Rekabet Stratejileri Modeli

Microsatellite Arrays”) (Lunt et al., 1999)

Para a prospecção dos microssatélites foi utilizada a metodologia PIMA descrita por Lunt et al. (1999), que é baseada em um enriquecimento de fragmentos RAPD seguido pelo isolamento por meio da PCR com primers

repeat-específicos. Os principais passos estão resumidamente explicados no

Figura 4: Esquema resumido evidenciando as principais etapas

da metodologia PIMA

Seleção das colônias recombinantes(brancas) Obtenção de

ampliconsde RAPD

Purificação dos fragmentos

Ligação dos fragmentos em plasmídeos Transformação em E. coli Dh5α PCR das colônias Seleção dos candidatos Construção de placa réplica Mini-Prep Sequenciamento

Análise das sequências e desenho dos primers Seleção das colônias recombinantes(brancas) Obtenção de

ampliconsde RAPD

Purificação dos fragmentos

Ligação dos fragmentos em plasmídeos Transformação em E. coli Dh5α PCR das colônias Seleção dos candidatos Construção de placa réplica Mini-Prep Sequenciamento

Análise das sequências e desenho dos primers Seleção das colônias recombinantes(brancas) Obtenção de

ampliconsde RAPD

Purificação dos fragmentos

Ligação dos fragmentos em plasmídeos Transformação em E. coli Dh5α PCR das colônias Seleção dos candidatos Construção de placa réplica Mini-Prep Sequenciamento

Análise das sequências e desenho dos primers Seleção das colônias recombinantes(brancas) Obtenção de ampliconsde RAPD Obtenção de ampliconsde RAPD Purificação dos fragmentos Purificação dos fragmentos

Ligação dos fragmentos em plasmídeos Ligação dos fragmentos

em plasmídeos Ligação dos fragmentos

em plasmídeos Transformação em E. coli Dh5α Transformação em E. coli Dh5α PCR das colônias PCR das colônias Seleção dos candidatos Seleção dos candidatos Construção de placa réplica Construção de placa réplica Construção de placa réplica Mini-Prep Sequenciamento

4.3.1. Obtenção dos amplicons de RAPD

Inicialmente foram realizados alguns testes visando ajustar as condições da RAPD-PCR, variando-se as concentrações dos componentes da reação e as temperaturas de anelamento. A reação foi padronizada de 100 ng de DNA, 5 pmol de primer, tampão de reação 1 x (50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,3), Mg Cl2 3 mM, 125 µM de cada dNTP, 2 U de Taq polimerase em

um volume final de 50 µL. Um controle negativo, ou seja, sem a presença de DNA, sempre foi utilizado para cada conjunto de reações, com a função de averiguar a presença acidental de contaminações. O programa para amplificação inicia com uma desnaturação inicial de 5 minutos a 94º C, seguida de 45 ciclos com temperatura de desnaturação de 94º C (1 min), temperatura de pareamento de 37º C (1 min) e temperatura de extensão de 72º C (2 min) e uma extensão final de 5 minutos a 72º C, em um termociclador MJ Research modelo PT100 de 96 amostras.

Uma única amostra de B. hilarii foi utilizada para a obtenção dos fragmentos de RAPD. Um total de 13 primers foi testado para selecionar aqueles que produzissem o maior número de fragmentos (Tabela 3).

Tabela 3: Seqüência dos primers de RAPD testados. Primer Seqüência (5´- 3´) A GTG AGG CGT C B CAT TCG AGC C C CCC GCT ACA C E AAC GCG TCG G OPP-13 GGA GTG CCT C OPP-18 GGC TTG GCC T OPK-19 CAC AGG CGG A 1 GGT GCG GGA A 2 GTT TCG CTC C 3 GTA GAC CCG T 4 AAG AGC CCG T 5 AAC GCG CAA C 6 CCC GTC AGC A

4.3.2. Purificação e clonagem dos amplicons RAPD

Os produtos da RAPD-PCR obtidos foram purificados com o kit “Wizard PCR Preps DNA Purification System” (Promega) seguindo as recomendações do fabricante.

Para ligação dos insertos, foi utilizado o kit de ligação pGEM-T Easy System (Promega), que permite a seleção dos recombinantes pelo sistema azul/branco. Este sistema se resume à capacidade da bactéria hospedeira produzir a enzima β-galactosidase que faz a quebra do substrato X-Gal, produzindo colônias azuis em placas indicadoras contendo IPTG e X-Gal. A

enzima, produto do gene lac Z, pode ser separada em dois domínios – α- fragmento (localizado no vetor) e ω-fragmento (no DNA da bactéria hospedeira). Os dois fragmentos interagem para formar a β-galactosidase funcional, processo conhecido como α-complementação. Se o inserto de interesse é ligado ao vetor, esta ligação se dá em um sítio localizado dentro do α-fragmento, interrompendo assim sua seqüência codificante. Conseqüentemente, não ocorre a α-complementação e as bactérias não podem quebrar o X-Gal conferindo assim às colônias recombinantes a cor branca (http://www.promega.com/guides/dna_guide/dna_guide.pdf).

A transformação por choque térmico foi realizada com células competentes de Escherichia coli DH5α, que posteriormente foram crescidas em placas contendo meio de cultura Lura-Bertani (LB) ágar e ampicilina (100 µg/mL) e cresceram em estufa a 37º C overnight.

