Proteazların endüstrideki uygulama alanları

Proteolitik enzimler, diğer biyoteknolojik enzimler arasında en geniş ticari uygulaması olan enzimlerdir. Deterjan, deri endüstrisi, ilaç endüstrisi, tekstil endüstrisi, süt endüstrisi uygulama alanlarının büyük bir kısmını oluşturmaktadır. Protein bazlı kirlerin uzaklaştırılması amacı ile en geniş kullanım alanını deterjan endüstrisi oluşturmaktadır. Tekstil endüstrisinde kullanımı ham ipek üzerindeki sert ve yapışkan kısmın uzaklaştırılmasını kapsamakta olup daha yumuşak ipek ürünlerinin elde edilmesi sağlanmaktadır. Deri endüstrisinde ise tüy giderme proseslerinde kullanılmaktadır. X-ışını filmlerinden jelatin kaplamalarının hidrolizi ile üzerindeki gümüşün geri kazanımı proteazlar ile gerçekleştirilmektedir. Kontak–

lenslerden proteinlerin uzaklaştırılmasını sağlayan enzim temizleyiciler biyofarmatik ürünler içinde önemli bir yer tutmaktadır [5,6,10,20,63].

Günümüzde deterjan endüstrisinde kullanılan enzimlerin %89’unu subtilisinler ve/veya Bacillus soyundan saflaştırılan proteazlar oluşturmaktadır. Deterjan proteazı seçimin de en önemli parametre enzimin pI değeridir. Deterjan çözeltisinin pI değeri enzimin pI değerine ne kadar yakın olursa o kadar iyi performans gösterir. Özellikle yüksek sıcaklık ve pH’larda büyüyen Bacillus soylarından üretilen proteaz enzimleri deterjanlarda kullanılmaktadır, yüksek sıcaklıklara çıkıldıkça daha etkin yıkama elde edilebilmektedir [64].

Deri endüstrisinde kıl giderme işlemleri esnasında kullanılan sülfid atıkları doğa için oldukça zararlıdır [65]. Deri endüstrisi atıklarının % 80–90’ını bu işlemde kullanılan sülfit atıkları oluşturmaktadır [66]. Enzimlerin alternatif kimyasallara karşı kullanılması hem deri kalitesini arttırmakta hem de çevresel kirliliği azaltmaktadır. Proteazlar derideki nonkolojen bileşenleri selektif olarak hidrolizler, aynı zamanda albumin ve globin gibi globular proteinlerin de uzaklaştırılmasını sağlar. Bu adım alkali ortamda gerçekleştirilmektedir. Mikrobiyal alkalen proteazların bu adımda kullanılması ile süreden ve kimyasallardan oldukça fazla kazanımlar elde edilmektedir.

Süt endüstrisinin temel uygulamasını peynir üretimi oluşturmaktadır. Sütün pıhtılaşmasını sağlayan enzimler üç kategoride toplanmaktadır: (i) hayvansal rennetler (kimosin), (ii) mikrobiyal süt pıhtılaştırıcılar, (iii) genetik olarak değişime uğratılmış kimosin. Peynir yapımında proteazların ana fonksiyonu spesifik peptid bağlarını (Phe 105, Met 106 arasındaki bağlar) hidrolizleyerek p-kazein ve makropeptid oluşturmaktır. Kimosin bu amaçla kazeine karşı yüksek özgünlüğünden dolayı peynir yapımında oldukça iyi bir performans sergilemektedir. Günümüzde ise peynir yapımı için rekombinant kimosinler üretilmektedir [10]. Rennet aktivitesi ile kazein sütte pıhtılaşır ve süt bileşenleri katı faz ve sıvı faz olarak iki kısma ayrılır. Katı faz lor peyniri olarak ayrılır ve sonrasında olgunlaştırma enzimleri olan proteazlarla muamele edilerek olgunlaşmış peynir elde edilir. Peynir yapımında saf

kimosinin farklı karışımları ile sığır pepsini ve mikrobiyal rennin enzimleri gibi farklı rennin preparatları kullanılır[3,10].

