Organik Çözücü Varlığında ve Yokluğunda Alkalen Proteaz Enziminin Kinetik

3.7.1 Organik çözücü yokluğunda alkalen proteaz enziminin Folin-Ciocalteau reaktifi içeren yöntem ile kinetik parametrelerinin belirlenmesi

Organik çözücü içermeyen ortamda Folin-Ciocalteau reaktifi içeren yöntem ile alkalen proteaz enziminin Km ve Vm değerleri Lineweaver-Burk diyagramları

oluşturularak belirlenmiştir. 50 mM pH 10.5 NaOH-NaCl-glisin tamponunda 0.5, 0.6, 0.75, 1.0, 1.1 ve 1.25 mg/mL kazein hazırlanmıştır. Deney tüplerine 50 µL enzim (enzimin protein ve spesifik aktivite değerleri sırasıyla 0.179 mg/mL ve 5928.86 U/mg) ve 450 µ L 50 mM pH 10.5 NaOH-glisin tamponu tamponu ilave edilmiştir. Hazırlanan reaksiyon ortamı üzerine 2.5 mL hazırlanan kazein çözeltilerinden ilave edilmiştir. Denemede kör olarak hazırlanan deney tüpüne enzim çözeltisi yerine 50 mM pH 10.5 NaOH-glisin tamponu ilave edilmiştir. Her bir konsantrasyon için ayrı kör deneme hazırlanmıştır. Hazırlanan örnekler 30˚C’de 5 dakika süre ile inkübe edilmiştir. Đnkübasyon sonunda örneklere 2.5 mL TCA (0.11 M trikloroasetik asit, 0.22 M sodyum asetat, 0.33 M asetik asit) ilavesi yapılmış ve 30˚C’de 30 dakika boyunca inkübe edilmiştir. Đnkübasyon sonunda reaksiyon karışımı süzülmüş, süzüntüden 0.5 mL alınmış ve bu süzüntünün üzerine 0.5 M 2.5 mL sodyum karbonat çözeltisi ilave edilmiştir. Karışıma saf su ile ½ oranında seyreltilmiş 0.5 mL Folin-Ciocalteau reaktifi ilave edilerek karışım 30 dakika oda sıcaklığında bekletilmiştir. Süre sonunda Biorad Smart Spec 3000 ile 660 nm’de örneklerin absorbansları okunmuştur. (3.1) no’lu eşitlik ile aktivite hesaplanmıştır.

3.7.2 Organik çözücü yokluğunda Folin-Ciocalteau reaktifi içermeyen yöntem ile alkalen proteazın enziminin kinetik parametrelerinin belirlenmesi

Organik çözücü içermeyen ortamda Folin-Ciocalteau reaktifi içermeyen yöntem ile alkalen proteaz enziminin Km ve Vm değerleri Lineweaver-Burk diyagramları

oluşturularak belirlenmiştir. 50 mM pH 10.5 NaOH-NaCl-glisin tamponunda 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5 mg/mL kazein hazırlanmıştır. Deney tüplerine 50 µ L enzim (enzimin protein ve spesifik aktivite değerleri sırasıyla 0.154 mg/mL ve 4851 U/mg) ve 450 µ L 50 mM pH 10.5 NaOH-glisin tamponu tamponu ilave edilmiştir. Hazırlanan reaksiyon ortamı üzerine 2.5 mL hazırlanan kazein çözeltilerinden ilave edilmiştir. Denemede kör olarak hazırlanan deney tüpüne enzim çözeltisi yerine 50 mM pH 10.5 NaOH-glisin tamponu ilave edilmiştir. Her bir konsantrasyon için ayrı kör deneme hazırlanmıştır. Hazırlanan örnekler 30˚C’de 5 dakika süre ile inkübe edilmiştir. Đnkübasyon sonunda örneklere 2.5 mL TCA (0.11 M trikloroasetik asit, 0.22 M sodyum asetat, 0.33 M asetik asit) ilavesi yapılmış ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletilmiştir. Süre sonunda reaksiyon karışımı süzülmüş, süzüntülerin absorbansı; Biorad Smart Spec 3000 ile 280 nm’de okunmuştur. (3.2) no’lu eşitlik ile aktivite hesaplanmıştır.

