin % 1-2 konsantrasyonlarda kullanılmasına bağlı olarak, kesim sonrası ve muhafaza sırasında mikroorganizma sayısının düşürülmesi sağlanmaktadır.

Genelde % 1-2 konsantrasyonda kullanılan laktik asit ette duyusal nitelikler ile renk üzerinde önemli bir değişikliğe neden olmadığı bilinmektedir (Bolder 1997, Sofos ve Smith 1998).

Araştırmacılar (Anderson ve Marshall 1990, Tambly ve Conner 1997) laktik asidin bakteriler üzerindeki azaltıcı etkisinin kullanılan laktik asidin konsantrasyonu, laktik asit çözeltisinin sıcaklık derecesi, uygulama şekli, işlem süresi ve pH-değeri ile ilişkili olduğunu bildirmişlerdir. Tambyl ve Conner (1997) çalışmalarında, S. Typhimurium ile inoküle edilen piliç göğüs derilerinde bakteriyel redüksiyonun laktik asidin konsantrasyonu ve solusyonun sıcaklık derecesine bağlı olarak değişiklik gösterdiğini,

% 4 konsantrasyondaki laktik asidin ortalama 2 log düzeyinde bakteriyel azalmaya neden olduğunu saptamışlardır. Benzer şekilde, Chaine vd. (2013) ise % 5

16

konsantrasyonda bulunan laktik asit solusyonuna 1 dakika süreyle daldırılmış piliç derilerindeki Salmonella bakterilerinde yaklaşık 1.4 log düzeyinde bir azalma olduğunu belirtmişlerdir. Coşansu ve Ayhan (2012) tavuk but ve göğüs etlerinde % 1 ve 3 konsantrasyonda laktik aside 10 dakika süreyle daldırmanın Salmonella Enteritidis sayısında sırasıyla 0.75, 1.21 ve 0.97, 1.72 log azalmaya yol açtığını bildirmişlerdir

Yine dekontaminasyonda kullanılan organik asidin çeşidi, karkas yüzeyinin yağlılığı ve bakteri tipi etkinlikte önemli faktörlerdendir. Laktik asidin etkinliği yağlı karkas yüzeylerinde daha düşüktür. Tamponlanmış laktik asit kullanımı ile normal laktik asitten kaynaklanan renk bozukluklarının önüne geçilebilir. Tamponlu laktik asitte dissosiye olmamış asit molekülleri nedeniyle, ortamın pH-değeri daha düşük olduğundan ortaya çıkan antimikrobiyel etki daha fazla görülür. Bu nedenlerle organik asitler ve özelliklede laktik asit karkas ve et yüzeyleri için uygun dekontaminant özelliklerine sahiptir (Bolder 1997, Sofos ve Smith 1998, Loretz vd. 2010). Mohammed ve Abdel-Naeem (2018) ise yaptıkları çalışmada, sodyum dodesil sülfatın kullanılmasına bağlı olarak, laktik asidin antibakteriyel etkisinin arttığını ve bununda sodyum dodesil sülfatın kanatlı derilerindeki folliküllerin açılmasına bağlı olarak, laktik asidin mikroorganizmalarla direkt etkileşime girmelerinden kaynaklandığını belirtmişlerdir.

Organik asitlerin farklı hayvan türlerine ait etlerde patojen bakteriler üzerine etkilerini araştıran diğer araştırmacılardan, Koutsoumanis vd. (2004) L. monocytogenes’in 4 farklı serotipinin miks karışımıyla kontamine ettikleri sığır eti örnekleri üzerinde, sıcak su (75

oC, 30 saniye daldırma) ve solusyon sıcaklık derecesi yaklaşık 55 ^oC olan % 2’lik laktik asit solusyonuna 30 saniye süreyle ayrı ayrı daldırarak yaptıkları çalışmada L.

monocytogenes sayılarında işlemden hemen sonra sırasıyla 0.82 ve 1.43 log düzeyinde azalma olduğunu tespit etmişlerdir. Araştırmacılar aynı çalışmada örneklerin sıcak su ve laktik aside birlikte daldırıldıklarında ise işlemden hemen sonra tespit edilen azalmanın 2.73 log düzeye ulaştığını bildirmişlerdir. Özdemir vd. (2006a) ise sığır eti örneklerinde

% 1 ve 2 konsantrasyondaki laktik asit ile 82 ^oC’de bulunan sıcak suya 15 saniye süreyle daldırdıkları örneklerde L. monocytogenes sayılarının % 1 ve 2 konsantrasyondaki laktik asit ile işlem görmüş örneklerde muhafaza süresinin 0.

