Aktif bölgelerindeki fonksiyonel gruplarına göre proteazlar

Proteazlar aktif bölgelerindeki fonksiyonel gruplara bağlı olarak serin proteaz, aspartil proteaz, sistein proteaz ve metaloproteaz olmak üzere dört gruba ayrılır. Aktivitesi için ATP ihtiyacı olan ATP-bağımlı proteaz gibi çok az proteazlar standart sınıflandırmaya dahil olmazlar. Bu tür proteazlar farklı bir aile olarak sınıflandırılırlar [10].

Geniş çaplı çalışılan ilk enzimler serin proteazlar (EC 3.4.21) grubuna dahil olan enzimlerdir. Serin proteazlar aktif bölgelerindeki serin grubu ile karakterize edilirler. Tripsin gibi; bu grup enzimler sindirim enzimleri olarak rol oynar. Öncül proteinlerin proteolitik aktivasyonu için regülatör rol oynaması gibi önemli fonksiyonları da vardır. Regülasyona örnek olarak tripsinojenin enteropeptidazlar ile aktif tripsine dönüşümü verilebilir [46]. Serin proteazlar virüsler, bakteriler ve ökaryotlarda bulunur ve bunların yaşamsal faaliyetleri için büyük önem taşır. Serin proteazlar; endopeptidazlar, ekzopeptidazlar, oligopeptidaz ve omegapeptidaz gruplarında bulunur. Serin proteazların en tipik inhibitörü PMSF’dir (fenilmetilsülfonilflorür). Ancak DFP (di-izopropilflorofosfat), TLCK (tosil-L-lizinkloro metil keton) 3,4-DCI

(3,4-dikloroizokumarin) gibi inhibitörler varlığında da tersinmez olarak inhibisyona uğrarlar. Genelde nötral ve alkalen pH değerlerinde aktiftirler ve pH 7-11 aralığında optimum aktivite gösterirler. Geniş bir substrat özgünlüğüne sahiptirler. Molekül ağılıkları 18-35 kD, izoelektrik noktaları pH 4-7 arasındadır.

Serin alkalen proteazlar serin proteazların en geniş alt grubunu temsil ederler. Yüksek alkalen pH’da aktivite gösterirler. Bakteri, maya, mantar ve küflerden elde edilirler. DFP ya da patates proteaz inhibitörü tarafından inhibe olurken, TPCK (tosil-L-fenilalaninkloro metil keton) ve TLCK tarafından inhibe olmazlar. Substrat özgünlükleri diğer serin proteazlar ile aynıdır. Peptid bağını tirozin, fenilalanin ya da lösinin karbonil karbonu tarafından hidrolizlerler. Molekül ağırlıkları 15-30 kDa olup, izoelektrik noktaları pH 9 civarındadır [10].

Serin proetazların katalitik triadını üç amino asit kalıntısı oluşturur. Serin (nükleofil), aspartat (elektrofil) ve histidin (baz). Bu kalıntıların geometrik oryantasyonu birbirine benzer olsa da proteinlerin katlanmaları birbirinden farklı olduğu için farklı enzimlerde tamamen farklı yerlerde konumlanmışlardır. Bu katalitik triada sahip dört farklı serin proteaz grubu tanımlanmıştır: kimotripsin benzeri proteazlar, subtilisin benzeri proteazlar, karboksipeptidaz Y ve Clp proteaz. Son yıllarda Ser-His-Glu, Ser- Lys-His, His-Ser-His katalitik triadına sahip serin proteazlar da keşfedilmiştir [46- 48].

Kimotripsin benzeri proteazlar 240’ın üzerinde bilinen proteaz sayısı ile doğada en fazla miktarda bulunan serin proteaz sınıfını oluşturmaktadır [47]. Kimotripsin ailesine üye olan proteazlar (tripsin, kimotripsin ve elastaz); her biri altı antiparalel β- zincirinden oluşmuş biribirine dikey iki β-plakasından ve C-terminal α-heliks yapısından oluşmuştur. Katalitik bölge ve substrat bağlama bölgeleri ile enzim substrat etkileşimleri β-plakaları arasında yer almaktadır. Fonksiyonel kalıntılar daha çok β zincirleri ile bağlantılı ilmeklerde (loop) konumlanmışlardır [47,49]. Şekil 2.6’da kimotripsinin sekonder yapılarını gösteren konformasyonel yapısı verilmektedir.

