Kaynağına göre proteazlar

Proteazların canlı organizmalarda fizyolojik olarak bulunma zorunlulukları vardır. Bu nedenle proteaz kaynakları bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal olarak geniş bir yelpazeye yayılmışlardır.

Bitkisel kaynaklı proteazlardan en yaygın olarak bilinenleri papain, bromolein ve keratinazdır. Papain Afrika ve Hindistan’da yetişen Carica papaya meyvesinden izole edilmiştir. Üç tane disülfit köprüsü ile stabilize olmuş 212 adet amino asitten oluşmuştur. Katalitik triadını sistein 25, histidin 159, asparajin 158 oluşturmaktadır. Molekül ağılığı 23 kDa’dur. pH 5-9 arasında aktiftir, 80-90 ˚C sıcaklıkta kararlılığını koruyabilmektedir. Endüstride hayvan derisinin işlenmesi, meşrubatların berraklaştırılması, sindirim amaçlı ilaç üretimi, yüksek çözünürlüğe sahip protein hidrolizatlarının oluşumu ve acılığın giderilmesi gibi yaygın kullanım alanı olması ile birlikte en çok et endüstrisinde etin yumuşatılmasında kullanılmaktadır [4,10,26- 28].

Bromolein, ananas bitkisinden (Ananas comosus) elde edilen sülfidril içeren proteolitik enzimlere verilen genel bir addır. Bromolein; ananas suyundan elde edilir. Sistein proteaz olarak da karakterize edilebilir. pH 5-9 arasında stabildir ancak 70 ˚C sıcaklıkta inaktive olur. Bromoleinin primer bileşeni bir sülfidril proteolitik fraksiyonudur. Bromolein ayrıca, peroksidaz, asit fosfataz, çeşitli proteaz inhibitörleri ve organik bağlı kalsiyumu da içerir. Bromolein vücuttaki proteinleri degrade eden bir enzimdir. Dolayısıyla onun ilk fark edilen özelliği sindirimi kolaylaştıran bir madde olmasıdır. Bu yüzden gıda sanayisinde et yumuşatıcı olarak kullanılmaktadır. Bu enzim sadece mide asidine yardımcı olmakla kalmayıp, aynı zamanda bağırsaklardaki alkalen ortama da olumlu tesirler yapmaktadır. Bu nedenle sindirim sistemi enzimlerinden pepsin ve tripsin gibi düşünülür. Bromolein kullanımı sadece sindirim sistemini desteklemekle sınırlı değildir. Đltihap giderici etkisi sayesinde romatoid artrit ve sinüzit tedavisinde yardımcı olduğu da klinik çalışmalarla kanıtlanmıştır. Bromolein, aşırı trombosit yapışkanlığını önlediği için doğal bir kan incelticidir [4,10,29-31].

Bitkisel kaynaklı bir diğer proteaz kıl ve tüy yıkımını sağlayan keratinazdır. Bu tür protein yapılarının yıkımı ve sindirimi lizin gibi zaruri (essential) amino asitlerin sentezi ve atık su sistemlerinde bulunan doğal atıkların parçalanması için önemlidir. Keratin hidrolizatlarından sistein eldesi de önem taşımaktadır. Kozmetik endüstrisinde çözünmüş keratin ürünleri kullanılmaktadır. Keratin yapısal yoğunluğundan ve içerdiği çok sayıdaki disülfid bağlarından dolayı enzim ile muamele edilmeden önce öğütülmeli ve sodyum disülfid, sodyum hiposülfid tiyoglikolik asit ya da merkaptoetanol gibi indirgen ajanlar ile ön işleme tutulmalıdır. Disülfid köprülerinin redüklenmesinden sonra keratin keratinaz varlığında hidrolizlenmektedir [3,10].

Hayvansal kaynaklı protein hidrolizleyen enzimler enzimolojinin başlangıcından beri bilinmekte ve kullanılmaktadır. Hayvansal kaynaklı proteazlardan en bilinenler pankreatik tripsin, kimotripsin, pepsin ve rennindir. Tablo 2.4’te bu enzimlerin özgünlük gösterdiği peptid bağları gösterilmiştir. Bu enzimler oldukça fazla hacimlerde saflaştırılabilirler. Ancak üretimleri hayvansal kaynaklara ve ülke politikalarına bağlıdır. Hayvansal kaynaklı proteazlar gıda endüstrisinde protein

hidrolizatlarının üretiminde, et ve balık ürünlerinin işlenmesinde kullanılmaktadırlar. Pankreatik proteazların büyük bir çoğunluğu deri endüstrisinde kullanılmaktadır. Đlaç endüstrisinde sindirim amaçlı ilaçların üretiminde kullanılmaktadırlar [3,10].