17

gününde sırasıyla 0.69 ve 1.09 log düzeyinde azaldığını saptamışlardır. Ikeda vd. (2003) ise aside adapte edilmiş ve adapte edilmemiş L. monocytogenes ile kontamine ettikleri sığır eti örneklerinde sıcak su (75 ^oC, 30 saniye daldırma) ve % 2’lik laktik asit çözeltisine (55 ^oC) 30 saniye süreyle daldırılarak yapılan dekontaminasyon işlemlerinden hemen sonra örneklerdeki L.monocytogenes sayılarının sırasıyla 1.4-2.0 ve 1.8-2.6 log düzeyinde azaldığını belirtmişlerdir. Anang vd. (2007) laktik asit ve lauricidin’in kanatlı göğüs derilerinde, deneysel olarak kontamine ettikleri L.

monocytogenes, S. Enteritidis ve E. coli O157:H7 üzerine etkilerini araştırdıkları çalışmalarında örnekleri % 0.5, % 1, 1.5 ve 2 konsantrasyonda laktikasit çözeltisine 10, 20 ve 30 dakika süreyle daldırmışlardır. Araştırmacılar bakteriler üzerine en etkili işlemin % 2 laktik asit konsantrasyonunun 30 dakika süreyle işlem gören örneklerde oluştuğunu ve azalmanın L. monocytogenes, S. Enterititis ve E. coli O157:H7 üzerinde sırasıyla 1.97, 1.71 ve 2.59 log düzeyinde bulunduğunu bildirmişlerdir. Sakhare vd.

(1999) ise kanatlı eti üretiminde haşlama tankı, tüy yolma sonrası ve iç organ çıkarma sonrası laktik asit ile yapılan dekontaminasyon işlemleri (% 0.25 laktik asit çözeltisi, 60 saniye daldırma) sonrası örneklerdeki S. aureus sayılarında kontrol grubuna göre önemli düzeyde azalma olduğunu saptamışlardır.

Aynı şekilde laktik asit uygulamalarının bakteriler üzerindeki etkilerini araştıran diğer araştımacılardan Castillo vd. (2001) çözelti sıcaklık derecesi 55 ^oC olan % 4 konsantrasyondaki laktik asidin sprey tarzında soğutulmuş sığır karkas yüzeylerine uygulanması sonucu aerob bakteri sayılarında tespit edilen azalmanın 3.0-3.3 log

düzeyinde bulunduğunu belirtmişlerdir. Liu vd. (2016) ise çözelti sıcaklık derecesi 50 ^oC olan % 1.5 konsantrasyondaki laktik asidin sprey tarzında 15 saniye süreyle

uygulanması sonrası, S. Typhmurium sayılarında yaklaşık 1.5 log düzeyinde azalma tespit etmişlerdir. Yeh vd. (2018) ise sığır etlerinde ultraviole ve bakteriyofajların Salmonella sayıları üzerinde laktik aside oranla daha etkili olduklarını belirtmişlerdir.

Aynı şekilde dekontaminasyon işlemleri kapsamında sıcak su ve buhar da kullanılmaktadır. Sığır mezbahalarında rutin olarak karkasların yıkanmasına bağlı olarak, karkas yüzeyindeki gözle görülebilir kirlerin uzaklaştırılması mümkündür.

Düşük sıcaklık derecesine sahip suyun sprey ve daldırma şeklinde kullanılmasıyla

18

ortaya çıkan antimikrobiyel etki çok düşüktür. Ancak bu amaçla kullanılacak suyun sıcaklık derecesindeki artışa bağlı olarak oluşan antimikrobiyel etki artmaktadır. Sıcak su kullanılmasına bağlı olarak ortaya çıkan antimikrobiyel etki, sıcaklığa bağlı olarak ortaya çıkan letal etkiden kaynaklanmaktadır (Sofos ve Smith 1998, Loretz vd. 2010).