Şekil 2. 6: Kimotripsinin α-heliks ve β- tabakalarını gösteren ikincil yapısı [47]

Kimotripsinin ve kimotripsin benzeri enzimlerin Ser 195, Asp 102 ve His 57’den oluşan katalitik triadı geniş bir hidrojen bağı ağının bir parçasıdır. Şekil 2.7’de katalitik triaddaki hidrojen bağları verilmiştir. A-1, A-2 ve A-3 kimotripsinin katalitik triadını göstermektedir. Katalitik triaddaki hidrojen bağı ağı protein inhibitörü eglin C (A-1), açil enzim ara ürünü (A-2) ve geçiş halinde oluşan trifloroketon kompleksi (A-3) ile gösterilmiştir. Noktalı çizgiler oluşan hidrojen bağlarını göstermektedir. His 57 ve Asp 102 pozisyonundaki hidrojen bağları karboksilat grubunun oluşturduğu hidrojen bağına göre syn oryantasyonunda bulunur ki bu durumda hidrojen bağları daha bazik elektron çiftleri ile oluşur. Hemen hemen tüm kimotripsin benzeri proteazlarda Ser 214 kalıntısının –OH grubu Asp 102 kalıntısının Oδ1 atomu ile hidrojen bağı oluşturur. Literatürde geçen birtakım yayınlarda göz ardı edilse bile Ser 214 kalıntısı katalitik triadın dördüncü elemanı olarak düşünülebilir. Şekil 2. 7 B His 57 kalıntısı üzerindeki yük dağılımında Cε1-H

bağının etkisini göstermektedir. Hidrojen bağı yokluğunda pozitif yük Nδ1 üzerinde yer alacaktır ki bu durumda stabilizasyon Asp 102 tarafından gerçekleştirilmektedir.

Şekil 2.6’da görülen oksianyon çukuru; Gly 193 ve Ser 195 kalıntıları arasında oluşmaktadır. Bu atomlar pozitif yük cebi oluşturarak peptid bağındaki karbonil grubunu aktive ederler ve tetrahedral ara ürününün negatif yüklü oksianyonunu stabilize ederler [47].

Proteazlar peptid bağını hidrolizlerken üç sorunu başarı ile çözebilmektedirler: a) amid nitrojeninin karbonil grubuna elektron transferi ile çok stabil amid bağı oluşmaktadır. Proteazlar genellikle genel asit-baz mekanizması ile peptid bağının rezonans stabilizasyonunu bozarak katalitik etki gösterirler, b) Su zayıf bir nükleofildir, proteazlar genel baz mekanizması ile suyu aktive ederler, c) Aminler zayıf çıkıcı gruplardır, proteazlar amin grubunu yapıdan ayrılmadan önce protonize ederler. Bu üç başlık için proteazlar oldukça başarılı bir performans sergilerler. Serin proteazlar ile peptid bağının hidroliz hızı katalizlenmemiş bir reaksiyonunkinden 1010 kat daha hızlı gerçekleşir. Kataliz mekanizması peptid hidrolizi ile sınırlandırılmamalıdır. Serin proteazlar aynı zamanda anilid, amid, ester ve tiyoester içeren başka bileşikleri de hidrolizleyebilmektedirler. Şekil 2.8 kimotripsin benzeri serin proteazlar için genel kabul edilen mekanizmayı göstermektedir. Reaksiyonun yarı açilasyon kısmında Ser 195; His 57’nin genel baz gibi davranması ve Ser 195’nin nükleofil gücünü arttırmasına yardımcı olması ile birlikte peptid substratının karbonil grubuna saldırır. Oluşan His 57-H+ Asp 102 ile hidrojen bağı oluşturarak stabilize olur. Tetrahedral ara ürünü ile oluşan oksianyon; oksianyon çukurundaki ana zincirin NHS grupları ile etkileşerek stabilize olur. His 57-H+’nın genel asit gibi

davranması sonucu çıkıcı grup yapıdan ayrılır, tetrahedral ara ürünü yıkılır ve açil- enzim ara ürünü oluşur. Bu aşamadan sonraki deaçilasyon yarı reaksiyonu şu şekilde tekrarlanır: His 57’nin yardımı ile su açil enzime saldırır, ikinci tetrahedral ara ürünü oluşur. Oluşan ara ürün Ser 195 ve karboksilik asite yıkılır. Yapı; serbest enzim ve ürün olarak ayrılır. Gerçekleşen reaksiyonda bağların ve yük dağılımlarının değişmesi enzim-substrat etkileşimini güçlendirmektedir [47].