Unlu gıdalarda proteazlar; gluten olarak adlandırılan çözünmeyen proteinleri modifiye etmek için kullanılır. Aspergillus oryzae’den saflaştırılan endo ve ekzo peptidazlar gluteni sınırlı proteoliz ile modifiye ederler [10]. Hamur hazırlanması sırasında gluten proteinleri su ile bağ yaparak ince kafes (lattice) yapısını oluştururlar. Proteazlar gluten proteinin bağlarını kırarak oluşan yapıyı daha ılımlaştırırlar. Böylelikle hamurun direnci azalır ve gevşer. Hamur, mayanın fermentasyonu esnasında açığa çıkan CO2’nin geçişine izin verecek yumuşaklıkta

olmalıdır. Gluten; gliadin ve glutenin olarak iki farklı protein yapısında bulunur. Farklı proteazlarla katalizlenen reaksiyonların, bu proteinlerin modifikasyonları üzerinde tamamen farklı etkileri bulunmaktadır. Fungal proteazlar nötral ya da zayıf asidik pH’da optimum aktivite gösterirler. Gluteni spesifik olarak hidrolizlerler. Hidrolizin başlangıcında seçimli olarak bağ kırılması gerçekleşir. Nötral bakteriyel proteazlar ise non-spesifik olarak bağ kırınımı gerçekleştirip, glutenin tamamen hidrolizine sebep olur. Bu yüzden enzim preparatları yapılacak uygulama tekniğine göre seçilmelidir [3].

Soya fasulyesi zengin içerikli proteinlerinden dolayı gıda endüstrisi için zengin bir kaynak oluşturmaktadır. Soya sosu ve soya ürünleri eldesinde proteazlar çok eski çağlardan beri kullanılmaktadır. Soya sosu oluşturmada fungal alkalen ve nötral proteazlar en çok kullanılan enzimlerdir. Soya proteinlerinin proteolitik modifikasyonu fonksiyonel özelliklerini arttırmaya yardımcı olmaktadır. Soya proteinlerinin pH 8’de alkalaz ile muamelesi ile daha az acı olan yüksek çözünürlüğe sahip protein hidrolizatlarının oluşumu sağlanır. Oluşan hidrolizatlar birçok amaç için gıda endüstrisinde ve sert olamayan içeceklerde kullanılmaktadırlar.

Aspartam tatlandırıcı olarak gıda ve ilaç endüstrisinde kullanılmaktadır. L-aspartik asit ve L-fenil alanin metil esterinin birleşimi olan bir dipeptiddir. Đki amino asidin L-konfigürasyonu aspartamın tatlı tadından sorumludur. Aspartamın kimyasal metodlarla üretilmesi oldukça maliyetli bir prosestir. Bu yüzden enzimatik sentez tercih edilmektedir. Proteazlar hidrolitik enzimler olmasına rağmen kinetik kontrollü

reaksiyonlarda tersinir reaksiyonları da katalizleyebilmektedirler. Bacillus thermoprotyolticus tarafından üretilen termolizin aspartamın enzimatik sentezinde kullanılmaktadır.

Protein hidrolizatlarının acı tadı gıda ve sağlık bakım ürünlerinde kullanımlarına büyük bir engel oluşturmaktadır. Acılığın yoğunluğu hidrolizat içindeki hidrofobik amino asitlerin sayısıyla orantılıdır. Peptid merkezindeki prolin kalıntılarının varlığı da acılığa katkıda bulunur. Prolin ve hidrofobik amino asitleri ayırabilen peptidazlar; protein hidrolizatlarının acılığının giderilmesinde kullanılır. Laktik asit bakterilerinden elde edilen aminopeptidazlar Debitrase ticari adı altında mevcuttur. Karboksipeptidaz A hidrofobik amino asitlere yüksek spesifisiteye sahip olduğundan acılık giderme için büyük bir potansiyele sahiptir. Proteazların geniş spesifisitesi ve çeşitliliği tedavi edici ajanların gelişiminde büyük bir avantaj olarak kullanılır. Subtilisin ya da kollegenaz yanık ve yara tedavisinde antibiyotiklerle birlikte kullanılır. E .coli’den izole edilen Asparaginaz lemfositik lösemilerin çeşitli formlarında kan akışından asparagini elimine etmek için kullanılmaktadır [10].