Sıcak suyun sığır karkaslarında dekontaminasyon amacıyla kullanımına ABD’nde ve Avusturalya’da izin verilmiştir (Sofos ve Smith 1998). Yapılan birçok çalışmada dekontaminasyon amacıyla sıcak suyun kullanılmasına bağlı olarak, sıcaklık derecesine göre patojen mikroorganizma sayılarında önemli düzeyde azalma olduğu bildirilmiştir (Smith 1992, Gorman vd. 1995, Dorsa vd. 1997). Ikeda vd. (2003) aside adapte edilmiş ve adapte edilmemiş L. monocytogenes suşları ile kontamine ettikleri sığır eti örneklerinin sıcak su (75 ^oC, 30 saniye daldırma) ile dekontaminasyon işlemleri sonrası bakteriyel azalmanın işlemden hemen sonra 1.4-2.0 log düzeyinde bulunduğunu bildirmişlerdir. Benzer şekilde Özdemir vd. (2006a) ise 82 ^oC’deki sıcak suya 15 saniye süreyle daldırılan, L. monocytogenes ile kontamine edilmiş sığır eti örneklerinde işlemden hemen sonra L. monocytogenes sayısında 0.09 log düzeyinde azalma olduğunu sıcak suya daldırma öncesiı % 1 ve 2 laktik asit çözeltileriyle muamele edilen örneklerde ise sırasıyla ve 0.78 ve 1.05 log düzeyinde bulunduğunu tespit etmişlerdir.

Sıcak suya alternatif olarak karkaslarda dekontaminasyon amacıyla buhar da kullanılmaktadır. Buhar uygulamalarında sıcaklık derecesi 100 ^oC’nin altında kullanıldığı gibi ultra yüksek sıcaklık derecesindeki (ultra-high temperature) buhar da dekontaminasyon amacıyla kullanılmaktadır (Morgan vd. 1996; Loretz vd. 2010).

Buharın sığır karkaslarında dekontaminasyon amacıyla kullanımına ABD’nde USDA/FSIS (Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı/ Gıda Güvenliği ve Kontrol Servisi) tarafından izin verilmiştir (Anonymous 1995). Dekontaminasyon amacıyla buhar uygulaması ile ilgili yapılan çalışmalarda, buharın karkaslardaki toplam aerob bakteri sayısı ve patojen mikroorganizmalar üzerinde etkili olduğu ortaya konmuştur.

Bu kapsamda yapılan bir çalışmada, 98 ^oC’deki buharın 3 dakika uygulanması sonucu kanatlı karkaslarındaki toplam aerob bakteri sayılarının 3.3 log düzeyden daha fazla yıkımlandığı rapor edilmiştir (Avens vd. 2002). Daha düşük derece ve sürede (90 ^oC, 0.2 ve 0.4 dk.) yapılan başka bir çalışmada ise toplam aerob bakteri sayıları ile

19

Enterobactericeae sayılarında sırasıyla 0.4-0.8 ve 0.6-0.7 log düzeyinde azalma bulunduğu bildirilmiştir (Whyte vd. 2003).

Benzer şekilde yeni kesilmiş sığır karkaslarında 8 saniye süreyle uygulanan buhar işlemi sonrası, toplam aerob bakteri sayısının 0.8-0.9 log düzeyinde azaldığı tespit edilmiştir (Nutsch vd. 1997). Araştırmacılar aynı çalışmada buhar işlemi öncesi toplam 140 sığır karkasında E. coli, koliform ve Enterobactericeae’nın sırasıyla örneklerin % 16.4, 37.9 ve 46.4’nde bulunmuş olmasına karşın, işlem sonrası bu oranın örneklerde sırasıyla % 0, 1.4 ve 29 düzeyine düştüğü bildirilmiştir. Hochreutener vd. (2017) ise 82℃’nin üzerinde sıcaklık derecesine sahip buhar uygulamasına bağlı olarak, sığır karkaslarının koltuk altı, but, sırt ve göğüs bölgesinde toplam aerob bakteri sayılarında sırasıyla 0.9, 0.7, 0.6 ve 0.4 log düzeyde azalma olduğunu belirtmişlerdir. James ve arkadaşları ise buhar uygulamalarına bağlı olarak C. jejuni ve E. coli sayılarında yüksek düzeyde azalma olduğunu bildirmişlerdir (James vd. 2007). Yine buhar uygulamalarının karkaslarda patojen mikroorganizmalar üzerine etkilerini araştıran araştırmacılardan McCann vd. (2006) ise, E. coli O157:H7 ve Salmonella Typhimurium’un sırasıyla 3.5- 6.2 log düzeyinde azaldığını rapor etmişlerdir. Diğer bir araştırmacı grup ise yaptıkları bir çalışmada L. monocytogenes, E. coli ve Salmonella Typhimurium ile kontamine ettikleri sığır etlerinde 15 saniye süreyle farklı buhar uygulamalarına maruz bırakılan örneklerde patojen bakteri sayılarında 2.5-3.7 log düzeyinde azalma oluştuğunu saptamışlardır (Phebus vd. 1997).