Tablo 2. 4: Hayvansal proteazların özgünlüğü [10]

Enzim Spesifik olduğu bağ

Tripsin -Lys (ya da Arg)----

Kimotripsin, subtilisin -Trp (ya da Try, Phe, Leu)----

Pepsin -Phe(ya da Tyr, Leu) – Trp (ya da Phe,Tyr)

Termolizin ----Leu (ya da Phe)

Rennin -Phe – Met-

Tripsin (EC 3.4.21.4) molekül ağırlığı 23.3 kDa olan ve gıda proteinlerinin sindirimi için kullanılan pankreas kaynaklı, ince bağırsakta proteinleri parçalayan; temel hayvansal proteazdır. Katalitik triadını serin, histidin ve aspartat oluşturur. Bu yüzden serin proteaz sınıfına dahildir. Optimum pH’sı 8 ve optimum sıcaklığı da 37 ˚C’dir. Tripsin istenmeyen hücresel protein yıkımını önlemek için pankreastan ince bağırsağa inaktif zimojen (tripsinojen) olarak salgılanır ve orada enterokinaz proteazları ile aktif formunu oluşturur. Oluşan aktif form lizin ve arjinin kalıntıları tarafından oluşturulan peptid bağlarına karşı özgünlük gösterir. Pankreatik tripsinojen katyonik (tripsinojen-1), anyonik (tripsinojen-2) ve mezotripsinojen (tripsinojen-3) olmak üzere 3 izoyapıdan oluşur. Katyonik ve anyonik tripsinler sindirim amaçlı protein yıkım enzimlerinin ana izo yapılarıdır ve 2:1 oranında salgılanırken mezo yapısı % 5 oranında salgılanır. Mezotripsin ise; tripsin inhibitörlerine karşı direnç gösteren özelleştirilmiş proteazdır. Tripsin inhibitörlerinin yıkımında özel rol oynamaktadır.

Tripsin pankreastan çok miktarlarda izole edilebilmektedir ve biyoteknolojik proseslerde geniş yelpazede kullanım alanı bulunmaktadır. Süt tozu solüsyonuna tripsin ilave edildiğinde kazeinin hidrolizlenmesini sağlar. Bebek gıdalarında ön hidroliz işleminde kullanılmaktadır. Böylelikle protein molekülleri arasındaki bağları kırarak bebekler için sindirim işlemini kolaylaştırmaktadır [4,10,32-35]. Tripsinin

katalitik bölgesindeki amino asitler ile üç boyutlu konformasyonel yapısı şekil 2.2’de gösterilmiştir.

Şekil 2. 2: Aktif bölgesindeki amino asit kalıntıları siyah çizgiler ile gösterilmiş tripsinin üç

boyutlu konformasyonel yapısı [35]

Kimotripsin (EC 3.4.21.1) 23.8 kDa molekül ağırlığına sahiptir, hayvansal pankreatik özütlerinde bulunur. Pankreatik özüt zimojen kimotripsinojenin eşit miktarda iki formunu içermektedir. Molekül ağırlığı 25 kDa, izoelektrik noktası 9.1 olan kimotripsinojen A ve izoelektrik noktası 5.2 olan kimotripsinojen B (E.C.3.4.4.6). Her iki zimojen de toplam pankreatik ekstraktlarının %32’sini oluşturmaktadır. Tripsine benzer olarak ilk etapta inaktif formda sentezlenen kimotripsinojen; tripsin ile birkaç adımlı proses ile aktif formu kimotripsine dönüşür. Kimotripsinin optimum pH’sı 8-9; optimum sıcaklığı 40-45 ˚C’dir. Kimotripsinin substratları triptofan, tirozin ve fenil alanin gibi aromatik amino asitlerin yaptığı

peptid bağlarını içerir. Ancak lösin, metiyonin, asparajin ve glutamin gibi kalıntıların oluşturduğu peptid bağlarını da hidrolizleyebilmektedir. Kimotripsinin katalitik triadını serin 195, histidin 57 ve aspartat 102 kalıntıları oluşturmaktadır. Şekil 2.3’de kimotripsinin katalitik triadı ile birlikte üç boyutlu yapısı verilmiştir. Kataliz; güçlü nükleofil olan serin 195 kalıntısı ile gerçekleşmektedir [4,10,36,37,38].

