Paris Komünü ve Proletarya Diktatörlüğü

Os testes farmacológicos conduzidos foram o teste de miotoxicidade e o edematogênico como descrito na sessão dos materiais e métodos. A Figura 20 mostra o teste edematogênico realizados com os PS da B. occidentalis, o grupo controle, sPLA2 nativa e o produto da incubação da sPLA2:PSBo. Nesta figura, observamos que o ponto máximo da inflamação é com a sPLA2 nativa ao 30 minutos após a injeção, passando a decair ao longo do tempo, porém, até 360 minutos a inflamação ainda não tinha voltado aos níveis iniciais. Quando a sPLA2 é incubada com o PS, o efeito inflamatório da sPLA2 diminui de 0.32 ± 0,018 mL (n=5, * p<0.05) para 0.026 ± 0.012 mL (n=5, * p<0.05),

sendo que ao 30 minutos, onde a inflamação foi maior com sPLA2 nativa, o produto sPLA2:PSBo inibiu significativamente a sPLA2.

Figura 20. Teste edematogênico de sPLA2, sPLA2: BoSP, BoSP e o grupo controle

tratado com solução salina. O edema causado pelos compostos é expresso em volume (mL) subtraído do volume inicial. As barras verticais mostram o DP da média ponderada dos quatro experimentos comparado com o controle (n=4, * P ≤ 0.05).

A Figura 21 mostra os resultados para o teste de miotoxidade realizado para os quatro grupos estudados, isto é, salina, sPLA2, sPLA2:PSBo, PSBo. Para a sPLA2 nativa observamos elevada quantidade de CK contida no plasma sanguíneo (268.6 ± 56 U/L), mas a incubação do açúcar com a proteína apresentou níveis de CK semelhantes àquele observado no grupo controle onde foi administrado salina estéril. O grupo onde se administrou apenas PS apresentou alguma liberação de CK, mas não foi significativo estatisticamente, sendo assim, a interação molecular foi suficiente para modular a sPLA2 e modificar seu efeito tóxico sobre o musculo.

Figura 21. Efeito miotóxico de sPLA2, sPLA2:BoSP, BoSP e salina, expresso em níveis

de Creatina Kinase (CK). As barras verticais mostram o DP da média ponderada dos experimentos comparados com o grupo controle (n=5, * P ≤ 0.05).

Alguns estudos tem mostrado que os açucares das algas podem ser tanto pró como anti-inflamatórios. Um exemplo disto é a macroalga Solieria filiforms que apresentou PS com a propriedade de reduzir o edema induzido pela carragenana e o dextran (RODRIGUES et al., 2009). Além disso, a macroalga Ulva rígida mostrou atividade imunomudulatória que resulta na diminuição da secreção de mediadores pró-inflamatórios. No entanto, outros experimentos usando sulucoidan e fucanas sulfatadas (galactofucanas) extraídas de Lobophora variegata mostrou atividade anti-inflamatória porque seu PS inibiu a migração de leucotrienos até o sitio de inflamação (RODRIGUES et al., 2009).

Os resultados farmacológicos apresentados para o PSBo e também aqueles obtidos através dos testes enzimáticos podem ser explicado pelo da sPLA2 apresentar sítios ativos distintos, ou seja, o sitio farmacológico responsável pelos testes edematogenicos e miotóxicos é distinto do sítio catalítico da enzima, permitindo que a sPLA2 se ligar especificamente à proteínas solúveis ou proteínas de membrana que participam do mecanismo de ação, no entanto, isto não é um caso isolado, uma vez que este comportamento também é observado em sPLA2 de diferentes fontes (LAMBEAU et al., 2008). Alguns estudos sugerem que a região N-terminal e a superfície da alça de Cálcio da sPLA2 parecem ser crucial para a interação da sPLA2 com o receptor alvo das células, principalmente as células de mamíferos (OLIVEIRA et al., 2008; TOYAMA et al., 2010; TOYAMA et al., 2011; XIMENES et al., 2012). Uma vez que o PSBo aboliu a atividade enzimática da sPLA2, a presença de um sitio farmacológico responsável pela interação com a sPLA2 com receptores celulares parece plausível.

Fosfolipase básica de veneno de serpente promove um mecanismo comum para mionecrose. Inicialmente, a ligação desta proteína nas membranas das células musculares causa uma perturbação na membrana plasmática que promove uma elevação na concentração de Ca2+ citosólico levando à degeneração das células musculares e das junções neuromusculares (MONTECUCCO et al., 2008). Nossos resultados claramente mostram que PSBo aboliram a mionecrose induzida pela enzima e, uma vez que o açúcar aboliu a atividade catalítica da sPLA2, nossos resultados sugerem que o efeito do edema ocorreu através da interação do açúcar com o sitio farmacológico da sPLA2.

Os testes edematogênico e miotóxico também foram conduzidos para a C.

isthmocladum como apresentado na Figura 22 e 23, respectivamente. A Figura 22 mostra o

aumento no volume da pata do camundongo ao ser injetada sPLA2, o que configura inflamação causado por esta, além disso, observa-se também a diminuição do edema, ou seja, a inflamação, quando o produto da incubação entre sPLA2 e PSCi é aplicado. Observa-se o pico de inflamação entre quinze e trinta minutos após a aplicação para sPLA2 e observamos a diminuição no nível de inflamação logo em quinze minutos. Sabe-se que a sPLA2 interage com células através de receptores e esta interação envolve formação de pontes de hidrogênio, bem como interações hidrofóbicas e eletrostáticas entre a enzima e o receptor (LAMBEAU et al., 2008). Possivelmente, o PSCi impediu a interação entre a sPLA2 e o receptor e, consequentemente, diminuiu o potencial farmacológico da sPLA2.