20 3. MATERYAL VE METOT

3.1 Materyal

Bu çalışmada materyal olarak, süper marketten alınan (M. longissimus dorsi) sığır bel kası eti kullanılmıştır. Farklı konsantrasyonlarda laktik asit (LA) çözeltilerinin ve sıcak buharın (SB) L. monocytogenes ve S. aureus üzerine etkisinin belirlenmesi amacıyla alınan sığır eti soğuk zincirde laboratuvara getirilmiştir. Bunu takiben, öncelikle aseptik koşullarda mevcut mikrofloranın minimize edilmesi amacıyla traşlanıp yaklaşık 5x5 cm boyutlarında ve 0.1-0.2 cm kalınlığında (yaklaşık 13-15 g) kesilmiştir. Daha sonra örneklerin yüzeyleri bek ateşinde arkalı önlü olmak üzere birer kez alazlanarak, olası rekabetçi mikrofloranın daha da minimize edilmesi amaçlanmıştır (Şekil 3.1). Patojen bakteriler üzerine dekontaminasyon işleminin etkisinin belirlenmesi ve pH-değerlerinin saptanması için toplam 192 adet sığır eti örneği hazırlanmış ve deneme materyali olarak kullanılmıştır. Bu çalışmaya ilave olarak yapılan başka bir denemede ise, farklı konsantrasyonlardaki LA çözeltileri ve SB uygulamalarının sığır etinde toplam aerob bakteri (TAMB) sayısı üzerine etkisinin belirlenmesi için piyasadan temin edilen ve yukarıda belirtilen boyutlarda hazırlanan toplam 48 adet sığır eti örneği kullanılmıştır.

Şekil 3.1 Örneklerin hazırlanması

21

3.1.2 Çalışmada kullanılan besi yerleri ve diğer kimyasallar

3.1.2.1 Listeria selektif agar’ın hazırlanması

Hazır dehidre Listeria Selektif Agar (LSA) (Merck 1.07004) besiyerinden 27.75 g tartılarak, üzerine 500 ml distile su ilave edilmiş, daha sonra karıştırılarak pH’sı 7.0±0.2’ye ayarlanıp, sıcak su banyosunda agar eriyene kadar yaklaşık 40-45 dakika bekletilip, 121 ^oC’de 15 dakika süreyle otoklavda sterilize edilmiştir. Daha sonra besi yeri yaklaşık 50 ^oC’ye kadar soğutularak, üzerine 1 vial selektif supplement (Merck 1.07006) ilave edilip 12-13 ml hacimdeki steril petrilere dökülmüş, kurumaya bırakılan besiyerleri daha sonra kullanılmak üzere buzdolabında muhafaza edilmiştir.

3.1.2.2 Baird parker agarın hazırlanması

Bu amaçla hazır dehidre Baird Parker (BP) Agar (Merck 1.05406) besiyerinden 63 g tartılarak, üzerine 1 litre distile su ilave edilmiş, daha sonra karıştırılarak pH’sı 6.8±0.2’ye ayarlanıp, sıcak su banyosunda agar eriyene kadar yaklaşık 40-45 dakika bekletilmiş, ardınan 121 ^oC’de 15 dakika süreyle otoklavda sterilize edilmiştir. Bunu takiben besi yeri yaklaşık 50 ^oC’ye kadar soğutularak, üzerine 50 ml Egg Yolk Tellurit Emülsiyon (Merck 1.03785) ilave edilip karıştırılmış, steril petrilere 12-13 ml dökülerek hazırlanan besiyerleri kurumaya bırakılmış ve sonra da kullanılmak üzere buzdolabında muhafaza edilmiştir.

3.1.2.3 Tryptone soya agarın hazırlanması

Hazır dehidre Triypton Soya Agar (TSA) (Oxoid CM 0131) besiyerinden 40 g tartılarak üzerine 1 litre damıtık su ilave edilmiş daha sonra karıştırılarak pH’sı 7.3±0.3’e ayarlanmış ve sıcak su banyosunda agar eriyene kadar yaklaşık 40-45 dakika bekletilmiştir. Besiyeri daha sonra 121 ^oC’de 15 dakika süreyle otoklavda sterilize edilmiş, bunu takiben besi yeri yaklaşık 50 ^oC’ye kadar soğutularak, steril petrilere dökülmüştür.