Proteazların peptid sentezinde kullanımı oldukça yaygındır. Peptid sentezinde proteazların kullanımının kimyasal metotlara karşı birçok üstünlüğü bulunmaktadır. Bunlar: stereospesifik ürün oluşumu, non-polar substratların çözünürlüğünün artması, termodinamik dengenin hidrolizden sentez yönüne kayması şeklinde sıralanabilir. Bu uygulamada en büyük sınırlama enzimlerin susuz ortamda aktivitelerini kaybetmeleridir. Proteazlar dipeptid ve tripeptid sentezinde regioselektif şeker esterifikasyonunda ve peptid esterlerinin dia-steroselektif hidrolizlerinde başarı ile kullanılmaktadırlar. Peptid sentezinde ve rasemik karışımların ayrılmasında alkalen proteazların kullanıldığı çok sayıda yayın rapor edildiği bildirilmiştir [11]. Organik çözücüler proteaz aktivitelerini güçlü bir şekilde etkilemektedirler. α–kimotripsin ve subtilisin Carlsberg’in kullanıldığı peptid sentezi reaksiyonları başarı ile gerçekleştirilmiştir.

Alkalen proteazlar X-ışını ya da fotoğraf filmlerden gümüş geri kazanımında kullanılmaktadır. Atık filmlerin jelatin tabakalarının ağrılıklarının %1.5–2’sini gümüş oluşturmaktadır. Gümüş, jelatin ile bağ yapabildiğinden proteolitik

uygulamalarla geri kazanılabilmektedir. Jelatinin enzimatik hidrolizi ile sadece gümüş geri kazanılmış olmaz aynı zamanda polyester filmlerin de geri dönüşümü sağlanmış olur.

Proteazların bir başka uygulama alanı ipek endüstrisidir. Serisin; ham ipeğin toplam ağırlığının % 25’ini oluşturan, ham ipek iplikleri kaplayan ve ipliklerin pürüzlü bir yapıya sahip olmalarına sebep olan yapışkan bir maddedir. Serisin ipliklerden konvensiyonel olarak nişasta kullanılarak uzaklaştırılır. Ancak bu yöntem oldukça maliyetlidir. Bu işleme alternatif yöntem proteazların uygulanmasıdır. Proteazlar ile serisinin uzaklaştırılması maliyeti ve işlem süresi azaltmaktadır [11].

Alkalen proteazlar D ve L-amino asitlerin sentezinde ve ayrılmasında da kullanılmaktadırlar. Amino asitler insanlar ve evcil hayvanlar için temel beslenme öğesidir. Canlılar sadece L-amino asitleri sindirebilmektedirler ve amino asitlerin kimyasal sentezi ile de rasemik karışımlar oluştuğu için ticari olarak bu rasemik karışımların ayrılması büyük önem taşımaktadır. Düşük molekül ağırlıklı (6.8 kDa) C. coronatus’dan saflaştırılan alkalen proteaz D,L-fenil alanin ve D,L-fenil glisin rasemik karışımlarını başarı ile ayırabilmektedir. Subtilisin carlsberg ile de aynı uygulama gerçekleştirilebilmektedir. N-korunmuş amino asit esterlerinin organik çözücü içinde kinetik olarak ayrılması organik çözücü varlığında stabil olan endüstriyel alkalen proteaz ‘Alkalaz’ ile sağlanmıştır. Bu enzim B. licheniformis’de izole edilmiş olup, subtilisin carlsberg sınıfının ana üyesidir. Endüstriyel ve medikal uygulamalarının yanı sıra proteazlar temel araştırmalarda da önemli rol oynamaktadırlar. Peptid bağ yıkımına karşı özgünlüklerinden dolayı yapı–fonksiyon ilişkisi ve proteinlerin amino asit dizilişleri ile ilgili çalışmalarda da kullanılmaktadırlar [10].