Cada colônia recombinante (branca) foi transferida a uma placa LB ágar réplica (ampicilina 100 µg/mL) e a 1 poço dos 96 existentes em placas de crescimento (mega-titer plate – Applied Biosystem), contendo 1mL de meio líquido Circle Grow e ampicilina (100 µg/ml). Foram selecionadas colônias até que se completassem os 96 poços da placa de crescimento. Efetuou-se o crescimento overnight a 37º C das colônias de ambas as placas, sendo que a placa de crescimento foi mantida em agitação.

4.3.3. PCR das colônias

Após o crescimento overnighIt, foram realizadas amplificações por PCR diretamente das colônias em placas próprias para termociclador também com capacidade de 96 amostras (micro-titer plate thermal cycler –

Applied Biosystem), utilizando os primers do vetor - M13 Forward [5’-

d(GTAAAACGACGGCCAGT)-3’] e M13 Reverse [5’- d(GGAAACAGCTATGACCCATG)-3’], juntamente com o primer repeat- específico, ou seja, flanqueador de seqüências repetitivas (5’TGTGGCGGCCGC(TG)8V-3’) conforme descrito por Lunt et al. (1999) para

a metodologia PIMA. Cada reação deve conter tampão padrão de reação 1x (50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,3), 1,5 mM MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 5

pmol de cada um dos primers, 1 U de Taq DNA polymerase e o DNA molde transferido com um replicador (96 pinos) em um volume final de 20 µL. O programa para amplificação consistiu de uma desnaturação inicial a 94º C por 5 minutos, 40 ciclos com temperatura de desnaturação de 95º C (40 s), temperatura de hibridação de 55º C (40 s) e temperatura de extensão de 72º C (1,0 min), e uma extensão final de 10 minutos a 72º C.

Em seguida, após análise em gel de agarose 1%, as amostras que apresentaram uma banda adicional foram selecionadas para sequenciamento, pois uma banda refere-se ao fragmento amplificado pelos

primers do vetor e a outra ao produto de amplificação do primer repeat-

específico, indicando assim a presença de uma provável seqüência repetitiva. A partir dessas colônias positivas foram realizadas mini-

preparações para purificação dos plasmídeos para então, serem seqüenciados.

4.3.4. Mini-prep

As mini-preparações foram realizadas segundo Sambrook et al. (1989) com algumas adaptações:

1) Após crescer as bactérias selecionadas em meio líquido em tubos de 50 mL a 37º C overnight com agitação, transferir o conteúdo enchendo um tubo de 2 mL e centrifugar por 30 segundos. Descartar o sobrenadante e repetir esse processo com todo o conteúdo.

2) Adicionar 400 µL da solução I (0,4 mg/mL RNAase, 10 M Tris-HCl, 0,004 M EDTA) e agitar o tubo.

3) Adicionar 400 µL da solução II (0,2 M NaOH, SDS 1%) e mexer o tubo até que o conteúdo fique bem viscoso.

4) Acrescentar 400 µL da solução III (3 M acetato de potássio, ácido acético 11,5%), mexer o tubo e centrifugar por 5 minutos.

5) Transferir o sobrenadante para um novo tubo contendo 800µL de isopropanol 100% e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos.

6) Centrifugar durante 10 minutos e descartar o sobrenadante.

7) Adicionar 200 µL de etanol 70%, centrifugar por 5 minutos e descartar o sobrenadante.

8) Acrescentar 200 µL de etanol 100%, centrifugar por 5 minutos e descartar o sobrenadante.

9) Secar na estufa 37º C.

10) Adicionar 20 µL de água deionizada ao pellet contido no tubo.

4.3.5. Seqüenciamento

Para cada amostra, foram realizadas duas reações de seqüenciamento, uma com o primer M13 Foward e outra com o M13

Reverse, de modo que nenhuma informação fosse perdida no caso de

seqüências muito grandes.

Os fragmentos de interesse foram seqüenciados com a utilização do kit DYEnamic ET Terminator Cycle SequencingTM (Perkin Elmer) em um seqüenciador automático ABI 377 (Applied Biosystems, Inc.) pertencente ao laboratório de Biologia Molecular da Universidade Federal de São Carlos, de responsabilidade do prof. Dr. Flávio Henrique da Silva.

4.3.6. Análise das seqüências e desenho dos primers

Em cada uma das seqüências obtidas, foi realizada a busca por microssatélites. Para tanto, consideramos seqüências microssatélites quando o número de repetições foi maior do que 10 para repeats mononucleotídeos, 6 para dinucleotídeos, 4 para trinucleotídeos, e maior do que 3 para tetra, penta e hexanucleotídeos (Stalling et al., 1991; Estoup et al., 1993b).

Dentre esses, ainda os classificamos como perfeitos aqueles em que as repetições são ininterruptas, ao contrário dos imperfeitos, que apresentam interrupções entre as unidades repetitivas e, os compostos, constituídos por mais de um repeat (Tassanakajon et al., 1998).

As seqüências repetitivas foram buscadas com a utilização do programa Tandem Repeats Finder (Benson, 1999) disponível na Internet (http://c3.biomath.mssm.edu/trf.html), e também visualmente. Para os fragmentos que continham microssatélites, foi efetuado primeiramente o alinhamento das seqüências respectivas ao sequenciamento com o primer M13 Forward e com o primer Reverse, por meio do programa Multalin

(Corpet, 1988) disponível na internet (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html). A partir da seqüência

consenso é que foi desenhado o primer com a utilização do programa computacional GeneRunner (Hastings Softwares, INC, Hastings, NY, USP).