3.7.3 Organik çözücü varlığında Folin-Ciocalteau reaktifi içeren yöntem ile alkalen proteazın enziminin kinetik parametrelerinin belirlenmesi

Organik çözücü varlığında enzimin Km ve Vm belirlenmesi organik çözücü

yokluğunda Km ve Vm belirlenmesine benzer şekilde yapılmıştır. Çalışılan

konsantrasyondaki organik çözücü seyreltmesi 50 mM pH 10.5 NaOH-NaCl-glisin- tamponunda yapılarak, çalışılan organik çözücü konsantrasyonlarını içerecek şekilde 0.5, 0.6, 0.75, 1.0, 1.1 ve 1.25 mg/mL kazein hazırlanmıştır. Deney tüplerine 50 µL enzim (etanol varlığında enzimin protein ve spesifik aktivite değerleri sırasıyla 0.176 mg/mL ve 5928.86 U/mg, metanol varlığında 0.168 mg/mL ve 2475.25 U/mg, n- propanol ve i-propanol varlığında protein 0.293 mg/mL ve 1710 U/mg olarak belirlenmiştir) ve 450 µ L çalışılan konsantrasyondaki organik çözücü seyreltmesi 50 mM pH 10.5 NaOH-glisin ile yapılan tampon çözelti ilave edilmiştir. Hazırlanan

reaksiyon ortamı üzerine 2.5 mL hazırlanan kazein çözeltilerinden ilave edilmiştir. Denemede kör olarak hazırlanan deney tüpüne enzim çözeltisi yerine 50 mM pH 10.5 NaOH-glisin tamponu ilave edilmiştir. Her bir konsantrasyon için ayrı kör deneme hazırlanmıştır. Hazırlanan örnekler su banyosunda 30˚C’de 5 dakika süre ile inkübe edilmiştir. Đnkübasyon sonunda örneklere 2.5 mL TCA (0.11 M trikloroasetik asit, 0.22 M sodyum asetat, 0.33 M asetik asit) ilavesi yapılmış ve 30˚C’de 30 dakika boyunca inkübe edilmiştir. Đnkübasyon sonunda reaksiyon karışımı süzülmüş, süzüntüden 0.5 mL alınmış ve bu süzüntünün üzerine 0.5 M 2.5 mL sodyum karbonat çözeltisi ilave edilmiştir. Karışıma saf su ile ½ oranında seyreltilmiş 0.5 mL Folin-Ciocalteau reaktifi ilave edilerek karışım 30 dakika oda sıcaklığında bekletilmiştir. Süre sonunda Biorad Smart Spec 3000 ile 660 nm’de örneklerin absorbansları okunmuş, (3.1) eşitliği ile aktivite hesabı yapılmıştır.

3.7.4 Organik çözücü varlığında Folin-Ciocalteau reaktifi içermeyen yöntem ile alkalen proteazın enziminin kinetik parametrelerinin belirlenmesi

1,4-dioksan, N,N-DMF, ve DMSO varlığında (N,N-Dimetilformamid, 1,4-Dioksan, DMSO (inhibisyon kinetiği için) varlığında enzimin protein konsantrasyonu spesifik aktivite değerleri sırasıyla; 0.154 mg/mLve 4851 U/mg, asetonitril ve DMSO (aktivasyon kinetiği için); 0.122 mg/mL ve 4464 U/mg olarak belirlenmiştir) Km ve

Vm belirlemesi bölüm 3.4.2.1.’de belirtildiği gibi yapılmıştır. 50 µL enzim çözeltisi

üzerine çalışılan konsantrasyonda organik çözücü içeren 450 µ L NaOH-glisin tamponuna (pH 10.5, 50 mM) ilave edilmiştir. Hazırlanan reaksiyon ortamı üzerine çalışılan organik çözücü konsantrasyonuna sahip 450 µ L NaOH-NaCl-glisin tamponunda (pH 10.5, 50 mM) hazırlanmış 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6 mg/mL’lik kazein çözeltisi ilave edilmiştir. Karışım; su banyosunda 30˚C’de 5 dakika süre ile inkübe edilmiştir. Đnkübasyon sonunda örneklere 2.5 mL TCA (0.11 M trikloroasetik asit, 0.22 M sodyum asetat, 0.33 M asetik asit) ilavesi yapılmış ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletilmiştir. Süre sonunda örneklerin Biorad Smart Spec 3000 ile 280 nm’deki absorbansları okunmuş, (3.2) eşitliği ile aktivite hesaplanmıştır.

Organik çözücüler varlığında ve yokluğundaki Km ve Vm değerlerinin

belirlenebilmesi için başlangıç hızı resiprokalinin substrat konsantrasyonu resiprokal değerine karşı grafiğinin çizilmesi gerekmektedir. Bu amaçla hesaplanan aktivite değerlerinin resiprokal değerlerinin (1/v) substrat konsantrasyonunun resiprokal değerlerine (1/[S]) karşı çizilen Lineweaver–Burk grafiğinden elde edilen doğruların eğiminden Km/Vm interseptinden 1/Vm bulunarak kinetik parametreler olan Km ve Vm

değerleri hesaplanmış, tersinir inhibisyonların türleri belirlenmiştir.

3.8 Alkalen Proteaz Enziminin Organik Çözücü Varlığında ve Yokluğunda