Şekil 2. 3: Kimotripsinin üç boyutlu yapısı ve serin 195, histidin 57, aspartat 102’den oluşan

katalitik triadı [37]

Enzim substrat ara ürününün oluşumunu histidin 57 ve aspartat 102 kalıntıları desteklemektedir. Şekil 2.4’de α-kimotripsinin peptid bağ degradasyonunu gösteren mekanizma verilmiştir. Asidik ortamda kimotripsinin kararlılığı tripsinden daha düşüktür. Saf kimotripsin pahalı bir enzimdir ve sadece diagnostik ve analitik amaçlı kullanılır. Sık kullanılan bir diğer alanı da süt protein hidrolizatlarının allerjenliğinin

giderilmesidir. Ağır metaller, polifosfatlar, güçlü oksidasyon ajanları ve PMSF (para fenil metil sülfonil florür) inhibitörleri arasında yer almaktadır [10,38].

Şekil 2. 4: α-kimotripsinin peptid bağı hidrolizini gösteren mekanizma [38]

Pepsin (3.4.23.1) tüm omurgalı hayvanların midesinde bulunan 34.5 kDa molekül ağırlığına sahip asidik proteazdır. Pepsin gastrik mukoz membran tarafından nonaktif proenzim olan pepsinojen (molekül ağırlığı 41 kDa) olarak salgılanmaktadır. Pepsinojen; mide asitleri (HCl) ile aktif proteaz yapısına dönmektedir. Bu otokatalitik dönüşüm pH 6 civarında gerçekleşip, maksimum dönüşüm hızına pH 2 civarında ulaşmaktadır. Alkalen pH’larda pepsinojen kararlılığını koruyabilirken pepsin hızla inaktif olmaktadır. Pepsinin izoelektrik noktası 1’dir. Ancak 1.7-3.0 değerlerine de rastlanmaktadır. Polipepdid zinciri 321 adet amino asit içermektedir. Aktif bölgesinde katalizden sorumlu iki adet aspartil kalıntısı bulunmaktadır ve aspartil proteaz sınıfına dahildir. Şekil 2.5’te pepsinin üç boyulu yapısı ve aktif bölgesinde bulunan amino asitlerin konumlanması verilmiştir [44]. pH 1.0-2.5 aralığında keratinin de dahil oluğu pek çok protein yapısını hidrolizleyebilmektedir. Gliserol içerisinde oldukça stabil iken; pH 5-5.5 civarındaki sulu çözeltilerde de kararlılığını koruyabilmektedir. Ancak alkalen pH’larda tersinmez olarak inaktive olmaktadır. Aromatik amino asitlere özgünlük gösterir. Fakat glutamik asit, sistein, sistin peptidlerini de hidrolizleyebilmektedir. Endüstride sindirim amaçlı ilaçların

sentezinde protein hidrolizatlarının oluşumunda ve kimosin ve rennin varlığında biranın stabilize edilmesinde kullanılmaktadır [4,10,39,40,41].

Şekil 2. 5: Pepsinin üç boyulu yapısı ve aktif merkezinde bulunan amino asitlerin konumu

[41]

Rennin (rennet, lösin amidopeptidaz ya da kimozin) (EC 3.4.23.4) mide hücrelerinden salgılanan proteolitik (protein sindirici) bir enzimdir. Bebeklerin ve yavru hayvanların midelerinden salgılanan bu enzimin rolü, süt kazeinini para-kazein haline çevirerek pıhtılaşmasını sağlamaktır. Doğumu izleyen ilk birkaç gün içinde en yüksek seviyede olan rennin salgısı, zamanla azalarak, sütün pıhtılaştırılması görevini pepsin enzimine devretmekte, bir süre sonra da yerini tamamen pepsine bırakmaktadır [42]. Rennin pepsin benzeri proteazdır. Memeli hayvanların midesinden ilk çıkış şekli inaktif formu prorennin şeklindedir. Sonrasında pepsin tarafından ya da kendiliğinden otokatalitik olarak molekül ağırlığı 30.7 kDa olan aktif rennin formuna dönüşmektedir [10]. Rennin fenilalanin ve metiyonin arasındaki peptid bağına özgünlük gösterir. Bu reaksiyon süte uygulandığında kazeinin hidrofobik (para kazein) ve hidrofilik (asidik glikopeptid) grupları arasındaki bağı sağlayan fenilalanin ve metiyonin bağı kırılır. Ürün olarak çözünmeyen para kazein ve C-terminal glikopeptid oluşur. Bu reaksiyonu ile rennin süt endüstrisinde ve peynir üretiminde kullanılır [10,43].