Şekil 2. 8: Serin proteazlar için genel kabul edilen mekanizma [47]

Subtilizin benzeri proteazlar (subtilazlar) büyük ölçüde Bacillus türleri tarafından üretilirler. Birçok Bacillus subtilazının gen yapıları ve dizilimleri ve üç boyutlu yapıları çalışılmış olmasına rağmen hücre dışı subtilisin benzer proteazların fonksiyonel rolü ve biyosentezdeki regülasyon mekanizması ucu açık sorulardandır [50].

Subtilizin benzeri proteazlar ile kimotripsin benzeri proteazların katalitik histidin, serin ve aspartat kalıntılarının düzenlenmesi birbirine çok benzer olmasına rağmen β/β (kimotripsin) α/β (subtilisin) katlanmalarında ciddi farklılıklar bulunmaktadır. Şekil 2.9’da subtilazların katalitik triadları ile ve N-terminal ve C-terminal uçları ile birlikte ikincil yapısının şematik gösterimi verilmiştir. Gösterimde α–heliks yapıları

spiral şekli ile, β–plakaları ise oklar ile gösterilmiştir. Subtilazların büyük bir çoğunluğu pre-pro-enzim olarak sentezlenmektedir. Pro-peptid bağının kırılması ile aktif hale gelmektedirler [51].

Şekil 2. 9: Subtilazların ikincil yapısının şematik gösterimi [51]

Subtilazların katalitik triadını Ser 221 (nükleofil), His 64 (baz), Asp 32 (elektrofil) oluşturmaktadır. Şekil 2.10.A subtilisinin katalitik bölgesinin oligopeptid substratı ile etkileşimini göstermektedir. Kalıntıların birbirine olan mesafesi oksianyon çukurunu oluşturmaktadır. Subtilisindeki oksianyon çukuru enzimin yan zinciri ile oluşmaktadır. Şekil 2.10.B ise serin proteazların Michael Menten kinetik parametreleri ile birlikte genel kinetik kataliz mekanizmasını göstermektedir. Kinetik parametreler farklı proteazlar ve substratlarla farklı değerler almaktadır. Ser 221 ve His 64 kalıntılarının alanin kalıntısı ile değiştirilmesi ile kcat değeri 104–106 kat

azalmaktadır. Her iki kalıntısının aynı anda değişmesi ile görülen 106 kat azalma; iki katalitik üyenin katalizin gerçekleşmesi hususunda birbiri ile ileri derecede işbirliği içinde olduğunu göstermektedir. Her iki komponentin mutasyonu ile aktivitede büyük oranlarda azalma görülmüştür [46].

Şekil 2. 10: Subtilisinin protein hidrolizine ilişkin katalitik ve kinetik etki mekanizması [46]

Aspartil proteazlar (EC 3 4 23) asidik proteazlar olarak da bilinen, endoproteaz ailesine ait, hedef substrattaki spesifik peptid bağını katalizleme yeteneğine sahip proteolitik enzimlerdir [52]. Bitki, bitki virüsleri ve retrovirüslerde bulunurlar. Asidik proteazların doğada bulunabilirliği serin proteazlardan daha azdır. Aspartil proteazlar katalitik bölgesinde bulunan ve katalizi gerçekleştiren iki adet aspartil kalıntısı ile karakterize edilirler. Bu proteazlar katalitik aktivitelerine göre üç alt sınıfa ayrılırlar. Bunlar pepsin (A1), retropepsin (A2) ve pararetrovirüslerden (A3) elde edilen türlerdir [53]. Aspartil proteazlar pH 3–4 civarında aktivite gösterirler. Pepstatin tarafından inhibe olurlar. pH 3–4.5 arasında izoelektrik noktasına sahip olup molekül ağırlıkları 30–45 kDa arasında değişmektedir. Aspartil proteazların proteinleri hidrolizleme mekanizması için genel asit – baz mekanizması önerilmiştir.

Bu mekanizmada su; reaksiyona direk katılmaktadır [10]. Şekil 2.11’de aspartil proteazlar için öngörülen katalitik etki mekanizması verilmiştir.