22

3.1.2.4 Brain heart ınfusion broth’un hazırlanması

Hazır dehidre Brain Heart Infusion (BHI) Broth (Oxoid, CM 0225) besiyerinden 37 g tartılıp 1 litre damıtık su içerisinde çözdürülerek pH’sı 7.4±0.4’e ayarlanmış, daha sonra 10’ar ml tüplere paylaştırılarak, 121 ^oC’de 15 dakika süreyle otoklavda sterilize edilmiştir.

3.1.2.5 Peptonlu su

Pepton’dan (Merck) 1.0 g tartılarak, üzerine 1 litre damıtık su ilave edilmiş ardına pH’sı 7.2±0.2’e ayarlanmış, daha sonra kullanım amacına göre erlende ve/veya mikrobiyolojik ekimlerde dilüsyonları hazırlamak amacıyla 9’ar ml tüplere paylaştırılıp 121 ^oC’de 15 dakika süreyle otoklavda sterilize edilmiştir.

3.1.2.6 Hidrojen peroksit

Bu çalışmada katalaz testi yapmak amacıyla hazır hidrojen peroksit (% 30; Merck) çözeltisinden % 3 (v/v) konsantrasyonda hazırlanarak, katalaz testlerinde kullanılmıştır.

3.1.3 Referans suşlar

Bu çalışmada referans suş olarak L. monocytogenes (Oxoid, ATCC 7644) ile sığır kıymasından klasik kültür tekniği ile izole edilerek PCR tekniği ile doğrulanmış (vetglm.13) saha suşu, S. aureus’un ise metisiline dirençli (Oxoid, ATCC 25923) suşu ile sığır etinden klasik kültür tekniği ile izole edilerek, PCR tekniği ile doğrulanmış (vetgsa37) saha suşları kullanılmıştır.Saha suşları Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalından Prof. Dr. Haydar ÖZDEMİR’den temin edilmiştir.

23 3.2 Yöntem

3.2.1 Örneklerin deneysel olarak kontamine edilmesi

Bu çalışmada örnekler L. monocytogenes’in 1:1 oranında karışım olarak hazırlanan suşlarıyla (ATCC7644+vetglm.13) yaklaşık 6.8x10⁵ kob/g, S. aureus’un yine 1:1 oranında karışım olarak hazırlanan suşlarıyla (ATCC25923+vetgsa37) ise yaklaşık 2.0x10⁷ kob/g düzeyinde kontamine edilmiştir. Bu amaçla stok kültürler önce 10 ml BHI Broth’a aşılanmış ve 37 ^oC’de, 24 saat süreyle inkübasyona bırakılarak aktive edilmiştir. Daha sonra bu sıvı kültürlerden tekrar BHI broth’a geçilmiş ve 37 ^oC’de, 24 saat süreyle inkübasyona bırakılarak suşların zenginleştirilmesi ve sayımları (kob/ml) yapılmıştır. Bunu takiben örnekler, L. monocytogenes ve S. aureus suşlarının 1 litrelik kavanozlarda hazırlanan 24 saatlik karışım halindeki sıvı kültürlerine (180 mL %0.85 NaCl içeren fizyolojik tuzlu su + 20 mL kültür) ayrı ayrı 5 dakika süreyle daldırılmış ve daha sonra steril bir kaba alınarak, bakterilerin et yüzeyine tutunması amacıyla oda sıcaklığında 30 dakika bekletilmiştir (Capita vd. 2002).

3.2.2 Laktik asit ile dekontaminasyon işlemlerinin yapılması

Bu amaçla, laktik asit stok çözeltisinden (% 60 w/v LA; Merck 1.00366) çeşme suyu kullanılarak farklı konsantrasyonlarda (% 1, pH: 2.54; % 2, pH: 2.34; % 3, pH: 2.20) laktik asit çözeltileri hazırlanmıştır. Deneysel olarak kontamine edilen örnekler, yaklaşık 18-20 ^oC’deki LA çözeltilerine 60 saniye süreyle daldırılarak, dekontaminasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada toplam 6 farklı grup oluşturulmuştur. Bunlar; (1) Çeşme suyu, 18-20 ^oC, kontrol grubu; (2) % 1 LA; (3) % 2 LA; (4) % 3 LA; (5) SB 97-98 ^oC 15 saniye; (6) % 2 LA+SB 97-98 ^oC 15 saniye süreyle işlem uygulanan gruplardır. Dekontaminasyon işlemleri sonrası ise örnekler fazla sularının süzülmesi için yatay olarak hafif eğimli konuma getirilen tepsilerde yaklaşık 5 dakika süreyle bekletilmiş, ardına ayrı ayrı steril cam kavanozlara (0.5 L) alınarak, 4 ºC’de 5 gün süre muhafaza edilmiştir. Örneklerin muhafaza süresinin 0., 1., 3. ve 5. günlerinde mikrobiyolojik analizleri yapılmış ve ayrıca pH-değerleri ölçülmüştür. Bu çalışma