Figura 22. Teste edematogênico de sPLA2, sPLA2:PSCi, PSCi e o grupo controle tratado

com solução salina. O edema causado pelos compostos é expresso em volume (mL) subtraído do volume inicial. As barras verticais mostram o DP da média ponderada dos quatro experimentos comparado com o controle (n=4, * P ≤ 0.05).

A circulação sistêmica da sPLA2, especialmente aquelas isoformas de baixa massa molecular é associada com a atividade inapropriada do sistema imune inato e mudanças subsequentes podem levar à desordens inflamatórias. Estudos experimentais sugerem que o aumento no nível de determinadas sPLA2 na circulação podem contribuir para a destruição tecidual como aquelas que ocorrem depois de um trauma cardíaco, doença pulmonar, infecções locais ou sistêmicas e desordens autoimunes (TOYAMA et al., 2010). Além disso, a ação das sPLA2 também modulam a atividade citosólicas e, desta forma, regulam a produção de lipídeos mediadores envolvidos na morte celular (SALGADO et al., 2007). Para o teste de CK, os níveis de sPLA2 foram elevados, mas já para sPLA2:PSCi os valores foram semelhantes aos da salina, como mostrado na Figura 23, indicando que a interação entre os compostos leva à inibição da atividade característica da sPLA2 em destruir as células musculares.

Figura 23. Efeito miotóxico de sPLA2, sPLA2:PSCi, PSCi e salina, expresso em níveis de

Creatina Kinase (CK). As barras verticais mostram o DP da média ponderada dos experimentos comparados com o grupo controle (n=5, * P ≤ 0.05).

Nosso estudo com edema de pata também foi conduzido para a macroalga C.

racemosa, no entanto, diferentemente das demais macroalgas, o PSCr aumentou o edema

induzido pela sPLA2 (Figura 24A). A enzima nativa induziu um edema de 0.260 ± 0.03 mL nos primeiros quinze minutos de experimento e a amostra de sPLA2:PSCr foi capaz de aumentar o edema para 0.317± 0.02 mL. Não se pode afirmar que o ápice da atividade inflamatória de sPLA2 nativa foi menor que sPLA2:PSCr, em termos estatísticos, não são significativos, no entanto, ao analisarmos todo o processo inflamatório observamos que o produto da incubação dos dois compostos induziu aumento da inflamação. No entanto, acredita-se que o responsável pela atividade inflamatória inicial tenha sido a sPLA2 que se liga diretamente aos receptores. A indução do edema pela sPLA2 depende não somente da atividade enzimática da sPLA2 mas também de regiões da sPLA2 próxima do loop de ligação do Cálcio (OLIVEIRA et al., 2008; TOYAMA el tal., 2011). De acordo com alguns estudos, a região N-terminal das sPLA2 é essencial para atividade enzimática e está envolvida no reconhecimento de fosfolipideos de membrana contido nas células (ALI et al., 1999). Devido ao PSCr ser capaz de aumentar a atividade enzimática da sPLA2, o açúcar pode estar também envolvido na modulação dos alvos celulares para sPLA2. O aumento da atividade enzimática da sPLA2 induzido por PSCr pode estar envolvido no aumento do edema de pata observado ao final do período de tempo do experimento , de 60 a 360 minutos.

O teste para CK mostraram inibição da sPLA2 pelo PSCr como indica a Figura 24B. O teste mostra que o produto da incubação entre os dois compostos resultou à baixos níveis de CK no sangue, indicando que a sPLA2 não conseguiu agir localmente nem sistemicamente na musculatura, provavelmente devido à interação entre as cargas positivas e negativas da sPLA2 e do PSCr, respectivamente. O efeito miotóxico das PLA2 Lys-49 é exercido no local da injeção, diferentemente, a ação sistêmica de outros tipos de miotoxinas, tais como PLA2 e complexos de PLA2 de elapide e viperide. O efeito miotóxico induzido por sPLA2 derivada de veneno envolve a presença de resíduos de aminoácidos que causam a mionecrose e a desestabilização das células musculares (RIGDEN et al., 2003; DOS SANTOS et al., 2008). Os resultados cromatográficos observados mostraram que a sPLA2 pode formar um complexo relativamente estável com o PS o suficiente para observarmos mudanças nos efeitos enzimáticos e farmacológicos da sPLA2. Tal estabilidade pode ter ocorrido através da interação entre os grupos ácidos do PSCr, PSCi e PSBo e os resíduos básicos das sPLA2. Com bases nestes resultados,

mostramos o potencial terapêutico do polissacarídeo sulfatado das macroalgas marinhas em situações inflamatórias causadas principalmente pela PLA2.

Figura 24. A) Teste edematogênico de sPLA2, sPLA2:PSCr, PSCr e o grupo controle

tratado com solução salina. O edema causado pelos compostos é expresso em volume (mL) subtraído do volume inicial. As barras verticais mostram o DP da média ponderada dos quatro experimentos comparado com o controle (n=4, * P ≤ 0.05). B) Efeito miotóxico de sPLA2, sPLA2:PSCr, PSCr e salina, expresso em níveis de Creatina Kinase (CK). As barras verticais mostram o DP da média ponderada dos experimentos comparados com o grupo controle (n=5, * P ≤ 0.05).