Şekil 2. 11: Aspartik proteazlar için öngörülen katalitik mekanizma. D, T ve G farklı

pozisyonlarda bulunan aspartat kalıntılarını ifade etmektedir [54]

Sistein proteazlar (EC 3 4 22) prokaryot ve ökaryotlar tarafından üretilirler. Bu tip proteazların yaklaşık 20 alt sınıfı tanımlanmış bulunmaktadır [10]. Sistein proteazların altı ana üyesi papain ailesi, kalpainler, klostripainler, streptococcal sistein proteazlar, viral sistein proteazlar, son zamanlarda tanımlanan kakpasaslar (apopainler) olarak sınıflandırılır [55]. Papain ailesine ait sistein proteazların aktif bölgesi V-şeklinde olup, katalitik diadını Cys ve His kalıntıları oluşturmaktadır. Proteazların aktivitesi; katalitik diadın, Cys-...His+ zwitterion olması ile yürütülür [56]. Papain ailesine ait sistein proteazlar peptid, amid, ester, tiyol ve tioester bağlarını hidrolizler. Mekanizmanın temeli (Şekil 2.12); kovalent bağlı açil-enzim

ara ürünü oluşumu ve nihayetinde aktif bölgedeki tiyol grubunun karbonil karbonuna nükleofilik atağı ile sonlanmasına dayanır. Reaksiyonun ilk adımında serbest enzim ile substrat arasında nonkovalent etkileşimlerle Michael kompleksi oluşur. Enzimin açilasyonu enzimden ilk ürün olarak RıNH2 grubunun ayrılması ile gerçekleşir.

Sonraki adımda açil enzim ara ürünü su molekülü ile etkileşerek ikinci ürünü oluşturur (deaçilasyon basamağı). Bu ürünün ayrılması ile serbest enzimin rejenerasyonu gerçekleşir [55].

Şekil 2. 12: Sistein proteazlar için öngörülen katalitik mekanizma [57]

Sistein proteazların genellikle birkaçı dışında optimum pH’ları nötral pH’dır (lizozomal proteazlar asidik pH’da maksimum aktivite gösterirler). Genellikle sistein ve HCN gibi indirgeyici ajanlar varlığında aktiftirler [10]. Papain benzeri birçok sistein proteazlar molekül ağılığı 20–35 kDa olan bağıl olarak küçük proteinlerdir. Ancak katepsin C oligomerik enzim olup molekül ağılığı 200 kDa’nun üstündedir. Sistein proteazların inhibitörlerinden en iyi karakterize edilenleri papain ailesine ait olanlarıdır. Bu inhibitörler sistatin (cystatin) üst ailesine ait fitositatin (phytocsytatin)

inhibitörlerdir. Sistatin ailesine ait olan inhibitörler papain ailesine ait sistein proteazlarla sıkı ve tersinir bağ yapabilen inhibitörler içerirler [55].

Metaloproteazlar (3 4 24); aktiviteleri için iki değerlikli metal iyonuna gereksinim duyarlar. Yaklaşık 30 sınıfı tanımlanmakla beraber; bunların 17’si yalnızca endopeptidaz, 12’si yalnızca ekzopeptidaz, biri hem endopeptidaz hem de ekzopeptidaz aktivitesi içermektedir. Đşlevlerine göre nötral, alkalen, Myxobacter I ve Myxobacter II olmak üzere dört gruba ayrılırlar Alkalen metaloproteazlar 34–60 kDa molekül ağırlığına sahip olup, pH 7–9 arasında aktiftirler [10]. Metaloproteazların çoğu çinko bağımlı proteinlerdir. Bu tür proteinlerde çinko integral komponent gibi konumlanmıştır. Kristal yapıları bilinen tüm çinko bağlı enzimlerde katalitik çinko atomu üç tane amino asit ve bir tane aktif su molekülüne bağlanır. His, Glu, Asp ya da Cys kalıntıları ile oluşturulan kombinasyon aktif çinko bölgesinde üç çatallı (trident) bir yapı oluşturur ve aktif su molekülü koordinasyon küresini doldurarak tamamlar [58]. Şekil 2.13’te aktif bölgesinde iki tane çinko atomu içeren metaloproteazın katalitik bölge yapısı, şekil 2.14’te metaloproteaz sınıfına dahil termolizinin alternatif reaksiyon mekanizması verilmiştir [59].

Şekil 2. 13: Aeromanas proteoltica amino peptidazının iki tane çinko içeren aktif bölge

Şekil 2. 14: Termolizinin alternatif reaksiyon mekanizması [59]

Metaloproteazların şelat oluşturan ajanlara karşı diyaliz edildiklerinde inaktive olurlar [10]. Metaloproteazlar; dokunun yeniden modellendirilmesi, peptid hormon sinyalinin oluşturulması ve kanser tedavisinde uygulanması gibi fizyolojik ve patolojik proseslerde anahtar rol oynarlar. Bunu yanı sıra in vivo ortamda inaktif zimojenlerin oluşturulması ve endojen proteinlerle inhibisyon gibi çeşitli translasyon sonrası formların oluşumunun regülasyonunda rol alırlar [60].