24

L. monocytogenes ve S. aureus ile kontamine edilen deneysel örneklerde aynı koşullarda farklı zamanlarda bağımsız iki tekrarlı olarak yapılmıştır. Diğer yandan bu çalışmaya ilave olarak yapılan LA çözeltileri ve SB uygulamalarının sığır etinde toplam aerob bakteri (TAMB) sayısı üzerine etkisinin belirlenmesi amacıyla, piyasadan temin edilen et iki eşit parçaya ayrılarak tek seferde iki tekrarlı olarak olarak yapılmıştır.

3.2.3 Sıcak buhar uygulaması ile dekontaminasyon işleminin yapılması

Bu çalışmada hazırlanan örneklerden bir grubu yaklaşık 97-98 ^oC sıcaklığındaki SB ile 15 saniye süreyle işleme tabi tutulmuştur. Buhar uygulamaları için, bu amaca uygun olarak tasarlanan ve paslanmaz sacdan yüksekliği 120 cm, çapı 60 cm boyutlarında yaptırılan kapalı buharlama ünitesi kullanılmıştır. Buhar kazanı üzerinde buhar girişi, buhar tahliyesi, örneklerin buhar kazanı içerisinde asılı tutulmasını sağlayacak düzeneği ve buhar kontrolü gibi ayrıntıları bulunan özellikte yaptırılmıştır. Buhar uygulanması sırasında buharlama ünitesi iç sıcaklığı metal uçlu bir termometre ile üstteki açıklıktan manuel olarak kontrol edilmiştir.

Şekil 3.2 Buharlama ünitesinde örneklerin sıcak buhar ile muamelesi

25 3.2.4 Mikrobiyolojik analizler

3.2.4.1 Çalışma örneklerinde L. monocytogenes ve S. aureus varlığının araştırılması

Çalışmada kullanılacak et örnekleri, laboratuarda aseptik koşullarda hazırlandıktan ve rekabetçi floranın azaltılması amacıyla yüzeyleri bek ateşinde alazlandıktan sonra, muhtemel L. monocytogenes ve S. aureus varlığı yönünden analiz edilmiştir. Örneklerde L. monocytogenes ile S. aureus’un varlığı ISO (Anonymous 2003b; Anonymous 2004) belirttiği prensibe göre yapılmıştır.Bu amaçla deneysel inokulasyon öncesi hazırlanan çalışma örneğinden 25 gram alınarak, üzerine 225 ml half Fraser Broth (Oxoid, CM0895) ilave edilmiş, stomacher cihazında(AES Lab., Easy Mix, France) 100 rpm’de 2,5 dakika süreyle homojenizasyon yapılarak 30 ^oC’de 24 saat süreyle ön zenginleştirme işlemi yapılmıştır. Bunu takiben öz zenginleştirme sıvısından 0.1 ml alınmış ve içerisinde 10 ml Frase broth bulunan tüpe aşılama yapılarak, tüpler 35-37

Çalışmada kullanılacak et örnekleri, laboratuarda aseptik koşullarda hazırlandıktan ve rekabetçi floranın azaltılması amacıyla yüzeyleri bek ateşinde alazlandıktan sonra, muhtemel L. monocytogenes ve S. aureus varlığı yönünden analiz edilmiştir. Örneklerde L. monocytogenes ile S. aureus’un varlığı ISO (Anonymous 2003b; Anonymous 2004) belirttiği prensibe göre yapılmıştır.Bu amaçla deneysel inokulasyon öncesi hazırlanan çalışma örneğinden 25 gram alınarak, üzerine 225 ml half Fraser Broth (Oxoid, CM0895) ilave edilmiş, stomacher cihazında(AES Lab., Easy Mix, France) 100 rpm’de 2,5 dakika süreyle homojenizasyon yapılarak 30 ^oC’de 24 saat süreyle ön zenginleştirme işlemi yapılmıştır. Bunu takiben öz zenginleştirme sıvısından 0.1 ml alınmış ve içerisinde 10 ml Frase broth bulunan tüpe aşılama yapılarak, tüpler 35-37