Proteaz kaynaklarının üçüncü grubunu mikrobiyal proteazlar oluşturmaktadır. Bitkisel ve hayvansal kaynaklı proteaz eldesinde karşılaşılan uygun iklim koşullarının sağlanması ve ülkelerin hayvancılık ile ilgili politikalarına bağımlılığı gibi dezavantajlar mikrobiyal kaynaklı proteaz eldesine ilgiyi arttırmıştır. Dünya çapındaki enzim satışının yaklaşık %40’ını mikrobiyal proteazlar sağlamaktadır. Bu

enzimler deterjan, gıda, ilaç, deri, atıkların geri kazanımı ve gümüş geri dönüşümü gibi alanlarda kullanılmaktadır. Mikrobiyal kaynaklı proteazlar sahip oldukları karakteristik özelliklerinden dolayı biyoteknolojik uygulamalarda bitkisel ve hayvansal kaynaklı proteazlara tercih edilmektedirler. Mikrobiyal proteazlar; bakteriyel, fungal ve viral proteazlar olarak üç grupta incelenebilirler [10,11].

Bakteriyel proteazlar ticari olarak en çok kullanılan proteaz sınıfını oluşturmaktadır. Bacillus cinsine ait organizmalar tarafından üretilirler. Bakteriyel nötral proteazlar pH 5-8 gibi dar bir aralıkta aktiftirler ve termotoleransları düşüktür. Reaksiyonlarındaki ara ürünlerinden dolayı gıda protein hidrolizatları hayvansal proteazlarınkine oranla daha az acıdır. Bu yüzden gıda endüstrisinde kullanım alanları oldukça geniştir. Nötraz yani nötral proteaz doğal proteinaz inhibitörlerine karşı hassas değildir. Bu yüzden bira endüstrisi için oldukça kullanışlıdır. Bakteriyel nötral proteazlar hidrofobik amino asit çiftlerine karşı yüksek afiniteleri ile karakterize edilirler. Düşük termotoleransları düşük dereceli hidroliz ile gıda hidrolizatlarının oluşturulmasında reaktivitelerinin kontrolü için avantaj sayılabilir. Bazı nötral proteazlar aktivite gösterebilmeleri için divalent metal iyonuna ihtiyaç duyarken; serin proteazlar şelatlayıcı ajanlardan etkilenmemektedirler. Bakteriyel alkalen proteazlar pH 10 gibi yüksek pH’larda gösterdikleri aktiviteleri ile karakterize edilirler. Optimal sıcaklıkları 60 oC civarındadır. Bu özellikleri bakteriyel alkalen proteazları deterjan endüstrisi için oldukça çekici kılmaktadır [10].

Fungal proteazlar bakteriyel proteazlardan daha karmaşık proteaz üreten enzimlerdir. Örneğin Aspergillus oryzae asidik, nötral ve alkalen proteaz üretir. Asidik proteazla daha çok fungal kaynaklıdır [44]. Fungal proteazlar pH 4-10 gibi geniş bir spektrumda aktiftir ve geniş bir substrat özgünlüğü sergilemektedir. Ancak sıcaklığa karşı toleransları bakteriyel enzimlerden daha düşüktür. Fungal enzimler katı hal fermentasyon prosesi ile üretilirler. Fungal asidik proteazların optimum pH’sı 4-4.5 arasında olup; pH 2.5-6 arasında kararlılığını koruyabilmektedir. Özellikle dar pH ve sıcaklık özgünlüklerinden dolayı peynir üretiminde kullanışlıdır. Fungal nötral proteazlar pH 7’de aktif olan metaloproteazlar olduklarından şelatlayıcı ajanlar varlığında inhibe olurlar. Bu enzimler protein hidrolizatlarının acılığının

giderilmesinde kullanılırlar. Fungal alkalen proteaz aynı zamanda gıda protein modifikasyonunda da kullanılabilir [10].

Viral proteazlar AIDS ve kanser gibi ölümcül hastalıklara yol açan virüs proteinlerinin üzerindeki etkilerinden dolayı önem taşımaktadırlar. Çeşitli virüslerde serin, aspartik ve sistein peptidazlar bulunmaktadır. Tüm bu virütik peptidazlar endopeptidazdırlar, metaloproteaz değildirler. Araştırmalar daha çok viral proteazların üç boyutlu yapıları ve sentetik inhibitörleri ile etkileşimleri üzerine odaklanmıştır [10,45].

Proteazlar doğada geniş bir yelpazede bulunmalarına rağmen mikrobiyal kaynaklı olanlar mikroorganizmaların hızlı üremelerinden, kültivasyon ortamları için ortam koşullarının kontrol edilebilmesinden ve genetik olarak manipüle edilebilirliğinden dolayı enzim üretiminde daha yoğun kullanılmaktadırlar.